艾納香油對(duì)NF-κB及Nrf2/HO-1信號(hào)通路的作用研究

王萬(wàn)林，高 月，廖加美，彭俊超，蔡亞玲，易 瓊，王 魯*

(1.貴州省生化工程中心，貴陽(yáng) 550025； 2.貴州大學(xué)藥學(xué)院，貴陽(yáng) 550025；3. 西南特色藥用生物資源開(kāi)發(fā)利用教育部工程研究中心，貴陽(yáng) 550025)

炎癥是動(dòng)物機(jī)體中一種最重要的保護(hù)和防御性反應(yīng)，大多數(shù)動(dòng)物疾病都與炎癥有關(guān)，特別是一些感染性疾病，例如仔豬腸炎、牛乳腺炎等，盡管病因不同，但發(fā)病學(xué)基礎(chǔ)是一致的。研究表明，核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活化與炎癥的發(fā)生密切相關(guān)，其誘導(dǎo)炎性因子IL-1β、TNF-α、COX-2[1]、NO和炎癥介質(zhì)PGE2等的表達(dá)[2]，放大炎癥反應(yīng)、打破花生四烯酸平衡[3]以促進(jìn)5-LOX產(chǎn)生LTB4，引起機(jī)體紅腫熱痛和氧化應(yīng)激異常[4]，而機(jī)體對(duì)炎癥的調(diào)節(jié)可以通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子Nrf2/HO-1實(shí)現(xiàn)細(xì)胞免受炎癥和氧化損傷[5]，該過(guò)程增加表達(dá)會(huì)使血紅素產(chǎn)生膽綠素，同時(shí)增加Fe2+和低濃度CO來(lái)緩和促炎因子TNF-α和 IL-1β表達(dá)，目前，Nrf2/HO-1的免疫調(diào)節(jié)性使其成為治療炎癥性疾病的重要藥物靶點(diǎn)。在動(dòng)物疾病治療中，中藥比化藥更健康和安全，同時(shí)中藥更加符合綠色經(jīng)濟(jì)發(fā)展，艾納香油是植物艾納香(Blumeabalsamifera(L.)DC)提取的精油(BBO)，多產(chǎn)于中國(guó)西南部，據(jù)《現(xiàn)代本草綱目》記載，其具有清熱明目、解毒消腫等功效[6]，目前的研究表明，BBO在預(yù)防皮膚老化[7]、抗菌[8-9]、抗炎[10]等方面有不錯(cuò)的效果，其可以緩解炎癥發(fā)生，但對(duì)于BBO的抗炎作用機(jī)制未見(jiàn)深入研究，特別是涉及的炎性信號(hào)通路方面未見(jiàn)報(bào)道。

本研究采用LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎性模型，考察炎性因子以及NF-κB和Nrf2/HO-1通路相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)深入探究BBO的抗炎效果，并首次解釋其可能的抗炎機(jī)制，為BBO在獸用抗炎藥上的合理開(kāi)發(fā)打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

BBO由貴州艾力康中草藥開(kāi)發(fā)有限公司惠贈(zèng)(前期利用GC-MS分析了其化學(xué)組成[8]，主要成分及占比為左旋龍腦25.382%、反式石竹烯24.439%、石竹烯氧化物5.843%、花椒素3.968%、芳樟醇1.655%等)；RAW264.7細(xì)胞購(gòu)于昆明細(xì)胞庫(kù)(編號(hào):KCB200603YJ)；LPS (血清型O11:B4) 購(gòu)自Sigma公司；胎牛血清購(gòu)自Gibco公司(貨號(hào)：21100-212)；DMEM 購(gòu)自Hyclone公司(貨號(hào)：11965092)；細(xì)胞凋亡試劑盒C1056、細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒P0027和PMSF100 mM本甲磺酰胺試劑(ST506)均購(gòu)于碧云天試劑公司；PGE2(YM0603Mo)、LTB4(JYM0535Mo)、IL-1β(JYM0531Mo)和TNF-α(JYM0218Mo)ELISA試劑盒均購(gòu)自武漢基因美生物科技公司；NO(A012-1-2)和iNOS (A014-1-1)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；RNApure、FastKing gDNA RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)于天根試劑公司；細(xì)胞總蛋白提取裂解液(10×RIPA buffer)和p-p65(93H1)、p-IKKα/β(16A6)、IKKα(3G12)、HO-1(E3F4S)、COX-2(DH5H) 抗體均購(gòu)于美國(guó)CST生物科技公司；p65(YT3107)、5-LOX(YT0027)、p-IκB-α(YP0151)、IκB-α(YP2417)、Nrf2(YT3189)、β-actin(YM3138)、內(nèi)參組蛋白H3(K80)、HRP標(biāo)記二抗抗體均購(gòu)自ImmunoWay生物技術(shù)公司；ECL發(fā)光試劑購(gòu)自BIO-RAD公司。

