復方青香膠囊微生物限度檢查方法的建立和驗證

郝媛，姚敏娜，王昱錦

空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院，陜西 西安 710032

復方青香膠囊為西京醫(yī)院自制制劑，處方由枳殼、川芎、石菖蒲、甘草等11 味中藥組成，具有調(diào)經(jīng)止痛、消積化滯作用，用于治療乳腺增生、乳腺腫痛及乳腺腺瘤等癥。中藥復方制劑，主要成分復雜多樣、成分間易于產(chǎn)生相互作用等特性，使研究者很難直接從藥名或處方組成判斷制劑是否有抑菌作用［1］,而微生物限度檢查的核心關(guān)鍵點就是去除藥品的抑菌性干擾［2］。考慮中藥復方制劑上述特點，按照 2015 版《中國藥典》四部要求，建立并驗證了復方青香膠囊的微生物限度檢查方法。

1 儀器材料與試藥

1.1 儀器

SPX-150 生化培養(yǎng)箱（上海揚州慧科電子有限公司）；BMJ-250C 霉菌培養(yǎng)箱（上海迅博實業(yè)有限公司）；LRH-250A 生化培養(yǎng)箱（韶關(guān)市宏泰醫(yī)療器械有限公司）；BHC1300IIA2 生物安全柜（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；BSP-250 生化培養(yǎng)箱（上海迅博實業(yè)有限公司）。

1.2 試劑、試藥及培養(yǎng)基

復方青香膠囊（第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院,批號：160706、160803、160830；規(guī)格：0.38 g）。胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，批號：160316；腸道菌增菌液體培養(yǎng)基，批號：160114；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，批號：160106；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，批號：160405；沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基，批號：160316；木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基，批號：160215；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，批號：160129；紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，批號：160314；RV 沙門菌增菌液體培養(yǎng)基，批號：160318；三糖 鐵瓊脂培養(yǎng)基，批號：160106；麥康凱液體培養(yǎng)基，批號：160229。上述培養(yǎng)基均源自北京陸橋技術(shù)有限責任公司。氯化鈉，天津科密歐化學試劑有限公司。

1.3 工作菌株

金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003］；白色念珠菌［CMCC（F）98001］；銅綠假單胞菌［CMCC（B）10104］；大腸埃希菌［CMCC（B）44102］；枯草芽孢桿菌［CMCC（B）63501］；黑曲霉［CMCC（F）98003］；乙型副傷寒沙門菌［CMCC（B）50094］。上述標準菌株為第3 代，皆由中國食品藥品檢定研究院提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)測定方法的建立及驗證

2.1.1 菌懸液的制備按照2015 版《中國藥典》四部通則1105 項下規(guī)定的菌液制備方法，以0.9%無菌氯化鈉溶液為稀釋液，制備100～10 000 cfu/mL 的金黃色葡萄球菌菌懸液、白色念珠菌菌懸液、銅綠假單胞菌菌懸液、黑曲霉孢子懸液和枯草芽孢桿菌菌懸液［3］。

2.1.2 供試液的制備取復方青香膠囊10 g，加入到胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，至100 mL，45 ℃水浴并加以震蕩，制成1∶10 的供試液。后以胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基為稀釋液，制備1∶20、1∶50、1∶100稀釋級別的供試液，備用。

2.1.3 平皿法回收率試驗組：分別加入0.1 mL“2.1.1”項下菌懸液至 9.9 mL“2.1.2”項下供試液及各稀釋級別供試液，充分搖勻，使1 mL 供試品溶液中含菌數(shù)≤100 cfu，注皿，1 mL/皿（直徑90 mm）；每一種稀釋級別供試液的試驗組平行制備2 皿，按照表1 和表2 的要求進行。

菌液對照組：分別加入0.1 mL“2.1.1”項下菌懸液至9.9 mL 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，充分搖勻，注皿，1 mL/皿（直徑90 mm）；菌液對照組平行制備2 皿，按照表1 和表2 的要求進行。

供試品對照組：分別加入0.1 mL 稀釋液至9.9 mL“2.1.2”項下供試液及各稀釋級別供試液，充分搖勻，注皿，1 mL/皿（直徑90 mm）；每一種稀釋級別供試液的供試品對照組平行制備2 皿，按照表1 和表2 的要求進行。

上述注皿完成后，采用胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基澆注需氧菌總數(shù)平皿，搖勻，置于生化培養(yǎng)箱中，35 ℃培養(yǎng)3 d。采用沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基澆注霉菌和酵母菌總數(shù)平皿，搖勻，置于生化培養(yǎng)箱中，25 ℃培養(yǎng)5 d。按照2015 版《中國藥典》要求進行計數(shù)。

