硫酸改性后的聚醚醚酮對(duì)小鼠骨髓巨噬細(xì)胞生存活性的影響

楊妍 吳高義 王菁 朱國(guó)雄

目前，口腔種植材料多選擇鈦、鈦合金等，其具有良好的生物相容性和較高的機(jī)械強(qiáng)度[1]。但金屬的彈性模量遠(yuǎn)高于人體骨組織，種植體植入骨內(nèi)后產(chǎn)生“應(yīng)力屏障”效應(yīng)[2]。此外，金屬材料還具有潛在的離子釋放效應(yīng)。釋放的金屬離子可加重種植位點(diǎn)的局部炎癥，影響組織形成骨結(jié)合[3]。

近期研究發(fā)現(xiàn)線(xiàn)性芳香族、半結(jié)晶高分子聚合物聚醚醚酮(polyetheretherketone, PEEK)，成為較金屬更優(yōu)秀的種植材料。PEEK是一種熱塑性聚合物，耐腐蝕、耐高溫，彈性模量為3～4 GPa，比起鈦合金更接近皮質(zhì)骨(18 GPa)，并且有較好的生物相容性[4]。此外，PEEK還在接受CT、MRI掃描時(shí)不出現(xiàn)偽影，較容易監(jiān)控骨生長(zhǎng)及愈合過(guò)程。但它較差的骨傳導(dǎo)和疏水性對(duì)臨床上廣泛應(yīng)用造成了困難[5]。面對(duì)這一問(wèn)題，常通過(guò)表面改性來(lái)解決[6]，材料表面改性是提高材料生物性能和親水性有效的途徑。親水性增加會(huì)改變蛋白吸附模式，引起輕微的炎癥反應(yīng)，更有利于炎癥的控制和種植后組織修復(fù)[7]。

在口腔種植愈合過(guò)程中，快速建立穩(wěn)固的骨結(jié)合、保持種植體周?chē)撬绞强谇环N植成功的關(guān)鍵。種植愈合過(guò)程中，機(jī)體經(jīng)歷了血腫期、炎癥期、增殖期、重建期等幾個(gè)階段。其中免疫炎癥反應(yīng)的結(jié)果決定了種植體骨整合的形成[8]。炎癥細(xì)胞可釋放多種調(diào)節(jié)靶細(xì)胞功能的分子，而巨噬細(xì)胞作用尤為明顯。研究表明，生物材料表面誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞分泌物不僅影響間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，還影響骨祖細(xì)胞的成骨活性[9]。故本次實(shí)驗(yàn)運(yùn)用硫酸改性材料，構(gòu)建了一個(gè)表面具有2D孔隙結(jié)構(gòu)的PEEK，提高了親水性并檢測(cè)改性后材料對(duì)巨噬細(xì)胞生存活性的影響。

1 材料與方法

1.1 制備PEEK樣本

實(shí)驗(yàn)中所有使用的PEEK材料(Thornton Cleveleys, United Kingdom)均采用壓鑄加工工藝，并為醫(yī)學(xué)級(jí)。將材料加工成不同的尺寸，正方形樣本(10 mm×10 mm×1 mm)用于材料表面表征測(cè)試，圓片樣本(直徑14 mm，厚1 mm)用于細(xì)胞培養(yǎng)。所有樣品使用SiC砂紙進(jìn)行雙面拋光處理。并在丙酮、乙醇和超純凈水中進(jìn)行超聲波清洗，干燥后備用。

1.2 樣品分組

A、對(duì)照組(N)處理如1.1所述； B、3D網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組(3D)：為獲得均勻的多孔結(jié)構(gòu)，材料在攪拌過(guò)程中一直使用磁力攪拌器。在室溫下使用濃硫酸攪拌30 s，后浸在0 ℃去離子水中攪拌10 min，最終浸泡在超純水中48 h； C、2D孔隙結(jié)構(gòu)組(2D)：樣品在室溫下使用濃硫酸攪拌30 s，后放入63.5%硫酸中攪拌10 min，再將樣品浸在0 ℃去離子水中攪拌10 min，最終浸泡在超純水中48 h。

1.3 材料表面性能

運(yùn)用場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(FE-SEM, Hitachi S-4800, 日本)檢測(cè)各組材料表面形貌。使用傅里葉紅外光譜儀(Bruker, Vertex70，德國(guó))對(duì)材料表面官能團(tuán)進(jìn)行檢測(cè)。采用接觸角測(cè)量(SL200B型自動(dòng)接觸角測(cè)量?jī)x，上海梭倫信息科技有限公司)對(duì)樣品的表面潤(rùn)濕性進(jìn)行評(píng)價(jià)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 遍。

1.4 體外實(shí)驗(yàn)

