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    藥品雜質(zhì)遺傳毒性評價(jià)的概述

    2021-04-27 00:44:50張玉英李薇潘衛(wèi)松
    藥品評價(jià) 2021年4期
    關(guān)鍵詞:雜質(zhì)毒性遺傳

    張玉英,李薇,潘衛(wèi)松

    1.廣州市藥品檢驗(yàn)所,廣東省藥監(jiān)局緩控釋制劑質(zhì)量分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510160;2.暨南大學(xué)藥學(xué)院,廣東廣州 510632;3.武漢藥品醫(yī)療器械檢驗(yàn)所,湖北 武漢 430074

    雜質(zhì)是指在藥品生產(chǎn)、運(yùn)輸、貯藏等過程中產(chǎn)生或引入影響藥物純度的物質(zhì)。遺傳毒性是指遺傳毒性物質(zhì)中任何有害變化引起的毒性,而不考慮誘發(fā)該變化的機(jī)制,又稱為基因毒性。遺傳毒性雜質(zhì)(genotoxic impurities,GTIs)是指能引起遺傳毒性的雜質(zhì)。《中國藥典》2020 年版四部中專門收錄了“遺傳毒性雜質(zhì)控制指導(dǎo)原則”[1]。遺傳毒性雜質(zhì)是藥品中很特殊的一類雜質(zhì),系特指有著重大安全風(fēng)險(xiǎn),極微量水平即能誘發(fā)DNA 突變的雜質(zhì)。因此藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的科學(xué)性和監(jiān)管要求都對雜質(zhì)的遺傳毒性評價(jià)和限度控制提出了很高的挑戰(zhàn)。

    1 藥品雜質(zhì)控制的法規(guī)依據(jù)

    人用藥品注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會(huì)(international conference on harmonization,ICH)頒布的原料藥、制劑雜質(zhì)研究指導(dǎo)原則(ICH Q3A,ICH Q3B),殘留溶劑研究指導(dǎo)原則(ICH Q3C),元素雜質(zhì)研究指導(dǎo)原則(ICH Q3D)和遺傳毒性雜質(zhì)研究指導(dǎo)原則[assessment and control of dNA reactive(Mutagenic)Impurities in pharmaceuticals to limit potential carcinogenic risk,ICH M7]是指導(dǎo)創(chuàng)新化學(xué)藥物研發(fā)中雜質(zhì)研究的指南性文件[2]。《中國藥典》自2005 年版起,附錄中設(shè)有“藥品雜質(zhì)分析指導(dǎo)原則”,2020 年版四部收錄了“遺傳毒性雜質(zhì)控制指導(dǎo)原則”。從雜質(zhì)來源分析,完全除去產(chǎn)品中的雜質(zhì),既不可能,也沒有必要[3],根據(jù)雜質(zhì)風(fēng)險(xiǎn)等級,對其進(jìn)行有效控制則是值得思考和探討的。

    2 藥品雜質(zhì)毒性評價(jià)思路

    理想的“雜質(zhì)譜控制(impurity profiling)”應(yīng)當(dāng)針對藥品中的每一個(gè)雜質(zhì),依據(jù)其生理活性制定相應(yīng)的質(zhì)控限度[4]。通常情況下根據(jù)化學(xué)藥品雜質(zhì)毒性的性質(zhì),可將其分為三類:遺傳毒性雜質(zhì),普通毒性雜質(zhì)和普通雜質(zhì)。

