GAL/GALR2促進(jìn)涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞神經(jīng)侵襲的研究

王珺 李歡 楊子檜 完顏超杰 張峰瑞 楊新杰 魏建華 雷德林

涎腺腺樣囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma, SACC)具有嗜神經(jīng)侵襲(perineural invasion,PNI)的特性[1]，其病理表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞沿神經(jīng)浸潤(rùn)生長(zhǎng)[2]，患者會(huì)出現(xiàn)麻木、面癱等臨床癥狀，導(dǎo)致治療難度增大，預(yù)后一般較差。PNI的發(fā)生涉及多因素的參與[3]，SACC的PNI機(jī)制目前仍不明確，是國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)之一[4-5]。

目前，微環(huán)境理論學(xué)說被廣泛認(rèn)可，認(rèn)為腫瘤與神經(jīng)之間存在某些因子相互介導(dǎo)，從而促進(jìn)PNI的發(fā)生[6]。甘丙肽(Galanin，GAL)作為一種神經(jīng)肽，與其受體甘丙肽2型受體(GALR2)在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)廣泛分布[7]，在多種腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[8]。既往文獻(xiàn)報(bào)道，GAL與腫瘤不良預(yù)后相關(guān)[9]。目前GAL及其受體在SACC嗜神經(jīng)侵襲過程中發(fā)揮的作用尚未明確，本研究基于SACC細(xì)胞與小鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG)共培養(yǎng)模型及體外神經(jīng)侵襲模型，通過qRT-PCR、Western Blot、劃痕、遷移侵襲、CCK-8及流式細(xì)胞術(shù)等實(shí)驗(yàn)方法，分析GAL/GALR2在SACC神經(jīng)侵襲中的作用，為闡明SACC的PNI機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及材料

RNA提取試劑盒、qRT-PCR試劑盒(Takara，日本); BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(西安晶彩生物科技有限公司); RPMI-1640培養(yǎng)基(Hyclone，美國(guó)); 胎牛血清(Gibco，美國(guó)); GAL細(xì)胞因子、GALR2拮抗劑M871(Tocris Biosciences，英國(guó)); 凋亡試劑盒(北京四正柏生物科技有限公司); Transwell小室(共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)0.4 μm，遷移侵襲實(shí)驗(yàn)8.0 μm, Corning，美國(guó))。

1.2 細(xì)胞

涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞系SACC-83(北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院)培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱(Thermo Scientific，美國(guó))。

1.3 方法

1.3.1 DRG的提取、培養(yǎng) DRG取自新生BALB/c雄性小鼠脊柱內(nèi)，取出后置于基質(zhì)膠中，1640培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，之后更換含0.1% BSA的1640培養(yǎng)基。

1.3.2 qRT-PCR 提取共培養(yǎng)后SACC-83細(xì)胞總RNA，并測(cè)量各組樣本RNA的濃度和純度(EpochTM超微量微孔板分光光度計(jì))。GALR2和β-actin引物由上海生工生物工程股份有限公司定制合成(表1)。

表1 qRT-PCR所用引物序列

1.3.3 Western Blot 使用含1% PMSF的RIPA裂解液提取各組培養(yǎng)皿中的蛋白，BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。常規(guī)電泳轉(zhuǎn)膜后封閉，加入GALR2抗體(1 ∶1 000，GeneTex，美國(guó)), GAPDH抗體(1 ∶10 000，GeneTex)，置4 ℃冰箱孵育過夜。隔日1×TBST洗膜，二抗(1 ∶10 000，西安晶彩生物科技有限公司)室溫孵育1 h，洗膜，敷ECL發(fā)光液(晶彩生物公司)，使用ChemiDocTMXRS+Image LabTMSoftware(BIO-RAD，美國(guó))檢測(cè)蛋白條帶的灰度值。以目的蛋白灰度值與內(nèi)參灰度值的比值作為目的蛋白表達(dá)的相對(duì)水平。

1.3.4 CCK-8實(shí)驗(yàn) SACC-83細(xì)胞接種于96 孔板中，待細(xì)胞貼壁后分別加入0、5、10、50、100 ng/mL的GAL細(xì)胞因子進(jìn)行干預(yù)。分別以0、12、36 h作為節(jié)點(diǎn)，吸去原培養(yǎng)液，重新加入90 μL新培養(yǎng)液和10 μL的CCK-8溶液，培養(yǎng)箱孵育2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度。

