糧食中黃曲霉毒素B1檢測的免疫磁珠法樣本前處理應(yīng)用研究

李紅洲，盧紅洋，鮑闖業(yè)，任迎會，李 巖，劉 津，原曉玲，張 波2，

(1.貴州省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院，貴州 貴陽 550016； 2.江蘇大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013； 3.沭陽康源泰博生物科技有限公司，江蘇 宿遷 223600； 4.招遠市溫泉街道辦事處，山東 煙臺 265400)

黃曲霉毒素(aflatoxin,AFT)是一類由黃曲霉菌和寄生曲霉菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物的總稱。目前已發(fā)現(xiàn)的黃曲霉毒素有20多種，其中已分離鑒定出的黃曲霉毒素有B1、B2、G1、G2、M1、M2等18種。因此，準確快速的測量玉米等食品中的黃曲霉毒素含量具有重要的意義[1-5]。我國在2017年頒布的《食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》GB 2761—2017中規(guī)定，玉米、小麥等谷物及其制品中黃曲霉毒素B1含量的最高限定量為20 μg/kg[6]。

在食品檢測分析中，主要有酶聯(lián)吸附法、膠體金快速定量法、免疫親和層析凈化高效液相色譜法、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用等檢測方法[7-12]。而樣品的前處理富集凈化是儀器分析前的重要步驟，由于食品中成分復(fù)雜且理化性質(zhì)各異，會嚴重干擾目標物質(zhì)的提取、分離及檢測，因此在測定樣品中有害物質(zhì)之前，需進行目標分析物的提取、凈化、濃縮等前處理步驟，以達到待測物與干擾雜質(zhì)分離的目的，從而減少檢測時的干擾峰，并能有效富集試樣中的痕量待測組分。樣品的凈化處理是測定真菌毒素的難點所在。目前常用的凈化方法主要為免疫親和柱凈化法、固相萃取柱凈化法、液液萃取、Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe法(QuEChERS)[13-18]。這些提取方式不僅操作繁瑣，效率不高，而且需要大量使用包括正己烷、乙酸乙酯、石油醚等在內(nèi)的各種有機溶劑，此類有機溶劑易對環(huán)境產(chǎn)生二次污染，也會對操作人員的健康產(chǎn)生傷害。

免疫磁珠為磁性微球和免疫配基結(jié)合而成的納米級材料，表面通常帶有氨基、羧基、羥基或巰基等化學(xué)官能團，該官能團與不同的免疫配基如活性蛋白、抗體、抗原、親和素、生物素等結(jié)合形成免疫磁珠。免疫磁珠已經(jīng)廣泛用于生物樣本的提取和處理，如核酸、蛋白的提取等[19-22]。在食品分析中，免疫磁珠凈化體系的作用力是外界磁場，磁場納米顆粒在磁場中可定向運動，從而在反應(yīng)結(jié)束后能利用磁鐵實現(xiàn)反應(yīng)體系和未反應(yīng)體系的快速分離，整個凈化過程在15 min之內(nèi)，極大地縮短了前處理時間。

本實驗采用免疫磁珠凈化法實現(xiàn)對樣本前處理富集純化，是將納米磁珠代替免疫親和柱的多糖微球跟目標分析物的特異抗體偶聯(lián)，然后在樣品提取液中反應(yīng)，通過清洗、洗脫等步驟獲得凈化的、濃縮樣品處理液，隨后采用高效液相色譜法進行含量測定。對比免疫磁珠凈化和免疫親和柱法(國標法)兩種凈化方式對玉米、小麥中等樣品中黃曲霉毒素B1含量的測定結(jié)果的差異，以確定免疫磁珠凈化法對樣本提取測定的可行性。

1 試驗材料與方法

1.1 材料與儀器

Waters2695高效液相色譜儀，美國Waters公司；熒光檢測器，美國Waters公司；光化學(xué)衍生系統(tǒng)，北京康源泰博生物科技有限公司；KJMR-IIA型血液混勻器，江蘇康健醫(yī)療用品有限公司；電子天平，梅特勒上海有限公司；TG16-WS臺式高速離心機，湖南湘儀離心機儀器有限公司；免疫親和柱，A公司；玻璃纖維濾紙，針頭過濾器，玉米、小麥等樣品購置于當(dāng)?shù)爻小?/p>

