硬粒小麥-長穗偃麥草附加系、代換系和易位系的創(chuàng)制

段亞梅 羅賢磊 陳士強(qiáng) 高 勇 陳建民,* 戴 毅

研究簡報

硬粒小麥-長穗偃麥草附加系、代換系和易位系的創(chuàng)制

段亞梅1,2羅賢磊2陳士強(qiáng)3高 勇2陳建民1,2,*戴 毅1,*

1揚州大學(xué)農(nóng)業(yè)科技發(fā)展研究院 / 教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國際聯(lián)合實驗室, 江蘇揚州 225009;2揚州大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 / 江蘇高?，F(xiàn)代谷物生產(chǎn)協(xié)作中心, 江蘇揚州 225009;3江蘇省里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所, 江蘇揚州 225009

通過小麥與長穗偃麥草遠(yuǎn)緣雜交創(chuàng)制附加系、代換系及易位系是小麥遺傳改良中利用長穗偃麥草優(yōu)良基因的重要途徑。本研究將長穗偃麥草特異分子標(biāo)記、染色體計數(shù)、基因組原位雜交(GISH)及非變性原位雜交(ND-FISH)等多種方法相結(jié)合, 對硬粒小麥Langdon (AABB)與小偃麥8801 (AABBEE)的雜交后代群體進(jìn)行分子細(xì)胞學(xué)鑒定, 創(chuàng)制出硬粒小麥-長穗偃麥草3E、6E染色體雙體附加系Du-DA3E和Du-DA6E, 硬粒小麥-長穗偃麥草1E (1B)染色體雙體代換系Du-DS1E (1B)以及硬粒小麥-長穗偃麥草1AS-1EL染色體易位系Du-T1AS·1EL。創(chuàng)制的4個種質(zhì)中長穗偃麥草染色體均能穩(wěn)定遺傳, 這不僅增加了硬粒小麥-長穗偃麥草附加系和代換系的類型, 還為后續(xù)利用長穂偃麥草優(yōu)良基因改良小麥提供了特殊種質(zhì)資源。

硬粒小麥; 長穗偃麥草; 附加系; 代換系; 易位系

利用普通小麥(, AABBDD, 2=42)與其野生近緣種進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交, 雜交后自發(fā)或人工染色體加倍形成完全或部分雙二倍體, 這是將野生近緣種中優(yōu)良外源基因?qū)肫胀ㄐ←湹那疤醄1], 也是普通小麥遺傳改良的重要途徑之一[2], 該途徑同樣適用于硬粒小麥(ssp., AABB, 2=28)的遺傳改良。硬粒小麥?zhǔn)莾H次于普通小麥的栽培小麥, 具有高面筋、高蛋白含量的優(yōu)質(zhì)性狀, 但存在產(chǎn)量有限、易感赤霉病、根腐病等問題。與普通小麥相比, 硬粒小麥只有A、B兩個基因組, 更容易和野生近緣種雜交, 獲得含有外源基因組的小麥種質(zhì)。例如, 劉大鈞等[3]將簇毛麥(, VV)與硬粒小麥雜交選育了抗白粉病硬粒小麥-簇毛麥雙二倍體(AABBVV); 硬粒小麥與四倍體長穗偃麥草()雜交創(chuàng)制的異源六倍體小偃麥8801(AABBEE)保留了長穗偃麥草抗多種小麥病害的優(yōu)良性狀[4-5]。

目前我國已育成普通小麥與黑麥()、長穗偃麥草、中間偃麥草()、濱麥()等野生近緣種的部分雙二倍體[6]。這些部分雙二倍體常常能夠保留近緣種抗病、抗逆等優(yōu)良性狀, 是進(jìn)一步創(chuàng)制附加系、代換系及易位系的橋梁親本。國內(nèi)外已利用雙二倍體創(chuàng)制了小麥與黑麥、山羊草()、長穗偃麥草、簇毛麥、鵝觀草()、賴草()等小麥近緣種的單體、雙體、雙端體多種類型的附加系[7-9]。小麥近緣種代換系可以在遠(yuǎn)緣雜交后代自發(fā)產(chǎn)生, 也可以通過單體代換法、缺體回交法等途徑創(chuàng)制[10]。Hu等[11]在普通小麥與小麥-中間偃麥草部分雙二倍體的雜交后代中選育出一個抗條銹病的小麥-中間偃麥草1St (1D)代換系。由于附加系、代換系等材料是向小麥導(dǎo)入完整的外源染色體, 因此染色體上優(yōu)良基因和不利基因同時導(dǎo)入小麥中, 從而降低了外源優(yōu)良基因在小麥遺傳改良中的利用效應(yīng), 導(dǎo)致附加系、代換系不能直接應(yīng)用于小麥育種中。易位系則是將含目標(biāo)基因的小片段外源染色體導(dǎo)入到小麥中, 這將大大減少導(dǎo)入目標(biāo)基因時帶入的不良基因。而且, 外源染色體片段很小, 能夠在小麥中更為穩(wěn)定地保存下來。所以, 創(chuàng)制小片段易位系是利用近緣物種優(yōu)良基因的有效途徑。易位系可以由染色體間斷裂錯接自發(fā)產(chǎn)生, 也可以通過物理輻射或化學(xué)誘變劑誘導(dǎo)產(chǎn)生。通常是將小麥與近緣種雜交的F1代、雙二倍體、附加系、代換系等帶有外源染色體材料的種子、幼穗或花粉等進(jìn)行輻射處理, 引起染色體的隨機(jī)斷裂, 在輻射后代中會產(chǎn)生大量的染色體結(jié)構(gòu)變異[12-13], 當(dāng)外源染色體片段與小麥染色體重接, 便可形成異源易位染色體。張璐璐等[14]通過60Co輻射處理中國春–長穗偃麥草7E代換系與揚麥16雜交的F2種子, 在其輻射后代中篩選到抗赤霉病的小麥–長穗偃麥草7EL整臂易位系。