當0.5 ≤R ≤2，該方法可行［4-5］。

2.1.4 計數(shù)方法適用性試驗研究需氧菌總數(shù)以金黃色葡萄球菌進行計數(shù)加菌預試驗；霉菌和酵母菌總數(shù)以白色念珠菌進行計數(shù)加菌預試驗，結(jié)果見表1～2。

表1 需氧菌總數(shù)預試驗結(jié)果（金黃色葡萄球菌）

表2 霉菌和酵母菌總數(shù)預試驗結(jié)果（白色念珠菌）

表1 結(jié)果表明：常規(guī)法復方青香膠囊抑制金黃色葡萄球菌生長，供試液濃度為1∶20 時，可使回收比值R 符合0.5 ≤R ≤2，消除其抑菌性；預計該稀釋方法可以消除本品對需氧菌的抑制作用。

表2 結(jié)果表明：1∶10 供試液組回收比值R 為0.86，符合0.5 ≤R ≤2，預計采用常規(guī)方法可進行本品霉菌和酵母菌總數(shù)測定。

2.1.5 需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)方法的驗證取復方青香膠囊，以1∶20 供試液進行需氧菌總數(shù)5 種菌加菌回收試驗；用常規(guī)法進行霉菌及酵母菌總數(shù)2 種菌加菌回收試驗，進行3 次獨立試驗，結(jié)果見表3。

表3 復方青香膠囊回收比值試驗結(jié)果

三次獨立加菌回收試驗結(jié)果表明：（1）復方青香膠囊需氧菌總數(shù)測定采用供試品溶液稀釋法（1∶20），規(guī)定的五種試驗菌回收比值R 符合0.5 ≤R ≤2，可用此法。（2）復方青香膠囊霉菌及酵母菌總數(shù)的測定采用常規(guī)法，規(guī)定的兩種試驗菌回收比值R 符合0.5 ≤R ≤2，可用此法。

2.2 控制菌檢查方法的建立及驗證

2.2.1 檢查依據(jù)制備工藝中“枳殼、川芎烘干，粉碎過100 目篩”“細粉和余下藥材水提濃縮后清膏混勻、粉碎、分裝”可知，復方青香膠囊為非無菌含藥材原粉的中藥制劑，按2015 年版《中國藥典》四部微生物限度要求，控制菌應查大腸埃希菌、耐膽鹽革蘭陰性菌及沙門菌［6］。

2.2.2 菌液制備按2015 年版《中國藥典》四部通則1106 項下規(guī)定的菌液制備方法，以0.9%無菌氯化鈉溶液為稀釋液，制備不大于100 cfu/mL 的大腸埃希菌菌懸液、銅綠假單胞菌菌懸液和乙型副傷寒沙門菌菌懸液［3］。

2.2.3 大腸埃希菌檢查法試驗組取2.1.2 項下1∶10供試液10 mL 加入至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基100 mL中，并加入≤100 cfu（菌液體積＜1 mL）的大腸埃希菌，混勻；供試液組：取2.1.2 項下1∶10 供試液10 mL 加入至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基100 mL 中；陰性對照組：取稀釋液10 mL，加入至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基100 mL 中。按照藥典要求，完成大腸埃希菌的選擇和分離培養(yǎng)、結(jié)果判斷。進行2 次獨立試驗，結(jié)果見表4。試驗結(jié)果表明：可用常規(guī)法進行本品大腸埃希菌檢查。

2.2.4 耐膽鹽革蘭陰性菌檢查法供試液預培養(yǎng)：取2.1.2 項下1∶10 供試液23 ℃培養(yǎng)2 h。試驗組：取上述預培養(yǎng)液10 mL，加入至100 mL 腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中，平行制備2 份，一份加入≤100 cfu 的大腸埃希菌液（菌液體積＜1 mL），混勻，另一份加入≤100 cfu 的銅綠假單胞菌（菌液體積＜1 mL），混勻；供試液組：取上述預培養(yǎng)液10 mL，加入至100 mL 腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中，混勻；陰性對照組：取稀釋液10 mL 加入至100 mL 腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中，混勻。按照藥典要求，完成耐膽鹽革蘭陰性菌的定性試驗、結(jié)果判斷。進行2 次獨立試驗，結(jié)果見表4。試驗結(jié)果表明：可用常規(guī)法進行本品耐膽鹽革蘭陰性菌檢查。

2.2.5 沙門菌檢查法試驗組：供試品10 g 加入胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，至100 mL，45℃水浴振蕩15 min，同時加入≤100 cfu 的沙門菌（菌液體積＜1 mL），混勻；供試液組：供試品10 g 加入胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，至100 mL，45 ℃水浴振蕩15 min；陰性對照組：加胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基100 mL；按照藥典要求，完成沙門菌的選擇和分離培養(yǎng)、結(jié)果判斷。進行2 次獨立試驗，結(jié)果見表4。試驗結(jié)果表明：可用常規(guī)法進行本品沙門菌檢查。