    遺傳毒性雜質(zhì)具有重大的遺傳毒性安全風(fēng)險(xiǎn),極微量水平即能誘發(fā) DNA 突變,是需要重點(diǎn)控制的雜質(zhì),對其控制的水平直接體現(xiàn)了藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的水平[5]。理論上對于遺傳毒性雜質(zhì)的毒性評價(jià)應(yīng)當(dāng)使用雜質(zhì)純品,利用體外細(xì)菌致突變試驗(yàn)(Ames 試驗(yàn))對其進(jìn)行評估。但實(shí)際上,美國食品藥品管理局(FDA)和歐洲藥品管理局(EMA)均認(rèn)可在對雜質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定的基礎(chǔ)上利用定量結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系(QSAR)模型對其進(jìn)行評價(jià)的方法,即首先通過計(jì)算機(jī)預(yù)測雜質(zhì)是否具有“警示結(jié)構(gòu)”。如果計(jì)算機(jī)預(yù)測該雜質(zhì)不具有“警示結(jié)構(gòu)”,則可判斷該雜質(zhì)不具有遺傳毒性;如果判斷該雜質(zhì)具有“警示結(jié)構(gòu)”,則可通過 Ames 試驗(yàn)進(jìn)行確認(rèn),若 Ames 試驗(yàn)結(jié)果為陽性,該雜質(zhì)按 MIs控制;若為陰性,則判斷其不具有遺傳毒性。對于遺傳毒性雜質(zhì),需要嚴(yán)格根據(jù)其毒性大小控制其限度水平;對普通毒性雜質(zhì)通常需要對其是否具有特定毒性作用作進(jìn)一步評估,以便在雜質(zhì)譜控制中確定是否將其作為特定毒性雜質(zhì)進(jìn)行控制[6];普通雜質(zhì)按照ICH 指南中的一般雜質(zhì)控制方法控制即可。

    3 遺傳毒性雜質(zhì)的分類系統(tǒng)

    美國藥品研究和制造專家組(PhRMA)提出的遺傳毒性雜質(zhì)五級分類系統(tǒng)[5-6],見圖1。

    圖1 遺傳毒性雜質(zhì)五級分類系統(tǒng)

    4 確定遺傳毒性雜質(zhì)限值的依據(jù)

    確定遺傳毒性雜質(zhì)限值的主要參考依據(jù)是可接受攝入量??山邮軘z入量的獲得有化合物特異性風(fēng)險(xiǎn)評估計(jì)算、通過毒理學(xué)關(guān)注閾值(threshold of toxicological concern,TTC)計(jì)算和根據(jù)給藥周期調(diào)整計(jì)算等等?;衔锾禺愶L(fēng)險(xiǎn)評估計(jì)算法主要針對有明確毒理學(xué)風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測數(shù)據(jù)的化合物,應(yīng)用該方法需要對化合物進(jìn)行較為充分的毒理學(xué)風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控;對于有致癌性數(shù)據(jù)的遺傳毒性雜質(zhì),可采用嚙齒類動(dòng)物50%(TD50)或25%(TD25)腫瘤發(fā)生率線性外推法;對于毒-量關(guān)系不呈線性關(guān)系但存在毒性實(shí)際閾值可采用不確定因子來計(jì)算每日允許暴露量。對于無毒理學(xué)研究數(shù)據(jù)的雜質(zhì)可采用TTC 來計(jì)算可接受攝入量,TTC 是指沒有顯著致癌性或其他毒性作用的化合物的可接受攝入量,通過概率的方法來控制風(fēng)險(xiǎn)[7]。此概念最早由FDA 提出,主要用于食品添加劑的限度規(guī)定,限度為1.5 μg/d。通過TTC 評估原料藥遺傳毒性雜質(zhì)的限度,每天攝入1.5 μg 的遺傳毒性雜質(zhì)被認(rèn)為是可以接受的風(fēng)險(xiǎn) 。由于臨床試驗(yàn)的持續(xù)時(shí)間不可能無限延長,且總體暴露量相對較低,故進(jìn)一步引入分期TTC 的概念,其基本思路是根據(jù)劑量和臨床試驗(yàn)的持續(xù)時(shí)間對TTC 進(jìn)行調(diào)整,使得當(dāng)臨床試驗(yàn)劑量增加時(shí)TTC 降低,持續(xù)時(shí)間較短時(shí)TTC 提高。TTC 的概念不能應(yīng)用于強(qiáng)效致癌物。

    TTC 是以低劑量終生用藥的風(fēng)險(xiǎn)而計(jì)算出來的限值,多數(shù)藥物并不需要終身服用,因此可以根據(jù)藥物實(shí)際的給藥周期來調(diào)整計(jì)算可接受攝入量。