長穗偃麥草是小麥遠(yuǎn)緣雜交中常用的野生種之一, 在其進(jìn)化過程中經(jīng)歷了多種環(huán)境下長期的自然選擇, 形成了許多栽培小麥不具有或已經(jīng)喪失的優(yōu)良性狀, 如具有抗赤霉病、根腐病和麥二叉蚜(greenbug)等多種小麥病蟲害的優(yōu)良特性[15-21], 并且也具有耐鹽、耐旱、耐澇等特性[22-24]。長穗偃麥草的E基因組與小麥的ABD組的親緣關(guān)系較近[25], 使得其與小麥雜交比較容易獲得可育后代, 將長穗偃麥草的基因?qū)氲叫←溨懈牧夹←湹某晒β瘦^高, 因此常被用作小麥遺傳改良的優(yōu)異外源基因供體[25-26]。研究表明, 長穗偃麥草1E和7EL染色體上帶有赤霉病抗性基因[27-29], 并成功在十倍體長穗偃麥草7el2L染色體上克隆了抗赤霉病基因, 將攜帶的染色體片段轉(zhuǎn)移至普通小麥品種, 可選育出抗赤霉病新品種[21]。Jauhar等[30-32]利用硬粒小麥與二倍體長穗偃麥草雜交并多次回交, 獲得了硬粒小麥-長穗偃麥草1E雙體附加系, 并進(jìn)一步創(chuàng)制了1E (1A)和1E (1B)雙體代換系, 其中1E附加系與1E (1A)代換系具有赤霉病抗性。Liu等[9]創(chuàng)制出的硬粒小麥–長穗偃麥草7E雙體附加系同樣具有赤霉病抗性, 進(jìn)一步證明了7E染色體上帶有赤霉病抗性基因。另外, 長穗偃麥草3E染色體上有黃矮病毒抗性基因; 1E和6E染色體上有抗葉枯病基因[33]; 3E、4E和5E染色體上有耐鹽基因[34-35]。將這些優(yōu)良基因?qū)胄←溨? 可拓寬小麥的遺傳基礎(chǔ)。

普通小麥中已經(jīng)有全套長穂偃麥草附加系、代換系, 而染色體數(shù)目比普通小麥少的硬粒小麥卻沒有成套類似的材料, 僅有1E、7E附加系以及1E (1A)和1E (1B)代換系。本研究利用長穗偃麥草特異分子標(biāo)記、染色體計數(shù)、基因組原位雜交(genomehybridization, GISH)及非變性原位雜交(non-denaturing fluorescencehybridization, ND-FISH)等多種方法, 對硬粒小麥(Langdon)與小偃麥8801的雜交F4~F6群體進(jìn)行染色體組成的分子細(xì)胞學(xué)鑒定, 從中篩選出硬粒小麥-長穗偃麥草雙體附加系及代換系, 為完善全套硬粒小麥-長穗偃麥草附加系、代換系增加特定種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 植物材料

硬粒小麥Langdon、普通小麥中國春、二倍體長穗偃麥草(2=14, EeEe, PI 531718)、四倍體長穗偃麥草(2=28, Ee1Ee1Ee2Ee2, PI 531749)和異源六倍體小偃麥8801[4-5](, 2=42, AABBEE), 以上種質(zhì)由加拿大農(nóng)業(yè)部渥太華研究發(fā)展中心(AAFC-Ottawa Research and Deve-lopment Center) Dr. Fedak惠贈(表1)。從小偃麥8801與Langdon雜交的F2代群體中選擇染色體數(shù)為2=29, 并且具有長穗偃麥草特異標(biāo)記擴(kuò)增的植株進(jìn)行種植, 在F4~F6代群體中通過分子標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)等方法選育硬粒小麥–長穗偃麥草附加系和代換系。

1.2 分子標(biāo)記檢測

DNA采用改良SDS法提取供試材料的基因組, 參照王景雪等[36]的方法進(jìn)行。選擇20個本研究依據(jù) SLAF-seq法[37]開發(fā)的長穂偃麥草特異分子標(biāo)記和4個已發(fā)表的分子標(biāo)記[38](附圖1和附圖2), 對Langdon與小偃麥8801雜交F2代及F4~F6代植株進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 檢測硬粒小麥背景中的長穗偃麥草遺傳物質(zhì)。所用標(biāo)記及引物序列見表2。PCR擴(kuò)增體系為25 μL, 包括1 μL模板DNA、12.5 μL 2×MasterMix (CWBIO, Art. No. CW0682M)、正向和反向引物各1 μL, 以及9.5 μL ddH2O。依據(jù)2×MasterMix的說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增。1%的瓊脂糖膠檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物, 恒壓120 V的條件下電泳30 min, 然后在凝膠成像儀下照相。