表4 控制菌檢查方法適用性試驗結(jié)果

結(jié)果表明：可采用常規(guī)法進行復方青香膠囊控制菌檢查。

3 討論

中藥復方制劑，主要成分復雜多樣、成分間易于產(chǎn)生相互作用等特性，很難直接從藥名或處方組成判斷制劑是否有抑菌作用，必須通過試驗逐步驗證微生物限度檢查方法的適用性［1］。查閱文獻，梁卉等［7］證實枳殼和麩炒枳殼揮發(fā)油對金黃色葡萄球菌有較強抑菌活性，對大腸桿菌和表皮葡萄菌有中等抑菌活性，對白色念珠菌有較弱抑菌活性。何曉利［8］發(fā)現(xiàn)四種川芎提取液都有抑菌效果?，F(xiàn)代藥理研究表明石菖蒲具有抑菌抗炎作用［9］。文獻資料提示復方青香膠囊可能有抑菌活性，為去除可能存在的抑菌性干擾。2015 藥典提示可采用下述方法消除供試品的抑菌性：（1）增加稀釋液或培養(yǎng)基體積；（2）加入中和劑或滅菌劑；（3）薄膜過濾法；（4）上述方法聯(lián)用［3］。實際操作中，中和法的特點在于，雖藥典中提供了常見中和劑用于消除干擾物的抑菌活性，但中藥復方制劑處方工藝較為復雜，干擾成分較易產(chǎn)生且不易從藥名或處方組成直接推出干擾物及干擾物分類，使得中和劑的選擇不像單一化藥成分的中和劑選擇那樣簡單。薄膜過濾法特點在于，雖其對抑菌作用的消除效果最好且計數(shù)更加準確，但大多數(shù)中成藥固體制劑，處方中不溶性成分較多，操作中容易出現(xiàn)藥渣堵膜現(xiàn)象［1］。蘇潤萍［10］也提供了消除抑菌性干擾的方法優(yōu)先排序:常規(guī)法—稀釋法—中和法—薄膜過濾法—幾種方法聯(lián)合使用。實際操作中，應通過循序漸進的方法逐步去驗證檢查方法的適用性。

查閱文獻了解試藥各主要成分的抑菌作用，發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌為需氧菌中相對敏感菌株，白色念珠菌為霉菌和酵母菌中相對敏感菌株，方法適用性試驗中，分別以金黃色葡萄球和白色念珠菌進行需氧菌總數(shù)和霉菌、酵母菌總數(shù)計數(shù)加菌預試驗，初步確定供試液稀釋級別，再進行7 種菌加菌回收試驗，簡化了操作步驟，減少工作量，優(yōu)化了檢查方法［11］。

復方青香膠囊中枳殼、川芎等藥材為中藥原粉入藥，藥典規(guī)定控制菌需檢查耐膽鹽革蘭陰性菌。此時，選擇胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基為稀釋液，菌落計數(shù)及控制菌檢查可共用1 份供試品溶液，提高實驗效率［12］。

加菌方式方面，在樣品環(huán)節(jié)加菌，吸取9.9 mL適宜稀釋度的供試液，加入0.1 mL 菌懸液，混勻，再注皿。優(yōu)于在培養(yǎng)基環(huán)節(jié)加菌［13-14］。

在對試驗數(shù)據(jù)進行分析時，發(fā)現(xiàn)表1、表2 中，供試液不同稀釋級別下，供試品對照組測定值相同，但并不能因此簡化只做一次培養(yǎng)計數(shù)。實驗過程中，同一試驗菌供試液不同稀釋級別下，需要分設(shè)供試品對照組，進行培養(yǎng)及菌落計數(shù)。原因如下：高濃度時，當供試品本身有抑菌性且被微生物污染時，本身的抑菌性可能控制了污染微生物的生長，使供試品對照組菌落計數(shù)值為某低值，低濃度時，供試品內(nèi)污染微生物的生存環(huán)境產(chǎn)生巨大變化，可能引起自身復蘇繁殖，使此濃度下供試品對照組菌落計數(shù)值發(fā)生改變?yōu)槟掣咧?。最終供試液不同稀釋級別下，供試品對照組測定值不同，需要分別進行培養(yǎng)及菌落計數(shù)。而菌液對照組不存在這種干擾，供試液不同稀釋級別下，菌液組只需進行一次培養(yǎng)、菌落計數(shù)（平行制備2 皿取均值）。

文章定稿時，2020 版《中國藥典》出版不久，筆者做了詳細比對，本文所建立的該試藥的微生物限度檢查方法完全符合2020 版要求［15］。2020 年12 月新版藥典實施，可用此法進行復方青香膠囊的微生物限度檢查。