    5 遺傳毒性評價(jià)中新技術(shù)應(yīng)用的進(jìn)展

    綜上所述,藥品雜質(zhì)的實(shí)際遺傳毒性評價(jià)數(shù)據(jù)對于制定其雜質(zhì)的限度意義重大,藥品雜質(zhì)的遺傳毒性評價(jià)是藥品安全性評價(jià)的重要組成部分。系統(tǒng)的非臨床遺傳毒性評價(jià)包括鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變試驗(yàn)(Ames)、小鼠微核試驗(yàn)(MN)、小鼠染色體畸變(CA)和彗星試驗(yàn)等[8-15]。由于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與人體反應(yīng)存在種屬差異,且這些試驗(yàn)檢測操作煩瑣、耗時(shí)漫長且影響因素眾多,對于藥品安全評價(jià)實(shí)驗(yàn)室具有較高的要求。為了提高藥品遺傳毒性評價(jià)的效率和準(zhǔn)確性,學(xué)界對于遺傳毒性評價(jià)試驗(yàn)方法開展了眾多有益的嘗試。

    5.1 直接使用對人細(xì)胞系進(jìn)行遺傳毒性評價(jià)

    Kahaliw W 等[16]使用彗星試驗(yàn)評估星狀翼蕨(Pterolobium stellatum),整骨耳麥(Otostegia integrifolia)和扁桃核根(Vernonia amygdalina)提取物對人肝癌細(xì)胞(HepG2)的遺傳毒性作用,?adirci K 等[17]則使用人外周血培養(yǎng)單核細(xì)胞(PMBC)評價(jià)了利格列?。↙NG)致染色體畸變的能力,?tampar M 等[18]開發(fā)了HepG2 三維培養(yǎng)細(xì)胞模型并應(yīng)用彗星試驗(yàn)評價(jià)多環(huán)芳烴化合物的遺傳毒性,結(jié)果顯示新開發(fā)的HepG2 3D 模型對遺傳毒性檢測表現(xiàn)出更高的靈敏度。這些試驗(yàn)的體內(nèi)外結(jié)果相關(guān)性尚有待進(jìn)一步試驗(yàn)數(shù)據(jù)的支持。

    5.2 使用高通量高含量(HTHC)CometChip 技術(shù)和基準(zhǔn)劑量(BMD)定量方法相結(jié)合進(jìn)行遺傳毒性評價(jià)

    Seo J E 等[19]使用高通量高含量(HTHC)CometChip 技術(shù)和基準(zhǔn)劑量(BMD)定量方法相結(jié)合的方法,用28 種已知具有不同遺傳毒性和致癌作用模式(MoAs)的化合物對人肝癌細(xì)胞(HepaRG)和HepG2 兩種細(xì)胞系中DNA 損傷能力進(jìn)行了定量研究,并與目前的細(xì)菌或非代謝活性哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)相比,結(jié)果顯示分化的HepaRG 細(xì)胞比HepG2細(xì)胞具有更高水平的細(xì)胞色素P450 活性;采用代謝活性人類細(xì)胞的體外遺傳毒性測試可能更適合于評估人類體內(nèi)遺傳毒性;BMD 的遺傳毒性效能估算值可用于定量評估CometChip 分析數(shù)據(jù)。

    5.3 聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCRRFLP)在遺傳毒性評價(jià)中的應(yīng)用

    Bhinder P 等[20]以庫克斯奎庫斯蚊(culex quinquefasciatus)為實(shí)驗(yàn)?zāi)P?,通過PCR-RFLP 試驗(yàn)評估了乙酰丙酮和丙泊磷農(nóng)藥的遺傳毒性。用殺蟲劑LC20 對第二齡幼蟲處理24 小時(shí)后根據(jù)PacI和PsiI 限制性內(nèi)切核酸酶產(chǎn)生的限制性圖譜研究線粒體16S rRNA 基因序列的誘導(dǎo)突變。序列比對數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)突變引起被治療個(gè)體基因序列的破壞和限制性位點(diǎn)的產(chǎn)生,表明兩種農(nóng)藥均具有誘導(dǎo)庫克斯奎庫斯蚊16S 基因突變的能力。

    5.4 體外細(xì)胞轉(zhuǎn)化檢測方法替代致癌試驗(yàn)