表1 本研究所用的植物材料

1.3 有絲分裂中期染色體制片

取28℃培養(yǎng)箱中萌發(fā)種子的根置于1~4℃冰水處理24~30 h, 用90%乙酸固定8 min (或卡諾固定液固定過夜), 然后移入70%酒精–20℃保存?zhèn)溆谩⒄誎ato等[39]的酶解滴片法制片: 從70%酒精中取出根尖, 用ddH2O洗滌3次, 將根尖分生組織切下, 放入2%纖維素酶和1%果膠酶混合液中37℃水浴1 h, 每個根尖酶總量20 μL。酶解后70%酒精洗2次, 每次2 min, 解剖針搗碎根尖和渦旋震蕩10 s, 4000轉(zhuǎn) min–1離心2 min倒出酒精, 加入25~50 μL 根–1100%乙酸渦旋5 s成細(xì)胞懸浮液。每制片滴加8 μL細(xì)胞懸浮液, 10 min之后相差顯微鏡下進(jìn)行染色體計數(shù), 每單株染色體計數(shù)至少20個細(xì)胞, 每個F4代株系取10株進(jìn)行染色體計數(shù)。標(biāo)出染色體數(shù)完整且分散良好的細(xì)胞位置, 將制片置于–70℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 非變性熒光原位雜交(ND-FISH)

以O(shè)ligo-pSc119.2、Oligo-pAs1作為組合探針進(jìn)行ND-FISH分析[40]。Oligo-pSc119.2 (5′-CCGTTTTGTGGA CTATTACTCACCGCTTTGGGGTCCCATAGCTAT-3′)的5′端由6-羧基熒光素(6-FAM)標(biāo)記, Oligo-pAs1 (5′-CCTTTCT GACTTCATTTGTTATTTTTCATGCATTTACTAATTATTTTGAGCTATAAGAC-3′)的5′端由6-羧基四甲基羅丹明(Tamra)標(biāo)記。由上海英駿公司合成探針。根據(jù)染色體制片數(shù)配制雜交液: 0.3 μL探針/片+8 μL工作液/片(由pH 7.0的1× TE和2× SSC按體積比1∶1混合而成)。每制片加8 μL混勻的雜交液, 蓋上蓋玻片, 放置于密閉濕盒中37℃雜交8 h。雜交完成后將制片放入2×SSC室溫洗脫5 min, 晾干后加8 μL的熒光染料DAPI (VECTOR, H-1200)復(fù)染10 min, 在Nikon (Ni-U)熒光顯微鏡下觀察, Nikon DS-Qi1Mc照相, NIS-Elements D4.30.00合成圖片, Adobe Photoshop CS5進(jìn)行圖片處理。

1.5 基因組原位雜交(GISH)

非變性原位雜交后的制片置于2×SSC中洗脫2 min, 轉(zhuǎn)移到70%酒精中洗脫20 min后涼干, 轉(zhuǎn)入100%酒精中脫水1 h后進(jìn)行基因組原位雜交。缺口平移法標(biāo)記二倍體長穗偃麥草基因組DNA作為探針(Roche, USA, 貨號: 11745816910)。探針標(biāo)記反應(yīng)體系為20 μL, 包括2 μL模板DNA (500 ng μL?1)、4 μL DIG-Nick-Translation Mix及14 μL的ddH2O。15℃下反應(yīng)90 min后, 加入1 μL的0.5 mol μL?1EDTA (pH 8.0)終止反應(yīng)和保存于–20℃?zhèn)溆?。參照顧愛俠等[41]的方法, 制備硬粒小麥Langdon的基因組DNA作為封阻, 濃度為探針DNA的50~200倍。GISH雜交和洗滌按Liu等[9]的方法, 雜交后制片經(jīng)系列洗滌后在Nikon (Ni-U)熒光顯微鏡下觀察, Nikon DS-Qi1Mc照相。

表2 長穗偃麥草特異分子標(biāo)記及序列

1.6 農(nóng)藝性狀特征

為了解硬粒小麥背景中導(dǎo)入不同長穗偃麥草染色體的農(nóng)藝性狀表現(xiàn), 田間種植創(chuàng)制材料, 隨機(jī)排列, 每行10株, 株距10 cm, 每個材料種植3行, 行距30 cm。對所有成活植株的株高、穗長、小穗粒數(shù)、每穗小穗數(shù)、每穗粒數(shù)、千粒重、旗葉面積等農(nóng)藝性狀進(jìn)行觀察統(tǒng)計。株高為小麥地上部分到主穗穗頂?shù)母叨?不含芒長); 穗長為穗莖節(jié)至穗頂部的長度(不含芒長); 旗葉面積=旗葉長×旗葉寬×0.83[42]。所得數(shù)據(jù)用軟件IBM SPSS Statistics 21.0進(jìn)行分析, 分析方法為單因素方差分析(One-way ANOVA), 用最小顯著差法(LSD0.05)檢驗平均數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 含有E染色體植株的選擇

理論上, 硬粒小麥Langdon與小偃麥8801雜交F2代植株的染色體數(shù)目分布范圍為28~42。其中染色體數(shù)為29條的植株中包含硬粒小麥的28條染色體和1條來自8801中的長穗偃麥草E染色體, 從其自交后代中可以獲得硬粒小麥-長穗偃麥草雙體附加系。對F2代的114個單株進(jìn)行染色體計數(shù), 選出22個2= 29的單株, 利用3個長穗偃麥草基因組分子標(biāo)記進(jìn)行檢測, 在22個單株中, 3個標(biāo)記均能擴(kuò)增條帶的有15株, 2個標(biāo)記能擴(kuò)增條帶的有2株, 1個標(biāo)記能擴(kuò)增條帶的有1株, 完全沒有擴(kuò)增條帶的有4株(圖1-a1~a3)。結(jié)合染色體計數(shù)結(jié)果, 3個標(biāo)記都能擴(kuò)增條帶的單株染色體數(shù)符合預(yù)期, 將這些F2單株收獲并連續(xù)自交。