1.2 主要儀器

Multiscan GO酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)；PowerUp SYBRTM Green熒光定量PCR儀(賽默飛公司)；UVP Touch System化學(xué)發(fā)光成像儀(德國(guó)耶拿Analytik jena)；IX-71倒置相差熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3 MTS法檢測(cè)BBO的細(xì)胞毒性

RAW264.7細(xì)胞使用含10% FBS胎牛血清、1% 雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。試驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的RAW264.7細(xì)胞以1×104個(gè)·mL-1密度鋪于96孔板，每孔加入100 μL細(xì)胞，正常貼壁培養(yǎng)6 h后，設(shè)立BBO終濃度分別為0、20、40、60、80、120 μg·mL-1的各組作為不加LPS共培養(yǎng)劑量組(其中BBO配制：BBO 100 mg加入50 mg吐溫-80 ℃渦旋，用滅菌水溶解為100 mg·mL-1母液)、設(shè)立BBO終濃度分別為0、20、40、60、80、120 μg·mL-1的各組+LPS終濃度500 ng·mL-1共培養(yǎng)作為加LPS共培養(yǎng)試驗(yàn)組，共12組，每組設(shè)立3個(gè)重復(fù)孔。加入藥物正常培養(yǎng)24 h，加入20 μL MTS后繼續(xù)37 ℃培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)量各孔吸光值，檢測(cè)細(xì)胞毒性。

1.4 Hoechst 33342和PI雙染檢測(cè)BBO對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

按參考文獻(xiàn)[11]操作，將RAW264.7細(xì)胞以6× 105個(gè)·mL-1密度進(jìn)行12孔板鋪板，正常培養(yǎng)6 h后加藥。試驗(yàn)分組：空白對(duì)照組、80 μg·mL-1終濃度BBO陰性對(duì)照組、500 ng·mL-1終濃度LPS+(40、60、80 μg·mL-1)終濃度BBO治療組、500 ng·mL-1的LPS模型組，每組重復(fù)3個(gè)孔，正常培養(yǎng)16 h后進(jìn)行試驗(yàn)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合度80%時(shí)，將每組用冰冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，4 ℃下將細(xì)胞置于5 μg·mL-1Hoechst 33342和2 μg·mL-1PI 中避光染色15 min之后，在10×倒置熒光顯微鏡下捕獲熒光激發(fā)圖像，同時(shí)將每組的復(fù)孔細(xì)胞用20×倒置相差顯微鏡觀察記錄細(xì)胞形態(tài)變化。

1.5 ELISA和分光光度法檢測(cè)BBO對(duì)LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌IL-1β、TNF-α、PGE2、LTB4、NO含量及iNOS活力的影響

細(xì)胞處理和分組同上，收集各孔細(xì)胞上清液。根據(jù)ELISA試劑盒的操作說(shuō)明依次檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中PGE2、LTB4、TNF-α、IL-1β含量，采用分光光度計(jì)法檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中NO含量及iNOS 活力，每孔3個(gè)重復(fù)。評(píng)價(jià)BBO對(duì)炎性RAW264.7細(xì)胞分泌PGE2、LTB4、TNF-α、IL-1β、NO水平及iNOS活力的影響。