甲醇、乙腈為色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀、氯化鈉用分析純，購置國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1免疫磁珠提取樣品中黃曲霉毒素B1

以公司自主研發(fā)的全自動免疫磁珠純化儀為樣本凈化提取凈化設(shè)備，稱取25 g粉碎的樣品與125 ml甲醇-水(7∶3，體積比)溶液混合均勻，加入5.0 g氯化鈉用均質(zhì)器高速攪拌，提取2 min，在離心機上離心5 min(4 000 r/min)，準確移取15 ml濾液并加入30 ml水稀釋。取出磁珠液體2 ml，放于試管條的磁珠管位中，將試管條放置于儀器的試管條組件中，在樣本管中加入5 ml樣本提取液。通過全自動免疫磁珠法純化儀使磁棒套在磁珠管位、樣本管位、清洗管位、洗脫管位來回移動，自動完成樣本的富集、清洗、洗脫。樣本即提取完成，樣本收集液留在收集管中，待HPLC檢測用。

1.2.2國標法(免疫親和柱法)提取樣品中的黃曲霉毒素B1

根據(jù)GB 5009.22—2016食品安全國家標準食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定中規(guī)定，免疫親和柱:AFTB1柱容量≥200 ng。

稱取25 g粉碎的樣品與125 ml甲醇-水(7∶3，體積比)溶液混合均勻，加入5.0 g氯化鈉用均質(zhì)器高速攪拌，提取2 min，離心5 min(4 000 r/min)，準確移取15 ml濾液并加入30 ml水稀釋。

首先將低溫下保存的免疫親和柱恢復(fù)至室溫。將黃曲霉毒素B1免疫親和柱連接于20.0 ml注射器下，準確移取15.0 ml樣品提取稀釋液注入注射器，將空氣壓力泵與注射器連接，調(diào)節(jié)壓力使溶液以約6 ml/min(1～2滴/s)流速緩慢通過免疫親和柱，直至2～3 ml空氣流入柱體；以10.0 ml水淋洗柱子2次，棄去全部流出液，并使2～3 ml空氣通過柱體，準確加入1.0 ml色譜級甲醇洗脫，流速為1～2 ml/min，收集到的甲醇洗脫液，收集濾液于進樣瓶中以備進樣

1.3 儀器條件

高效液相檢測條件：進樣體積為50 μl，柱溫30℃，水∶乙腈∶甲醇(體積比)為68∶18∶18，流速為0.8 ml/min。熒光檢測：激發(fā)波長Ex=360 nm，發(fā)射波長Em=450 nm；色譜柱：C18柱(柱長150 mm，柱內(nèi)徑4.6 mm，填料粒徑5 μm)，可直接使用HPLC檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 免疫磁珠法凈化高效液相色譜法標準曲線的繪制

以不同質(zhì)量濃度黃曲霉毒素B1標準溶液為橫坐標，對應(yīng)的峰面積積分值為縱坐標，繪制黃曲霉毒素B1測定的標準工作曲線，見圖1。

圖1 免疫磁珠法凈化高效液相色譜法測定黃曲霉毒素B1含量的標準曲線

其線性方程為：y=184 501x，R2=0.999 8，線性相關(guān)系數(shù)符合方法要求。

2.2 免疫磁珠法和免疫親和柱法的高效液相色譜圖比較

免疫磁珠法(藍線)和免疫親和柱法(紅線)的樣品凈化處理的高效液相色譜圖見圖2。采用1.2.1節(jié)和1.2.2節(jié)中的兩種方法對黃曲霉毒素B1進行凈化分離，從圖2中可知，在相同的色譜條件下，兩種凈化方法處理樣品的出峰時間幾乎一致，且不存在其它明顯干擾雜質(zhì)峰，表明免疫磁珠法和免疫親和柱法這兩種分離方法對樣品進行凈化效果良好且效果明顯，符合儀器檢測分析的樣品前處理要求。