15個F2植株經(jīng)連續(xù)自交選擇后, 獲得10個F4代株系群體, 株系內(nèi)隨機(jī)選擇10株左右, 用長穗偃麥草基因組分子標(biāo)記進(jìn)行鑒定, 有4個株系內(nèi)所有單株擴(kuò)增條帶一致(圖1-b1~b4), 分別為F2-13-6-7、F2-10-9-1、F2-6-14-1及F2-13-9-3。這4個株系的所有單株均能擴(kuò)增出目的條帶, 說明每個單株都含有長穗偃麥草染色體, 初步認(rèn)為是穩(wěn)定的含有長穗偃麥草染色體的新種質(zhì)。這4個株系來自于3個不同的F2單株, 分別定名為Du_No.1 (F2-13-6-7)、Du_No.3 (F2-10-9-1)、Du_No.6 (F2-6-14-1)及Du_No.8 (F2-13-9-3)。

a1~a3: F2代的標(biāo)記擴(kuò)增。M: DL2501 marker; 1~22: F2代植株; 23: Ld; 24: 4X; 25: 8801。a1: 標(biāo)記GSM-1; a2: 標(biāo)記GSM-2; a3: 標(biāo)記GSM-3. b1~b4: F4代的標(biāo)記GSM-3擴(kuò)增. M: DL2501 marker; 1~13: F4代單株; b1: 株系Du_No.1; b2: 株系Du_No.3; b3: 株系Du_No.6; b4: 株系Du_No.8; 14: Ld; 15: 4X; 16: 8801。

a1–a3: amplification of markers in F2generation. M: DL2501 marker; 1–22: different plants of F2generation; 23: Ld; 24: 4X; 25: 8801. a1: markers GSM-1; a2: marker GSM-2; a3: marker GSM-3. b1–b4: amplification of marker GSM-3 to F4generation. M: DL2501 marker; 1–13: different plants of F4generation; b1: line Du_No.1; b2: line Du_No.3; b3: line Du_No.6; b4: line Du_No.8; 14: Ld; 15: 4X; 16: 8801.

2.2 利用染色體特異分子標(biāo)記確定株系屬性

為明確F4代株系中所附加的E染色體屬性, 選擇1E~7E染色體分子標(biāo)記各1個, 對4個株系進(jìn)行初步檢測, F5代用21個染色體分子標(biāo)記再次進(jìn)行鑒定, 確保外源染色體的準(zhǔn)確性(表3和圖2)。來自于同一F2單株的株系Du_No.1和Du_No.8均能擴(kuò)增出1E染色體特異條帶, 但兩者之間存在差異。株系Du_No.1能夠擴(kuò)增出1E長臂和短臂的所有7個1E染色體分子標(biāo)記, 而株系Du_No.8僅擴(kuò)增出1E長臂(1EL)的5個標(biāo)記(圖3-a), 不能擴(kuò)增出1E短臂(1ES)的2個標(biāo)記(圖3-b)。5個3E染色體分子標(biāo)記均能在株系Du_No.3中擴(kuò)增出特異條帶, 同樣5個6E染色體分子標(biāo)記均能在株系Du_No.6中擴(kuò)增出特異條帶。此外, 對4個株系的F6代利用與F5相同的標(biāo)記進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 各株系隨機(jī)選擇的單株均能擴(kuò)增出對應(yīng)染色體的特異條帶(擴(kuò)增條帶與F5相同未給出), 說明F5植株中E染色體成對存在, 自交后代并未發(fā)生E染色體丟失。因此認(rèn)為這4個株系穩(wěn)定, 株系Du_No.1含有1E染色體, 而株系Du_No.8含有1E長臂而沒有1E短臂, 株系Du_No.3含有3E染色體, 株系Du_No.6含有6E染色體。

2.3 細(xì)胞學(xué)鑒定染色體組成

株系Du_No.1和Du_No.8的染色體數(shù)為28, 株系Du_No.3和Du_No.6的染色體數(shù)為30 (圖4)。從F4代隨機(jī)植株的染色體分子標(biāo)記鑒定結(jié)果可見Du_No.3和Du_No.6為硬粒小麥-長穗偃麥草附加系。而2=28的2個株系Du_No.1和Du_No.8雖然染色體數(shù)與硬粒小麥Langdon相同, 株系Du_No.1可擴(kuò)增出1E染色體標(biāo)記, 而株系Du_No.8僅擴(kuò)增出1E長臂標(biāo)記而沒有1E短臂, 則可以推測這2個株系可能為硬粒小麥-長穗偃麥草代換系或易位系。

對4個株系的F5代單株進(jìn)行了同一分裂相的連續(xù)2次原位雜交分析。GISH結(jié)果顯示, 株系Du_No.3及Du_No.6的植株的30條染色體中均含有2條E染色體(圖5-a1, b1)。ND-FISH結(jié)果顯示, 2個株系均含有完整的28條AB基因組染色體(圖5-a2, b2), 以及2條信號分布相同的長穗偃麥草染色體。將株系Du_No.3 (圖5-a3)和Du_No.6 (圖5-b3)中的E 染色體與8801的ND-FISH核型比較[43], 可以確定株系Du_No. 3中的長穗偃麥草染色體信號分布與8801中3E染色體一樣(圖5-a4)。同理, 株系Du_No.6中的E染色體信號分布與8801中的6E (圖5-b4)相同。因此, 證實分子標(biāo)記鑒定結(jié)果和確定株系Du_No.3為硬粒小麥-長穗偃麥草3E雙體附加系(Du-DA3E), 株系Du_No.6為硬粒小麥-長穗偃麥草6E雙體附加系(Du- DA6E)。

表3 長穗偃麥草染色體特異分子標(biāo)記擴(kuò)增結(jié)果

“+”表示能夠擴(kuò)增目的條帶; “–”表示不能擴(kuò)增目的條帶; “*”表示未用該標(biāo)記對植株進(jìn)行擴(kuò)增。

“+” indicates the presence of the target band; “–” indicates the absence of the target band; “*” indicates that the plant has not been amplified using this marker.