    評估化學(xué)物質(zhì)的致癌潛力是遺傳毒性評價(jià)的重要內(nèi)容。由于體內(nèi)致癌性研究耗時(shí)昂貴,需要使用大量動(dòng)物并且不能高通量篩選,因此需要開發(fā)有效的體外細(xì)胞轉(zhuǎn)化檢測方法。Steinberg P[21]綜述了體內(nèi)外致癌性測試的方法,表明可以使用三種經(jīng)過廣泛評估的體外測試系統(tǒng)(BALB/ c 3T3 細(xì)胞轉(zhuǎn)化測定,Bhas 42 細(xì)胞轉(zhuǎn)化測定和敘利亞倉鼠胚胎測定),作為體外遺傳毒性測試的備選補(bǔ)充方法,用于鑒定非遺傳毒性致癌物,以限制需要進(jìn)行體內(nèi)致癌性測試化學(xué)藥品的數(shù)量,從而大大減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的數(shù)量。

    5.5 γH2AX 的原位檢測作為遺傳毒性生物標(biāo)志物的研究進(jìn)展

    γH2AX 是H2AX 組蛋白的139 位絲氨酸被磷酸化的形式,是DNA 雙鏈被打開(DNA doublestrand breaks,DSB)的標(biāo)志性蛋白,在臨床上曾被用于腫瘤患者的放化療損傷監(jiān)測的生物標(biāo)志物,近年來被提出應(yīng)用于新藥研發(fā)的非臨床安全性評價(jià)的生物標(biāo)志物。γH2AX 的誘導(dǎo)表達(dá)是DNA 雙鏈損傷(DDR)中最早的標(biāo)志性事件,在該過程中起核心作用并誘導(dǎo)DNA 損傷的自我修復(fù)。Kopp B[22]系統(tǒng)綜述了對該生物標(biāo)記物進(jìn)行的檢測結(jié)果并與不同方法檢測化學(xué)物的遺傳毒性進(jìn)行了比較,結(jié)果表明體外γH2AX 檢測以及其他遺傳毒性終點(diǎn)(Ames 試驗(yàn),微核,HPRT 基因突變和彗星試驗(yàn))評估的相關(guān)性良好(91%的可預(yù)測性)。γH2AX 的分析具有靈敏、準(zhǔn)確和高效的特點(diǎn),免疫組化檢測和流式細(xì)胞術(shù)都可以對其進(jìn)行定量檢測,既能夠適用于貼壁細(xì)胞也適用于懸浮細(xì)胞的檢測,對其進(jìn)行定量分析能夠做到自動(dòng)化和連續(xù)化,可以作為遺傳毒性高通量檢測的分析手段,雖然尚未有法規(guī)批準(zhǔn)γH2AX 檢測方法用于遺傳毒性評價(jià),但顯然該生物標(biāo)志物應(yīng)用于遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)評估的前景無量[23-25]。

    6 雜質(zhì)毒性識別判定的流程

    由上可見,化學(xué)藥品中毒性雜質(zhì)的識別和判定一直是雜質(zhì)安全性評價(jià)和限度控制的難點(diǎn)。一般而言毒性雜質(zhì)的識別判定大致分為如下三個(gè)部分。