1.6 RT-PCR檢測(cè)BBO對(duì)細(xì)胞TNF-α、IL-1β mRNA表達(dá)水平的影響

參考“1.4”中操作,用6孔板培養(yǎng)細(xì)胞和分組。根據(jù)RNApure組織細(xì)胞試劑盒提取總RNA，測(cè)定濃度后，用FastKing gDNA RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，RT-PCR檢測(cè)目的基因mRNA水平。每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，GAPDH為內(nèi)參。PCR反應(yīng)體系：PCR Master Mix 12.0 μL, Primer1 1.8 μL, Primer2 1.8 μL， cDNA模板3 μL，ddH2O補(bǔ)至30 μL。 PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 預(yù)變性2 min；95 ℃ 變性15 s，60 ℃ 退火延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)；12 ℃ 保溫40 min。各基因相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt表示，實(shí)時(shí)定量PCR的引物序列如表1所示。

1.7 Western blotting檢測(cè)BBO對(duì)NF-κB及Nrf2/HO-1信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白水平的影響

細(xì)胞分組和處理同上，用含有PMSF的裂解緩沖液從細(xì)胞中提取總蛋白，細(xì)胞核蛋白按Beyotime核漿提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行提取，用BCA蛋白分析試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。試驗(yàn)以每孔40～100 μg蛋白量上樣電泳，經(jīng)120 V電壓轉(zhuǎn)移到0.22 μm PVDF膜上后用5%脫脂牛奶在室溫下持續(xù)搖晃封閉膜1 h。然后用5%脫脂牛奶及5% BSA分別稀釋p-P65/P65抗體(1∶1 000)、p-IKKα/β/IKKα抗體(1∶1 000)、COX-2抗體(1∶1 000)、5-LOX抗體(1∶1 000)、p-IκB-α/IκB-α抗體(1∶1 000)、HO-1抗體(1∶500)、Nrf2抗體(1∶1 000)、β-actin抗體(1∶2 000)、組蛋白H3抗體(1∶1 000)，并與膜在4 ℃ 過(guò)夜孵育16 h。TBST中洗滌6 min × 3次后將膜與二抗室溫孵育1 h，TBST中洗滌6 min×3次 后ECL試劑顯色，在Analytik Jena UVP ChemStudio工作站記錄曝光條帶灰度值A(chǔ)。細(xì)胞質(zhì)和總蛋白以β-actin為內(nèi)參，核蛋白以組蛋白H3為內(nèi)參，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，試驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 RT-PCR引物序列

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 BBO對(duì)RAW264.7細(xì)胞毒性的確定

如圖1A所示，0～120 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)的BBO分別添加或不添加LPS(500 ng·mL-1)共培養(yǎng)時(shí)，BBO對(duì)RAW264.7細(xì)胞均無(wú)明顯毒性或毒性不顯著(P>0.05)。以此作為標(biāo)準(zhǔn)，后續(xù)BBO選擇40、60、80 μg·mL-1作為試驗(yàn)濃度。

2.2 BBO對(duì)炎性RAW264.7細(xì)胞形態(tài)及凋亡的影響

通過(guò)熒光倒置顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)以及細(xì)胞凋亡情況，如圖1C、1D顯示，在LPS刺激細(xì)胞16 h后，RAW264.7細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生改變，損傷細(xì)胞(PI)與總細(xì)胞(Hochest33342)的比率與對(duì)照組相比極顯著增加(P<0.01)；如圖1B所示，在0～80 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)BBO治療細(xì)胞后以劑量依賴的方式顯著降低了這一比率，其中BBO中高劑量可以極顯著降低該比率(P<0.01)，并扭轉(zhuǎn)LPS導(dǎo)致的細(xì)胞變形?？傮w來(lái)說(shuō)，圖1結(jié)果表明，BBO在40～80 μg·mL-1劑量對(duì)LPS刺激的RAW 264.7細(xì)胞凋亡和形變有明顯的抑制作用。

2.3 BBO對(duì)炎性RAW264.7細(xì)胞分泌PGE2、LTB4、TNF-α、IL-1β、NO水平及iNOS活力的影響

PGE2、IL-1β、NO、TNF-α等是炎癥發(fā)生的重要標(biāo)志性產(chǎn)物。如圖2所示，相對(duì)于空白對(duì)照組，LPS刺激會(huì)使RAW264.7細(xì)胞極顯著的增加PGE2、LTB4、IL-1β、NO、TNF-α分泌水平及iNOS活力(P<0.01)； 與LPS模型組相比，60～80 μg·mL-1中高劑量BBO可以極顯著降低PGE2、LTB4、IL-1β、 TNF-α、NO的產(chǎn)生量(P<0.01)，并呈現(xiàn)濃度依賴性關(guān)系，并極顯著抑制iNOS活力(P<0.01)。