M: DL2501 marker; a: 株系Du_No.1, 標(biāo)記為CSM-1E-1; b: 株系Du_No.3, 標(biāo)記為 CSM-3E-1; c: 株系Du_No.6, 標(biāo)記為CSM-6E-4; d: 株系Du_No.8, 標(biāo)記為CSM-1E-1; 1: Ld; 2: CS; 3: 4X; 4: 8801; 5~14: 各株系的不同單株。

M: DL2501 marker; a: line Du_No.1, marker CSM-1E-1; b: line Du_No.3, marker CSM-3E-1; c: line Du_No.6, marker CSM-6E-4; d: line Du_No.8, marker CSM-1E-1; 1: Ld; 2: CS; 3: 4X; 4: 8801; 5–14: different plants of F5generation.

M: DL2501 marker; a: 1E長臂(1EL)標(biāo)記CSM-1E-3; b: 1E短臂(1ES)標(biāo)記 CSM-1E-4; 1: Ld; 2: CS; 3: 4X; 4: 8801。5~9: 隨機(jī)選取的單株。

M: DL2501 marker; a: CSM-1E-3, amplified the long arm of 1E chromosome (1EL); b: CSM-1E-4, amplified the short arm of 1E chromosome (1ES); 1: Ld; 2: CS; 3: 4X; 4: 8801. 5–9: randomly selected individual plant.

a: 株系Du_No.1, 2=28; b: 株系Du_No.3, 2=30; c: 株系Du_No.6, 2=30; d: 株系Du_No.8, 2=28。

a: line Du_No.1, 2=28; b: line Du_No.3, 2=30; c: line Du_No.6, 2=30; d: line Du_No.8, 2=28.

株系Du_No.1的F5代GISH結(jié)果顯示, 該株系含有2條E染色體(圖5-c1), ND-FISH分析顯示2條E染色體為同源染色體(圖5-c2), 且這2條E染色體的信號分布(圖5-c3)與親本8801的1E染色體信號相同(圖5-c4); 此外, 株系Du_No.1中缺少小麥1B染色體(圖5-c5), 表明株系Du_No.1中的1B染色體被長穗偃麥草1E染色體代換, 證實分子標(biāo)記鑒定結(jié)果, 株系Du_No.1為硬粒小麥-長穗偃麥草1E (1B)雙體代換系, 即Du-DS1E (1B)。

株系Du_No.8和Du_No.1來自于同一F2單株, 但Du_No.8的F5代GISH結(jié)果與株系Du_No.1不同, 其中有2條硬粒小麥-長穗偃麥草整臂易位染色體(圖5-d1)。ND-FISH分析顯示, 2條易位染色體信號相同, 且硬粒小麥染色體組中缺少2條完整1A染色體(圖5-d2)。將易位染色體上的信號分布與親本8801的ND-FISH核型圖對比發(fā)現(xiàn), 株系Du_No.8中的易位染色體(圖5-d3)由硬粒小麥1A染色體短臂(圖5-d5)和長穗偃麥草1E染色體長臂(圖5-d4)組成, 結(jié)合分子標(biāo)記鑒定的結(jié)果, 株系Du_No.8為硬粒小麥-長穗偃麥草1AS-1EL易位系, 即Du-DT1AS·1EL。

2.4 農(nóng)藝性狀的初步分析

本研究對獲得的4個株系進(jìn)行農(nóng)藝性狀觀察。從穗部形態(tài)看, 各株系和親本Langdon更為接近, 但株系之間存在差異, 表明不同E染色體的導(dǎo)入對硬粒小麥的外形影響程度不同。4個株系的株高、穗長、每穗小穗數(shù)、每穗粒數(shù)等農(nóng)藝性狀統(tǒng)計見表4。

4個株系的株高和旗葉面積均與Langdon有明顯區(qū)別, 株高顯著低于Langdon, 旗葉面積顯著大于Langdon (< 0.05), 類似于另一親本8801。附加系Du-DA3E的穗長、小穗粒數(shù)及每穗粒數(shù)均與Langdon無顯著性差異, 但每穗小穗數(shù)及千粒重均低于Langdon。種子形態(tài)介于2個親本之間, 略癟, 帶有少許冠毛(圖6-C), 穗部形態(tài)與Langdon相似(圖6-c)。附加系Du-DA6E的穗長、小穗粒數(shù)及每穗粒數(shù)均顯著高于Langdon。種子形態(tài)較為接近Langdon (圖6-D), 穗大且多粒飽滿(圖6-d), 每穗粒數(shù)和千粒重在創(chuàng)制材料中最高。代換系Du-DS1E (1B)的穗長大于Langdon, 每穗小穗數(shù)與Landon無顯著性差異, 但小穗粒數(shù)、每穗粒數(shù)及千粒重均顯著小于Langdon (< 0.05)。種子形態(tài)較為接近8801, 干癟且冠毛較長(圖6-E), 穗部形態(tài)也偏向于8801 (圖6-e)。易位系Du-T1AS·1EL的穗長、小穗粒數(shù)、每穗小穗數(shù)及每穗粒數(shù)均與Langdon無顯著性差異, 但千粒重低于Langdon。種子形態(tài)較為接近Langdon (圖6-F), 穗部形態(tài)介于兩個親本之間(圖6-f)。