圖2 免疫磁珠(藍線)和免疫親和柱(紅線)的樣品處理的高效液相色譜圖

2.3 免疫磁珠法和國標法(免疫親和柱法)的實際樣品檢測結(jié)果對比

以玉米、飼料、小麥等糧食為目標檢測物，預(yù)先采用1.2.1節(jié)和1.2.2節(jié)中所述的方法步驟對多種樣品進行處理富集凈化，凈化結(jié)束后采用高效液相

表1 兩種不同前處理方法的檢測結(jié)果

色譜法對數(shù)據(jù)進行處理、檢測分析。檢測結(jié)果見表1。表1結(jié)果表明兩種前處理方法所得的結(jié)果相差不大，在合理的檢測范圍誤差內(nèi)。

2.4 免疫磁珠法的加標回收測試

為了進一步驗證免疫磁珠法對實際樣品檢測的準確度，采用全自動免疫磁珠純化儀凈化法結(jié)合高效液相色譜法對添加黃曲霉毒素B1的空白小麥、花生、飼料、辣椒醬等樣品進行檢測，加入適量配置的黃曲霉毒素B1標準品，使AFB1的添加量分別為2.5、5、10 ng/ml 3個水平濃度，每個水平重復(fù)測試5次，計算回收率和相關(guān)變異系數(shù)。4種樣品基質(zhì)添加回收率結(jié)果見表2。

表2 4種基質(zhì)中黃曲霉毒素B1的加標回收試驗(n=5)

從2表中可知，4種基質(zhì)的平均回收率在88.58%～107.61%，變異系數(shù)小于10%。回收率和變異系數(shù)均符合殘留檢測的要求，說明該方法具有較好的準確性和重復(fù)性，可以用于天然樣品中AFB1的準確定量與分析。

2.5 兩種檢測方法的比較分析

從檢測步驟來看，免疫磁珠法和國標法(免疫親和法)凈化樣品中黃曲霉毒素B1時，均需要對樣品進行稱量、提取、凈化、洗脫、進樣上機測定，并繪制標準曲線等操作處理。其差異性體現(xiàn)在提取的反應(yīng)原理上，其中免疫磁珠法主要采用免疫磁珠為固相載體，使免疫反應(yīng)更接近液相，反應(yīng)更加充分和快速，免疫磁珠上偶聯(lián)有抗黃曲霉毒素B1抗體，在反應(yīng)時形成磁珠-抗原-抗體復(fù)合物，結(jié)合的免疫復(fù)合物更加容易分離，降低了非特異性吸附，更利于全自動儀器應(yīng)用。而國標法(免疫親和柱法)主要利用柱子里裝載的瓊脂糖凝膠上偶聯(lián)的抗黃曲霉毒素B1抗體，形成載體-抗原-抗體復(fù)合物，樣品凈化時需要外加泵流操作架配備注射器，對樣本的流速有要求，過濾過程相對緩慢，且不易實現(xiàn)自動的儀器操作。因而在對大批量的樣品檢測時，可以采用免疫磁珠法進行樣本的預(yù)處理、富集凈化待測組分。

3 結(jié)論

在儀器法定量檢測分析之前，與免疫親和柱凈化法相比，樣品的前處理可采用以免疫磁珠法為原理的直接提取凈化，無需經(jīng)過免疫親和柱的凈化富集，也可以滿足實驗測定的要求。全自動免疫磁珠純化儀凈化法具有處理快速，實驗成本低，而且易于自動化操作，解放了實驗人員雙手，適合企業(yè)以及檢驗機構(gòu)初檢篩選或者新手操作。通過多次試驗，使用全自動免疫磁珠純化儀進行凈化處理的結(jié)果準確度高、精密度好，處理方法凈化時間短。此外采用全自動式進行凈化處理，無需人員看守，檢驗人員可同時完成其他工作，從而提高工作效率；在保障檢驗人員安全方面，通過平臺全自動進行凈化處理，檢驗人員避免了直接接觸陽性樣品并減少了直接接觸有機試劑的機會，從而使檢驗人員的身體安全得到了保障。