1.4.1 巨噬細(xì)胞(bone marrow-derived macrophage，BMDMs)細(xì)胞培養(yǎng) 5～8 周C57小鼠(第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)脫頸處死后，75%乙醇浸泡5 min，無(wú)菌操作臺(tái)分離脛骨和股骨，浸泡于含5%雙抗的PBS中去凈骨膜，再轉(zhuǎn)移至1%雙抗PBS培養(yǎng)皿中切去兩端骨骺，用2.5 mL注射器抽取適量PBS沖洗骨髓直至發(fā)白為止。收集細(xì)胞懸液1 200 r/min、4 ℃離心5 min，棄上清，細(xì)胞沉淀加入1 mL紅細(xì)胞裂解液重懸，靜置5 min后加入2 mL PBS，1 200 r/min、4 ℃離心5 min，棄上清，細(xì)胞沉淀用7 mL含有15%血清的DMEM培養(yǎng)基重懸，接種細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，在37 ℃，5% CO2環(huán)境下孵育3 h。收集培養(yǎng)上清，細(xì)胞計(jì)數(shù)，稀釋細(xì)胞，加入40 ng/mL的巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor, M-CSF)，置入培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d，半量換液再次加入40 ng/mL的M-CSF，培養(yǎng)3 d。

1.4.2 流式細(xì)胞儀鑒定BMDMs 胰酶消化細(xì)胞，PBS洗滌。制備單細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度約1×106個(gè)細(xì)胞，每份取100 μL單細(xì)胞懸液。細(xì)胞懸液經(jīng)1 mL PBS重懸，加1 mL流式buffer(含2% FCS、0.05% NaN3的PBS液)4 ℃ 1 240 r/min離心5 min，棄上清。加入0.5 μL的F4/80 FITC和CD11b APC和20 μL流式buffer。 4 ℃下避光孵育30 min后加入300 μL流式buffer重懸成單細(xì)胞懸液上機(jī)檢測(cè)。

1.4.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)BMDMs生存活性 3 組PEEK樣品，每組4 片高壓滅菌后放于24 孔板內(nèi)，BMDMs細(xì)胞以2.5×105cells/cm2濃度接種于材料表面，空白對(duì)照組細(xì)胞直接培養(yǎng)在24 孔版的孔內(nèi)。 24 h后，胰酶常規(guī)消化，收集細(xì)胞1 200 r/min離心5 min，棄上清。流式buffer重懸，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，每組取1×106個(gè)細(xì)胞收集于流式管中，1 200 r/min離心5 min，倒去棄液，每管加入300 μL 流式buffer 1 μL PI染液，4 ℃避光孵育30 min后進(jìn)行流式檢測(cè)。

整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 遍。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié) 果

2.1 電鏡下材料表面形貌

FE-SEM觀察各組試件表面形貌，如圖1所示，N組對(duì)照組，在鏡下可見(jiàn)材料表面光滑，僅存在有均勻平行的拋光劃痕。3D組低倍鏡(×1 000)下可觀察到致密均勻的多孔狀結(jié)構(gòu)，高倍鏡(×10 000)下可見(jiàn)3D網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，彼此套疊，孔隙直徑在1.2～2 μm之間。

圖1 各組材料表面微觀結(jié)構(gòu)(SEM)

2D組在低倍鏡(×1 000)下觀察可見(jiàn)均勻孔洞狀結(jié)構(gòu)，高倍鏡(×10 000)可見(jiàn)到孔狀直徑在0.5～1 μm之間。由此可見(jiàn)通過(guò)控制PEEK與硫酸的反應(yīng)條件可以改變材料表面最后形成的結(jié)構(gòu)。

2.2 紅外光譜

圖2為3 個(gè)樣品的紅外觀測(cè)結(jié)果。 3 組樣品在1 188、1 158 cm-1吸收峰處可見(jiàn)C-O-C伸縮振動(dòng)，在1 600 cm-1吸收峰處可見(jiàn)PEEK所含的芳環(huán)(C=C)。 3 組樣品紅外數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)基本類(lèi)似，當(dāng)仍有不同。3D組和2D組在1 050 cm-1吸收峰處可見(jiàn)S=O對(duì)稱(chēng)拉伸，但N組并未存在。且2D組吸收峰幅度更明顯，可以認(rèn)為2D組S=O含量更高。此外3D組和2D在3 393 cm-1吸收峰處可見(jiàn)磺酸羥基-O-H，但N組未見(jiàn)，且2D組吸收峰幅度大于3D組。所以可認(rèn)為PEEK與硫酸反應(yīng)，引入了磺酸基團(tuán)，且2D組磺酸基團(tuán)含量高于3D組。

2.3 水接觸角

研究表明水接觸角越小，材料親水性越好。N組水接觸角為72.90°，2D組為63.22°，孔洞狀表面最為親水，3D組為84.95°, 網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)表面最為疏水(圖3)。