3 討論

3.1 硬粒小麥-長穗偃麥草附加系、代換系和易位系的創(chuàng)制

利用小麥-近緣種完全或部分雙二倍體與小麥雜交, 獲得單體附加系, 再通過自交得到雙體附加系是創(chuàng)制小麥-近緣種質(zhì)雙體附加系最簡單、最經(jīng)典的方法[44]。本研究通過硬粒小麥Langdon與小偃麥8801雜交, 獲得的F1代中包含14對AB組同源染色體和7條E組染色體, F1代在減數(shù)分裂時, AB組同源染色體正常配對, 7條E染色體沒有可配對的同源染色體, 因此隨機(jī)分配到不同的配子中。根據(jù)這個特點, 在F2代群體中通過分子標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)檢查, 選出僅含有一條外源染色體的植株連續(xù)自交, 最終從F4代群體中篩選出硬粒小麥–長穗偃麥草3E和6E雙體附加系Du-DA3E和Du-DA6E。這說明在硬粒小麥與小偃麥8801雜交的2個F2單株Du_No.3 (F2-10-9-1)和Du_No.6 (F2-6-14-1)中附加了不同E染色體, 并在自交過程中E染色體通過雌雄配子傳遞成功保存下來, 最終獲得穩(wěn)定株系。

在F4代群體中除獲得附加系外, 還獲得一個代換系Du-DS1E (1B)和一個整臂易位系Du-T1AS·1EL。代換系和易位系來自同一F2單株(F2-13), 均涉及1E染色體, 但自交后代出現(xiàn)不同類型的材料, 說明在自交過程中可能自發(fā)產(chǎn)生了染色體的代換和結(jié)構(gòu)變異。自發(fā)代換通常發(fā)生在部分同源群內(nèi)染色體間, 由于這些染色體間存在一定的同源性, 使得近緣種染色體與小麥染色體在減數(shù)分裂中產(chǎn)生錯誤配對而被保留, 最后小麥染色體丟失, 這種代換因染色體補(bǔ)償性較好而能夠穩(wěn)定地保留在小麥背景中。Garg等[45]在小麥-長穗偃麥草1E附加系的后代中發(fā)現(xiàn)1D染色體丟失而自發(fā)形成1E (1D)代換系。由此可見, 本研究獲得的1E (1B)代換系也是1E和1B染色體進(jìn)行了錯誤配對, 而自發(fā)產(chǎn)生了1E (1B)代換系。

在減數(shù)分裂過程中單價體自發(fā)發(fā)生斷裂形成端著絲點染色體, 當(dāng)外源的端著絲點染色體與小麥的端著絲點染色體融合、重接, 便會形成異源的整臂易位染色體[46]。本研究獲得的穩(wěn)定易位系中易位染色體為1AS-1EL, 可以推測某世代的單株在減數(shù)分裂過程中, 1A和1E染色體在著絲點處斷裂和染色體錯誤連接產(chǎn)生了易位染色體1AS-1EL, 最后產(chǎn)生了穩(wěn)定易位個體。理論上, F1代單株中不同花粉母細(xì)胞發(fā)生部分同源染色體的錯誤配對、著絲點斷裂和斷裂染色體的錯誤連接, 可以產(chǎn)生涉及不同E染色體的代換系和易位系。由此可見, 在附加系構(gòu)建的群體中, 擴(kuò)大F2代的檢測植株數(shù), 有可能獲得自發(fā)產(chǎn)生的多個代換系、易位系或其他特殊類型材料。

3.2 外源染色體高效精準(zhǔn)的鑒定方法

小麥背景中鑒定外源遺傳物質(zhì)常用的方法有形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞學(xué)鑒定、分子標(biāo)記檢測及原位雜交等。形態(tài)學(xué)觀察直觀、簡便快捷, 可初步判斷是否含有外源染色體。通過染色體計數(shù)也能判斷是否含有外源染色體, 但不能確定代換系和易位系。染色體分帶技術(shù)在小麥背景中區(qū)別外源染色體具有一定的可靠性, 但這種技術(shù)的穩(wěn)定性和操作的復(fù)雜性使得該技術(shù)的應(yīng)用受到限制。目前應(yīng)用較多的是分子標(biāo)記檢測及原位雜交分析。分子標(biāo)記可精確檢測小麥背景中的少量外源遺傳物質(zhì), 但無法確定外源染色體在細(xì)胞中的存在性質(zhì)[47]。原位雜交技術(shù)在小麥遠(yuǎn)緣雜交中常被用來分析染色體組成及變化, 不僅能夠檢測外源染色體, 還能分析小麥族染色體組間同源關(guān)系。GISH分析能夠明顯地標(biāo)記出小麥背景中的外源染色體或染色體片段, 但無法識別具體染色體, 也無法確定發(fā)生易位的所屬染色體。利用重復(fù)序列獲得的染色體FISH核型圖可以更準(zhǔn)確鑒定小麥背景中外源染色體的屬性[48]。因此, 組合多種技術(shù)來鑒定小麥背景中外源染色體, 是目前應(yīng)用最多的方式。本研究選擇了分子標(biāo)記鑒定、染色體計數(shù)、GISH及ND-FISH四種鑒定方法, 共同對硬粒小麥背景中長穗偃麥草的具體染色體進(jìn)行鑒定。首先對F2群體中大量的單株進(jìn)行染色體計數(shù), 利用長穗偃麥草基因組分子標(biāo)記對獲選植株進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測, 排除不含長穗偃麥草染色體的單株, 在F4代利用長穗偃麥草染色體分子標(biāo)記再進(jìn)行選擇。如在F2代就利用染色體分子標(biāo)記進(jìn)行鑒定, 可以使鑒定對象和規(guī)模在低世代得到一定的控制, 從而提高后續(xù)鑒定工作的效率。對確定含有長穗偃麥草染色體的植株自交后代進(jìn)行分析, 分子標(biāo)記和GISH結(jié)合可以確定染色體數(shù)2= 30的株系為硬粒小麥–長穗偃麥草特定染色體附加系。但染色體數(shù)目為2= 28的株系, 分子標(biāo)記和GISH難以確定代換系中哪條硬粒小麥染色體被代換, 以及染色體易位發(fā)生在哪條硬粒小麥染色體上。因此, 對同一細(xì)胞分裂相進(jìn)行GISH和ND-FISH分析, 通過識別硬粒小麥和長穗偃麥草染色體, 并與親本8801中E染色體ND-FISH核型圖比較[43], 最終直觀、準(zhǔn)確無誤的明確附加系中具體E染色體, 代換系中的E染色體和被代換的硬粒小麥染色體, 以及易位系中易位染色體的組成。首先經(jīng)細(xì)胞學(xué)、分子標(biāo)記鑒定明確了F2代單株衍生的選擇群體, 再經(jīng)原位雜交進(jìn)行精準(zhǔn)鑒定, 這樣從細(xì)胞學(xué)、分子標(biāo)記鑒定開始一直到ND-FISH分析得出最終結(jié)論, 大大降低了外源遺傳物質(zhì)鑒定的時間和工作量, 而且后續(xù)結(jié)果驗證前期結(jié)果, 使得硬粒小麥–長穗偃麥草各種類型材料的篩選更加快速和準(zhǔn)確。