2.4 BBO對(duì)炎性RAW264.7細(xì)胞IL-1β、TNF-α mRNA表達(dá)的影響

如圖3所示，與空白對(duì)照組相比較，LPS誘導(dǎo)細(xì)胞后IL-1β、TNF-αmRNA表達(dá)極顯著增加(P<0.01)；與LPS模型組相比，中高劑量的BBO可以極顯著抑制IL-1β、TNF-αmRNA表達(dá)(P<0.01)。

2.5 BBO抑制炎性RAW264.7細(xì)胞中COX-2、5-LOX和NF-κB相關(guān)蛋白表達(dá)

如圖4所示，與空白對(duì)照組相比，LPS處理細(xì)胞后細(xì)胞中p-P65、p-IKKα/β、p-IκB-α、COX-2、5-LOX蛋白相對(duì)水平極顯著增加(P<0.01)，IκB-α蛋白相對(duì)水平極顯著下調(diào)(P<0.01)；與LPS模型組相比，60～80 μg·mL-1劑量的BBO可以極顯著抑制IKKα/β(4B)、IκB-α(4C)、P65(4D)蛋白的磷酸化和COX-2(4F)、5-LOX(4G)蛋白表達(dá)(P<0.01)， 并極顯著抑制IκB-α(4E)蛋白的降解(P<0.01)。

2.6 BBO促進(jìn)炎性RAW264.7細(xì)胞的Nrf2/HO-1相關(guān)蛋白表達(dá)

如圖5所示，與空白組相比，LPS處理后細(xì)胞質(zhì)中Nrf2極顯著增加(P<0.01)，細(xì)胞核中Nrf2少量減少，HO-1蛋白表達(dá)未見(jiàn)明顯變化；與LPS組相比，60～80 μg·mL-1劑量BBO可以極顯著減少細(xì)胞質(zhì)中Nrf2的蛋白水平(P<0.01)，并極顯著增加細(xì)胞核中Nrf2以及總HO-1蛋白表達(dá)(P<0.01)；與0 h相比，24 h內(nèi)BBO以時(shí)間依賴性增加HO-1蛋白表達(dá)，其中4～8 h為顯著增加(P<0.05)，12～24 h為極顯著增加(P<0.01)。

3 討 論

炎癥是機(jī)體對(duì)外源物引起的感染和刺激做出的正常防御性免疫反應(yīng)，多數(shù)情況下，當(dāng)機(jī)體在接觸病原體后，細(xì)胞會(huì)通過(guò)程序性死亡來(lái)阻止病原體在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制增殖，同時(shí)細(xì)胞死亡會(huì)啟動(dòng)炎癥放大反應(yīng)[12]，釋放細(xì)胞膜破裂和內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)，使轉(zhuǎn)錄因子如NF-κB活化并誘導(dǎo)促炎因子表達(dá)，從而導(dǎo)致炎癥發(fā)展[13]。花生四烯酸限速酶COX-2、5-LOX[14]控制白三烯LTs、前列腺素PGs、血栓素TXs等炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生[15]，它們廣泛參與機(jī)體的炎癥及癌癥發(fā)展[16]和呼吸系統(tǒng)[17]等的調(diào)節(jié)，最近，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，5-LOX與炎癥相關(guān)基因P65等相互作用[18]，其可能會(huì)促進(jìn)NF-κB的激活，而目前5-LOX/COX-2雙重抑制劑在有效控制炎癥方面發(fā)揮著很大的作用。當(dāng)受到刺激時(shí)，免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞會(huì)從規(guī)則的圓形變成不規(guī)則的分支形狀[19]，加速導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和壞死。本研究中，不同濃度BBO可以減輕LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，并緩解細(xì)胞凋亡的發(fā)生比例，還能有效抑制LPS誘導(dǎo)的COX-2、5-LOX蛋白表達(dá)，以減少炎癥介質(zhì)PGE2、LTB4產(chǎn)生。