2.4 BMDMs純度鑒定

BMDM細(xì)胞純度鑒定采用流式細(xì)胞術(shù)。成熟的BMDMs細(xì)胞高表達(dá)F4/80和CD11b，因此本實(shí)驗(yàn)中選擇將這兩種細(xì)胞膜分子作為BMDMs成熟鑒定的表面標(biāo)志物。標(biāo)志物雙陽(yáng)率可占總數(shù)的85%，表明細(xì)胞培養(yǎng)成功(圖4)。

2.5 材料對(duì)細(xì)胞生存活性的影響

圖2 各樣本紅外光譜圖

圖3 各組樣本水接觸角

圖4 流式細(xì)胞儀鑒定BMDMs純度

圖5 各組樣品表面BMDMs生存活性

本次實(shí)驗(yàn)運(yùn)用PI單染色法檢測(cè)早期細(xì)胞凋亡。有活性的細(xì)胞細(xì)胞膜致密完整，而PI是一種核酸染料，致密的細(xì)胞膜無(wú)法允許PI 進(jìn)入，故無(wú)法染色，而染色細(xì)胞則屬于凋亡細(xì)胞。如圖5所示，空白對(duì)照組的BMDMs的PI染色率為1.98%，N組(光滑PEEK)為2.79%，3D和2D組分別為2.75%和2.16%，組間無(wú)明顯差異?？梢哉f(shuō)改性后的材料對(duì)細(xì)胞早期生存情況無(wú)顯著影響。

3 討 論

細(xì)胞與種植體之間的相互作用是種植成功的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一[10]。材料表面的成分、結(jié)構(gòu)、形貌、親(疏)水性、表面物理、化學(xué)及力學(xué)特性對(duì)生物體均有影響。恰當(dāng)?shù)牟牧闲再|(zhì)可以提高種植體生物相容性，改善細(xì)胞活性，從而達(dá)到早期愈合的目的。尤其是空隙結(jié)構(gòu)，為材料表面細(xì)胞提供了一個(gè)有利的局部微環(huán)境[11]。作者通過(guò)控制硫酸濃度運(yùn)用磺化的方法將PEEK處理成3D網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和2D孔隙結(jié)構(gòu)。將PEEK材料浸泡于硫酸當(dāng)中，材料發(fā)生磺化反應(yīng)[12]。當(dāng)樣品從硫酸中取出，形成磺化PEEK仍然處于一種溶脹狀態(tài)，并且有少量的硫殘留表面。隨后放置于0 ℃去離子水中，此時(shí)PEEK開(kāi)始從溶脹狀態(tài)向凝固狀態(tài)轉(zhuǎn)變。并在此過(guò)程中，過(guò)量的硫酸向外擴(kuò)散，使磺化后的材料表面形成許多孔隙。此外化學(xué)引入的磺酸基團(tuán)修飾PEEK化學(xué)鏈，破壞了原有的致密結(jié)構(gòu)，促進(jìn)了孔隙的形成[13]，最終形成多孔結(jié)構(gòu)。

從水接觸角實(shí)驗(yàn)可以看到，2D孔隙結(jié)構(gòu)的材料表面水接觸角最小，說(shuō)明材料表面最為親水，而3D網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)材料表面水接觸角大，材料更為疏水。材料親疏水性的不同會(huì)影響后續(xù)蛋白吸附和細(xì)胞黏附。有研究表明疏水性材料表面更有利于蛋白質(zhì)黏附[14]，蛋白吸附在材料表面主要分為兩個(gè)步驟，首先是蛋白吸附在材料表面，然后蛋白發(fā)生構(gòu)象改變，最終可形成共價(jià)鍵吸附。在疏水性材料表面，蛋白表現(xiàn)出強(qiáng)吸附，而親水表面，蛋白表現(xiàn)出弱吸附。但如何實(shí)現(xiàn)蛋白的選擇性吸附少有研究，且對(duì)種植成功意義更大。另一方面普遍認(rèn)為細(xì)胞膜具有親水的寡糖鏈，呈現(xiàn)一定的親水性，故親水性的材料表面更有利于細(xì)胞的黏附[15]。作者分析2D結(jié)構(gòu)表面更親水的原因可能為二，一是因?yàn)?D孔隙狀結(jié)構(gòu)屬于親水結(jié)構(gòu)；二是磺酸基團(tuán)是親水基團(tuán)，2D組磺酸基團(tuán)較多。此外，盡管3D組也引入了磺酸基團(tuán)，但磺化后水接觸角反而增大，這表明3D網(wǎng)狀的結(jié)構(gòu)表面降低了材料的親水性。

4 結(jié) 論

通過(guò)控制反應(yīng)條件，利用硫酸對(duì)PEEK進(jìn)行處理，制備出3D網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，和2D孔隙結(jié)構(gòu)。處理后的材料表面引入了磺酸基團(tuán)，并且因?yàn)楸砻嫘蚊驳牟煌淖兞瞬牧系挠H疏水性。此外，在對(duì)細(xì)胞活性檢測(cè)上發(fā)現(xiàn)并無(wú)差異。為以后的生物學(xué)進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。