    6.1 利用計(jì)算機(jī)(in silico)預(yù)測雜質(zhì)毒性

    在對雜質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定的基礎(chǔ)上,可利用定量結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系(QSAR)模 型,首先通過計(jì)算機(jī)預(yù)測雜質(zhì)是否具有“警示結(jié)構(gòu)”;定量構(gòu)效關(guān)系(quantitative structure-activity relationship,QSAR)模型是借助數(shù)學(xué)模型、人工智能等計(jì)算機(jī)技術(shù),利用化學(xué)、生物學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)、毒理學(xué)等綜合學(xué)科的知識,依據(jù)藥物的分子結(jié)構(gòu)參數(shù)來推測藥物的生物活性。FDA 也曾使用一系列軟件對低于ICH 閾值 的雜質(zhì)進(jìn)行相關(guān)毒性預(yù)測。QSAR 預(yù)測結(jié)果同樣存在假陰性結(jié)果,這可能與所選擇的模型、模型適用范圍以及數(shù)據(jù)處理不當(dāng)有關(guān),也可能因?yàn)榭臻g位阻或保護(hù)基團(tuán)減輕了毒性基團(tuán)的效力,導(dǎo)致預(yù)測結(jié)果不準(zhǔn)確[26]。目前QSAR 主要用于小分子化合物的毒性預(yù)測,對于大分子化合物(分子量大于1 000)和植物來源化合物的毒性預(yù)測尚需要進(jìn)一步的方法研究與驗(yàn)證[27-28]。毒性功能基團(tuán)空間構(gòu)型的差異也能影響其在體內(nèi)的毒性作用,通過計(jì)算化學(xué)方法獲得藥物在水溶液中的最穩(wěn)定構(gòu)象,進(jìn)而計(jì)算分子的空間極性表面積(topological polar surface area,TPSA),可以預(yù)測藥物分子的主要毒性功能基團(tuán)以及機(jī)體對不同藥物分子的吸收難易。目前國內(nèi)已經(jīng)廣泛用于計(jì)算機(jī)預(yù)測的軟件有:Toxtree 軟件,Leadscope 軟件,DRAGON 軟件,ADMET Predictor 軟件,Gastroplus軟件,Volsurf 軟件,Pallas 軟件,Derek Nexus 軟件,Sarah Nexus 軟件等,這些軟件大部分已經(jīng)商業(yè)化,具有相當(dāng)?shù)膽?yīng)用經(jīng)驗(yàn),可以為計(jì)算機(jī)預(yù)測提供較高可行性的技術(shù)支撐。

    6.2 體外試驗(yàn)(in vitro)驗(yàn)證雜質(zhì)遺傳毒性

    藥物雜質(zhì)的毒性反應(yīng)被認(rèn)為與其干擾機(jī)體的正常信號通路有明確的因果關(guān)系,使得利用體外模型在分子水平上探討化合物的毒性反應(yīng)機(jī)制,進(jìn)而外推其在機(jī)體中的不良反應(yīng)成為可能,如前所述,γH2AX 原位檢測是一種有希望的高通量遺傳毒性篩選測定方法并有望成為監(jiān)管機(jī)構(gòu)進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評估新的實(shí)用工具。體外測試方法的進(jìn)展將有望幫助解決將藥物/雜質(zhì)毒理學(xué)信息與藥物臨床不良反應(yīng)相關(guān)聯(lián)和將不良反應(yīng)信息與產(chǎn)品質(zhì)量相關(guān)聯(lián)等雜質(zhì)譜控制相關(guān)的難題。

    6.3 體內(nèi)試驗(yàn)(in vivo)確證雜質(zhì)毒性

    在對藥物微量雜質(zhì)的體內(nèi)毒性評價(jià)方面,國內(nèi)已經(jīng)廣泛開展利用模式生物斑馬魚進(jìn)行藥物胚胎毒性評價(jià)[29],與此同時(shí)也建立起藥物心臟毒性評價(jià)模型、藥物肝臟毒性評價(jià)模型、藥物神經(jīng)毒性評價(jià)模型、藥物耳毒性評價(jià)模型和藥物骨骼毒性評價(jià)模型,通過評價(jià)雜質(zhì)與藥物活性成分(API)的相對毒性,以評估藥物雜質(zhì)的危害性。以上工作為雜質(zhì)譜控制中系統(tǒng)評估藥物雜質(zhì)的毒性作用,進(jìn)而制定合理的雜質(zhì)限度提供了解決方案。

    7 結(jié)論

    在現(xiàn)階段條件下,探索以γH2AX 為代表的生物標(biāo)志物檢測替代傳統(tǒng)的體內(nèi)外遺傳毒性檢測體系;以計(jì)算機(jī)預(yù)測藥品雜質(zhì)的毒性;并使用斑馬魚模式動(dòng)物對其遺傳毒性進(jìn)行驗(yàn)證是可行的,建立從計(jì)算機(jī)預(yù)測(in silico)、體外生物標(biāo)志物(in vitro)到體內(nèi)(in vivo)的藥品雜質(zhì)毒性評價(jià)平臺(tái),對建立科學(xué)的雜質(zhì)控制標(biāo)準(zhǔn),提高藥品質(zhì)量的安全性水平具有重要的意義,藥品雜質(zhì)遺傳毒性評價(jià)的能力直接影響藥品關(guān)鍵質(zhì)量屬性評價(jià)平臺(tái)的水平。

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