a1: 株系Du_No.3 GISH; a2: 同一分裂相的ND-FISH; a3: a2圖中E染色體; a4: 8801的3E染色體。b1: 株系Du_No.6 GISH; b2: 同一分裂相的ND-FISH; b3: b2圖中E染色體; b4: 8801的6E染色體。c1: 株系Du_No.1 GISH; c2: 同一分裂相的ND-FISH; c3: c2圖中E染色體; c4: 8801的1E染色體; c5: 8801的1B染色體。d1: 株系Du_No.8 GISH; d2: 同一分裂相的ND-FISH; d3: d2圖中E染色體; d4: 8801的1E染色體; d5: 8801的1A染色體。GISH中綠色信號為長穗偃麥草染色體, ND-FISH中箭頭所指為長穗偃麥草染色體。標(biāo)尺為10 μm。

a1: GISH of line Du_No.3; a2: ND-FISH on the same metaphase; a3: the E chromosomes in a2; a4: the 3E chromosome of 8801. b1: GISH of line Du_No.6; b2: ND-FISH on the same metaphase; b3: the E chromosomes in b2; b4: the 6E chromosome of 8801. c1: GISH of line Du_No.1; c2: ND-FISH on the same metaphase; c3: the E chromosomes in c2; c4: the 1E chromosome of 8801; c5: the 1B chromosome of 8801. d1: GISH of line Du_No.8; d2: ND-FISH on the same metaphase; d3: the E chromosomes in d2; d4: the 1E chromosome of 8801; c5: the 1A chromosome of 8801. The green fluorescence signals show the chromosomes ofin GISH. The arrows refer to chromosomes ofin ND-FISH. Bar: 10 μm.

表4 硬粒小麥-長穗偃麥草附加系、代換系等及其親本的農(nóng)藝性狀

不同字母差異顯著(< 0.05)。

Different lowercase letters represent significant differences at< 0.05.

A, a: Langdon; B, b: 8801; C, c: 附加系Du-DA3E; D, d: 附加系Du-DA6E; E, e: 代換系Du-DS1E(1B); F, f: 易位系Du-T1AS·1EL。標(biāo)尺為10 mm。

A, a: Langdon; B, b: 8801; C, c: addition line Du-DA3E; D, d: addition line Du-DA6E; E, e: substitution line Du-DS1E(1B); F, f: translocation line Du-T1AS·1EL. Bar: 10 mm.

3.3 硬粒小麥背景中長穗偃麥草染色體的穩(wěn)定性和價值

目前普通小麥中有整套長穗偃麥草雙體附加系和代換系, 但硬粒小麥中尚未創(chuàng)制出全套類似材料。Jauhar等[30]在硬粒小麥-長穗偃麥草1E附加系的后代群體中發(fā)現(xiàn)有5%的植株出現(xiàn)外源染色體丟失一條或全部丟失的現(xiàn)象; Liu等[9]在創(chuàng)制硬粒小麥-長穗偃麥草7E附加系中同樣也發(fā)現(xiàn)少數(shù)雙體附加系植株染色體數(shù)恢復(fù)成2= 29, 甚至有外源染色體完全丟失的現(xiàn)象; 李海鳳等[49]研究長穗偃麥草染色體在硬粒小麥背景中的傳遞特征也顯示即便獲得了雙體附加系, 在自交后代中外源染色體也容易丟失; 也有報道認(rèn)為2E和4E染色體僅通過雄配子傳遞, 所以自交后代未見雙體2E、4E附加系[38]。這些研究表明硬粒小麥背景中外源染色體易丟失, 造成這種現(xiàn)象很有可能是由于四倍體硬粒小麥接受外源染色體的緩沖性較差, 而且短時間內(nèi)外源染色體與硬粒小麥染色體間還沒有發(fā)生適當(dāng)?shù)闹嘏艁磉_(dá)到新的平衡。因而, 硬粒小麥背景中至今仍然難以獲得全套穩(wěn)定的雙體附加系、代換系[49-50]。