1.3.5 凋亡實(shí)驗(yàn) 采用AnnexinV/FITC和PI雙染法染色，使用全數(shù)字化流式細(xì)胞儀(FC500 MCL，貝克曼，美國(guó))檢測(cè)。將培養(yǎng)后的細(xì)胞用不含EDTA的胰酶消化后收集于15 mL離心管中，1 000 r/min離心5 min，小心吸除上清，之后用4 ℃預(yù)冷的PBS洗滌重懸，離心去上清。用1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整其細(xì)胞密度為1～5×106/mL，取100 μL細(xì)胞懸液，加入5 μL Annexin V/FITC混勻后于室溫避光孵育5 min，之后加入10 μL PI，并加400 μL PBS，立刻進(jìn)行流式檢測(cè)。

1.3.6 劃痕實(shí)驗(yàn) SACC-83細(xì)胞接種于Transwell下室，上室使用DRG條件培養(yǎng)基，分設(shè)SACC-83單獨(dú)培養(yǎng)組、加入GAL細(xì)胞因子的單獨(dú)培養(yǎng)組、SACC-83與DRG共培養(yǎng)組及加入GALR2抑制劑M871的共培養(yǎng)組。依照劃痕實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行，24 h 后倒置相差顯微鏡下拍照，測(cè)量各組腫瘤細(xì)胞的移動(dòng)距離。

1.3.7 遷移實(shí)驗(yàn) SACC-83細(xì)胞(5×104/cm2)和DRG分別接種于Transwell上下室中，模擬腫瘤-神經(jīng)相互作用。共培養(yǎng)24 h后，4%多聚甲醛固定，1%結(jié)晶紫溶液染色，將沒有遷移的細(xì)胞擦除，雙蒸水輕輕漂洗殘留染液。倒置相差顯微鏡下隨機(jī)選取5 個(gè)獨(dú)立視野，計(jì)數(shù)各實(shí)驗(yàn)組中穿過Transwell膜的細(xì)胞數(shù)量。

1.3.8 侵襲實(shí)驗(yàn) SACC-83細(xì)胞(5×104/cm2)和DRG分別接種于含Matrigel稀釋液的Transwell上下室中，模擬腫瘤神經(jīng)相互作用。其余步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.3.9 體外SACC細(xì)胞神經(jīng)侵襲模型 體外分離培養(yǎng)DRG，之后將活細(xì)胞示蹤劑CMFDA(10 μmol/L，上海翊圣生物科技公司)處理過的SACC-83細(xì)胞與DRG共培養(yǎng)，24 h后顯微鏡下觀察細(xì)胞侵襲面積。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

各實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，采用Graphpad Prism8對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析。 以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 DRG提取、培養(yǎng)

體外培養(yǎng)新生BALB/c小鼠DRG生長(zhǎng)狀況觀察，體外培養(yǎng)24 h可見神經(jīng)突起伸出，48 h后可見有神經(jīng)突起伸展至基質(zhì)膠最大周徑的1/3(圖1)。

2.2 神經(jīng)-腫瘤共培養(yǎng)

qRT-PCR、Western Blot結(jié)果顯示(圖2)：與單獨(dú)培養(yǎng)組相比，同DRG共培養(yǎng)的SACC-83細(xì)胞中，GALR2表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05)。

2.3 GAL/GALR2對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡的影響

增殖實(shí)驗(yàn)顯示(圖3)，加入GAL細(xì)胞因子后，SACC-83細(xì)胞增殖能力在12 h時(shí)達(dá)到高峰，最適生長(zhǎng)濃度為10 ng/mL。 50 ng/mL組和100 ng/mL組起始作用率低于單獨(dú)培養(yǎng)的SACC-83細(xì)胞，提示濃度過高可能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生增殖抑制，36 h后各組基本持平。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SACC-83細(xì)胞凋亡率顯示，共培養(yǎng)后腫瘤細(xì)胞凋亡率顯著降低；在共培養(yǎng)組中加入GALR2抑制劑M871后，凋亡率升高(P<0.05)。

圖1 DRG形態(tài)

圖2 SACC-83細(xì)胞與DRG共培養(yǎng)前后GALR2的表達(dá)