NF-κB途徑的紊亂激活是許多自身免疫性、炎癥性疾病[20]、癌癥[21]的發(fā)病機(jī)制之一，并調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[22]，抑制該途徑可實(shí)現(xiàn)抗炎作用[23]。NF-κB信號(hào)傳遞以P65磷酸化入核引起炎癥因子IL-1β、TNF-α、COX-2、iNOS等的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)，增加NO及LTB4、PGE2的分泌，加劇炎癥。IκBα是P65磷酸化的抑制基因，IκBα磷酸化會(huì)釋放P65入核。而IKKα負(fù)責(zé)IκBα的激活和非經(jīng)典NF-κB途徑激活[24]，控制炎癥和惡性腫瘤發(fā)生[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS刺激后RAW264.7細(xì)胞中NF-κB相關(guān)基因明顯激活磷酸化，導(dǎo)致炎性因子和炎癥介質(zhì)過(guò)度分泌，在BBO干預(yù)下能顯著抑制LPS誘導(dǎo)的IKKα、IκBα、P65磷酸化，并阻止IκBα的解離，進(jìn)而控制NF-κB核轉(zhuǎn)錄及下游炎癥因子的啟動(dòng)，減少IL-1β、TNF-α、COX-2的產(chǎn)生及iNOS的激活。

Nrf2是氧化應(yīng)激的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，炎癥會(huì)加劇氧化應(yīng)激，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和受損發(fā)生[26]。暴露于應(yīng)激源時(shí)，Nrf2解離并遷移到細(xì)胞核促進(jìn)抗氧化酶HO-1的表達(dá)[27]，而HO-1在抗氧化和炎癥刺激的細(xì)胞防御機(jī)制中參與促炎因子iNOS、NO和COX-2等的產(chǎn)生，增加HO-1的表達(dá)可以抑制細(xì)胞損傷和凋亡[28]，并阻斷NF-κB依賴的轉(zhuǎn)錄機(jī)制[29]。研究證明，雙氫青蒿素可通過(guò)Nrf2調(diào)節(jié)LPS引起氧化應(yīng)激[30]，同時(shí)，最近的研究證實(shí)，烏司他丁[31]、哌泊索侖[32]、鄰苯二酚[33]、Sageretia[34]等藥物也可通過(guò)增加Nrf2/HO-1水平來(lái)抑制NF-κB激活[35]而減少促炎因子和炎癥介質(zhì)的分泌。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，BBO可上調(diào)Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核，進(jìn)而以劑量和時(shí)間依賴的方式啟動(dòng)HO-1的表達(dá)，減少氧化應(yīng)激對(duì)炎癥的促進(jìn)作用，實(shí)現(xiàn)減少細(xì)胞炎癥和細(xì)胞死亡發(fā)生。但是，Nrf2/HO-1是否為關(guān)鍵抗炎途徑還需要進(jìn)一步基因沉默驗(yàn)證，同時(shí)BBO中成分復(fù)雜，主要包括左旋龍腦、反式石竹烯、樟腦、石竹烯氧化物、香樹(shù)烯、花椒素、芳樟醇[36]、有機(jī)酸[37]等，這使我們對(duì)BBO中發(fā)揮抗炎作用的成分歸屬問(wèn)題產(chǎn)生興趣，而據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，芳樟醇有潛在抗炎活性[38]，但其是否就是BBO發(fā)揮抗炎效果的主要成分也有待進(jìn)一步成分加減配方驗(yàn)證，由于體內(nèi)代謝的復(fù)雜性使得BBO抗炎效果也需要進(jìn)一步在動(dòng)物模型試驗(yàn)中驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，作為中藥艾納香提取物的BBO，其一定劑量?jī)?nèi)可以抑制細(xì)胞炎性和凋亡發(fā)生，并抑制NF-κB中關(guān)鍵蛋白磷酸化，同時(shí)促進(jìn)抗炎基因Nrf2/HO-1的蛋白表達(dá)，減少炎性因子及炎癥介質(zhì)的釋放。本研究結(jié)果為BBO抗炎的細(xì)胞機(jī)制提供了全新的研究途徑，也為其臨床預(yù)防LPS所引起的炎癥性疾病提供了理論依據(jù)，在其獸用抗炎方面也提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。