本研究創(chuàng)制的硬粒小麥–長穗偃麥草附加系, 代換系和易位系中外源染色體能夠穩(wěn)定遺傳, 并沒有出現(xiàn)染色體丟失的現(xiàn)象, 這不僅增加了硬粒小麥背景中長穗偃麥草的附加系和代換系類型, 還為硬粒小麥的改良提供了中間種質(zhì)。例如, 4個材料的株高均低于親本Langdon, 這將有利于提高硬粒小麥抗倒伏能力。旗葉面積的大小與小麥的產(chǎn)量密切相關(guān)[51], 創(chuàng)制的4個材料旗葉面積都大于Langdon, 這將適用于提高硬粒小麥產(chǎn)量的研究。附加系Du-DA6E的穗長、小穗粒數(shù)、每穗粒數(shù)均顯著高于Langdon, 這是否與6E染色體上存在提高產(chǎn)量相關(guān)性狀的基因有關(guān)[52-53], 值得進(jìn)一步研究。此外有研究認(rèn)為, 1E染色體帶有編碼種子儲藏蛋白基因, 將1E染色體導(dǎo)入小麥并替代對面包制作品質(zhì)具有消極影響的1A染色體, 將可能提高小麥成品品質(zhì)[45]。Kumar等[54]將1E染色體長臂替換掉對面團(tuán)筋力有減弱或消極影響的1A長臂, 創(chuàng)制出普通小麥–長穗偃麥草1AS-1EL易位系, 從而使面團(tuán)筋力得以提高。因此, 對硬粒小麥–長穗偃麥草易位系Du-T1AS·1EL中的種子儲藏蛋白特性進(jìn)行研究, 將有利于Du-T1AS·1EL作為中間材料應(yīng)用到小麥加工品質(zhì)性狀的遺傳改良中。

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附圖1 基于中國春-長穂偃麥草附加系中的擴(kuò)增結(jié)果選擇染色體特異分子標(biāo)記

Fig. S1 Selection of chromosomal-specific molecular markers based on the amplification results in CS-addition lines

M: DL2501 marker; 1~7: 中國春-長穗偃麥草1E-7E附加系; 8:(2); 9: Ld; 10: CS; 11: 8801。標(biāo)記依次為: CSM-1E-1, CSM-2E-1, CSM-3E-5, CSM-4E-1, CSM-5E-1, CSM-6E-2, CSM-7E-1, GSM-2。

M: DL2501 marker; 1–7:1E-7E addition lines; 8:(2); 9: Ld; 10: CS; 11: 8801. Specific markers: CSM-1E-1, CSM-2E-1, CSM-3E-5, CSM-4E-1, CSM-5E-1, CSM-6E-2, CSM-7E-1, GSM-2.

附圖2 1E染色體特異分子標(biāo)記在中國春-長穂偃麥草1E端體附加系中的擴(kuò)增結(jié)果

Fig. S2 PCR amplification of the 1E chromosome-specific molecular markers in CS-1E telodisomic addition lines

M: DL2501 marker; a: 標(biāo)記CSM-1E-3, 擴(kuò)增1E長臂(1EL); b: 標(biāo)記CSM-1E-4, 擴(kuò)增1E短臂(1ES)。1: 中國春-長穂偃麥草1E附加系(DA1E); 2: 中國春-長穂偃麥草1EL端體附加系(DA1EL); 3: 中國春-長穂偃麥草1ES端體附加系(DA1ES); 4: 長穂偃麥草(2); 5: Ld。

M: DL2501 marker; a: CSM-1E-3, amplified the long arm of the 1E chromosome (1EL); b: CSM-1E-3, amplified the short arm of the 1E chromosome (1ES). 1: CS1E addition line; 2: CS1EL telodisomic addition line (DA1EL); 3: CS1ES telodisomic addition line (DA1ES); 4:(2); 5: Ld.

Creation of disomic addition, substitution and translocation lines of durum wheat-

DUAN Ya-Mei1,2, LUO Xian-Lei2, CHEN Shi-Qiang3, GAO Yong2, CHEN Jian-Min1, 2,*, and DAI Yi1,*

1Institute of Agricultural Science and Technology Development / Joint International Research Laboratory of Agriculture & Agri-Product Safety of MOE, Yangzhou University, Yangzhou 225009, Jiangsu, China;2College of Bioscience and Biotechnology / Co-Innovation Center for Modern Production Technology of Grain Crops, Yangzhou University, Yangzhou 225009, Jiangsu, China;3Institute of Agricultural Sciences, Lixia River Region, Yangzhou 225009, Jiangsu, China

The establishment of chromosome addition, substitution and translocation lines through distant hybridization between wheat andis an important approach to utilize useful genes ofin wheat improvement. Based on chromosome-specific molecular markers, chromosome counting, genomehybridization (GISH), and non-denaturing fluorescencehybridization (ND-FISH), several stable addition, substitution or translocation lines were identified from a cross betweenssp.Langdon (AABB) and8801 (AABBEE). Two 3E and 6E disomic addition lines Du-DA3E and Du-DA6E of durum wheat-, a 1E (1B) disomic substitution line Du-DS1E (1B), and a 1AS-1EL disomic translocation line Du-T1AS·1EL were created in this study. The chromosome-segments ofcould be inherited stably in these new lines, which not only increased the types of addition and substitution lines of durum wheat, but also provided special germplasm resources for the follow-up use of excellent genes ofin wheat improvement.

;; addition line; substitution line; translocation line

10.3724/SP.J.1006.2021.01072

本研究由江蘇省自然科學(xué)基金項目(BK20180908, BK20181213)和揚州市自然科學(xué)基金項目(YZ2018097)資助。

This research was supported by the Natural Science Foundation of Jiangsu (BK20180908, BK20181213) and the Natural Science Foundation of Yangzhou (YZ2018097).

戴毅, E-mail: daiyi@yzu.edu.cn; 陳建民, E-mail: jmchen@yzu.edu.cn

E-mail: 834630650@qq.com

2020-09-04;

2020-12-02;

2020-12-28.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20201228.0946.004.html