2.3 GAL/GALR2對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移侵襲能力的影響

劃痕、Transwell遷移侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(圖4)，共培養(yǎng)組及添加GAL細(xì)胞因子的處理組中，SACC-83細(xì)胞遷移侵襲能力顯著提高(P<0.05)，加入受體抑制劑M871后，遷移侵襲能力減弱(P<0.05)。SACC細(xì)胞神經(jīng)侵襲模型發(fā)現(xiàn)(圖5)，共培養(yǎng)組加入M871后，可以抑制SACC細(xì)胞神經(jīng)侵襲能力(P<0.05)。

3 討 論

SACC嗜神經(jīng)侵襲特性的發(fā)生常導(dǎo)致手術(shù)切除范圍較難掌握[10]，使臨床治療十分棘手。研究表明，神經(jīng)可通過分泌多種因子參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞與神經(jīng)之間的互動(dòng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞嗜神經(jīng)侵襲。學(xué)者們相繼發(fā)現(xiàn)了多種參與調(diào)控該過程的信號(hào)分子[11-14]。然而，SACC的嗜神經(jīng)侵襲機(jī)制仍需深入研究。

A: CCK-8增殖實(shí)驗(yàn); B、C： 凋亡實(shí)驗(yàn)

圖4 共培養(yǎng)SACC-83細(xì)胞的遷移侵襲能力

GAL是一種神經(jīng)多肽，主要作為大腦和外周神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)傳遞的調(diào)制器[15]，并具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和神經(jīng)保護(hù)的作用。GAL及其三個(gè)G蛋白偶聯(lián)受體在疾病進(jìn)展中發(fā)揮著不同的作用，相關(guān)頭頸部鱗癌的研究發(fā)現(xiàn)，GAL通過激活GALR2促進(jìn)腫瘤的增殖、生存[18]和PNI的發(fā)生[7]。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在頭頸部鱗癌中GALR2蛋白表達(dá)水平降低[17-18]。以上研究提示GALR2可能同時(shí)擁有促進(jìn)疾病進(jìn)展和抑制疾病進(jìn)展的作用。所以，明確GAL/GALR2在SACC病變進(jìn)程中發(fā)揮的作用對(duì)進(jìn)一步探究該疾病PNI的作用機(jī)制具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了目前被國(guó)際廣泛認(rèn)可的神經(jīng)侵襲模型，利用Transwell小室將SACC-83與DRG進(jìn)行共培養(yǎng)[19]。通過qRT-PCR及Western Bolt發(fā)現(xiàn)，與單獨(dú)培養(yǎng)組相比，共培養(yǎng)后的SACC細(xì)胞中GALR2表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.01)，表明該分子參與了腫瘤-神經(jīng)間的相互作用。CCK-8、流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，GAL上調(diào)可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，而加入其受體抑制劑后能有效減緩PNI進(jìn)程。Transwell遷移侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，共培養(yǎng)組以及GAL處理組的侵襲能力較單獨(dú)培養(yǎng)組顯著提高，而受體抑制劑可使 SACC-83遷移、侵襲能力顯著降低，說明GAL可通過激活其受體GALR2來(lái)促進(jìn)SACC的PNI進(jìn)程。

圖5 M871對(duì)SACC細(xì)胞PNI能力的影響

此外，本實(shí)驗(yàn)利用PNI體外模型進(jìn)一步驗(yàn)證了GALR2在PNI過程中的作用。該模型可直觀、實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)觀察腫瘤-神經(jīng)相互作用，已被廣泛應(yīng)用于前列腺癌、胰腺癌、頭頸部鱗癌等多種惡性腫瘤神經(jīng)侵襲研究中[8，19]，是探討腫瘤細(xì)胞神經(jīng)侵襲機(jī)制的可靠模型[20]。結(jié)果表明，通過阻斷GALR2表達(dá)，可以有效抑制SACC細(xì)胞PNI的發(fā)生。

本研究初步明確了神經(jīng)來(lái)源GAL可以作用于SACC腫瘤細(xì)胞，使其受體GALR2高表達(dá)，促進(jìn)SACC侵襲遷移能力，促進(jìn)PNI進(jìn)程。該發(fā)現(xiàn)為明確PNI發(fā)展機(jī)制提供了新思路，也為SACC的臨床治療提供了潛在新靶點(diǎn)。但是，GAL在神經(jīng)及SACC中均有表達(dá)[21]，它是否在PNI的發(fā)生過程中，對(duì)神經(jīng)和腫瘤有雙向介導(dǎo)作用，及其更深入的分子機(jī)制仍有待探究。