慢性乙肝合并肺結(jié)核患者外周血單個(gè)核細(xì)胞HBV pgRNA的表達(dá)與免疫功能的相關(guān)性

張志鋒 薛珉 徐瑞芳 張紅云 張曹庚

我國是乙肝病毒(HBV)高感染國家，又是肺結(jié)核高負(fù)擔(dān)國家，慢性乙肝(CHB)合并肺結(jié)核患者在臨床上并不少見，此類患者病情復(fù)雜，治療難度更大。流行病學(xué)研究顯示，CHB合并肺結(jié)核行抗結(jié)核治療肝功能損害的發(fā)生率約為30%～50%，嚴(yán)重者可誘發(fā)急性肝衰竭，嚴(yán)重影響抗癆治療和病情進(jìn)展[1]。目前，抗結(jié)核藥物導(dǎo)致HBV再激活已形成廣泛共識(shí)，HBV活躍復(fù)制誘導(dǎo)機(jī)體處于炎癥狀態(tài)，從而改變肝臟解毒功能并增加藥物的肝臟毒性，進(jìn)一步加重抗結(jié)核所致肝損傷[2-3]。近年來，有研究指出血清HBV RNA是被包裹的前基因組RNA(pgRNA)，以類似于HBV樣病毒顆粒存在，且與cccDNA狀態(tài)密切相關(guān)，對(duì)于CHB再復(fù)制、抗病毒治療的療效評(píng)估具有重要價(jià)值[4]。本研究擬通過檢測CHB合并肺結(jié)核患者外周血HBV pgRNA的表達(dá)，分析其與免疫功能的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)告如下。

資料與方法

一、一般資料

選取2018年3月-2019年3月我院結(jié)核門診新確診的CHB合并肺結(jié)核患者，共40例。入組標(biāo)準(zhǔn)：①CHB診斷均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)聯(lián)合感染病學(xué)分會(huì)制定的《慢性乙型肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)(2015年版)》[5]。②肺結(jié)核病診斷依據(jù)《肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS 288—2017)》[6]：a.痰結(jié)核菌陽性；b.明顯低熱、盜汗、咳嗽、咯血等結(jié)核中毒癥狀； c.病理檢測陽性或痰抗酸桿菌PCR檢測陽性；d.胸部CT有典型的結(jié)核影像改變；e.抗結(jié)核治療有效。具備以上第1項(xiàng)或2～5項(xiàng)中3項(xiàng)者可診斷為結(jié)核。③年齡18～60歲，肺結(jié)核均為首次確診，既往未接受過抗結(jié)核治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并存在艾滋病病毒感染、糖尿病、自身免疫性疾病者；②既往急性或亞急性肝衰竭病史者、或其他重要臟器功能衰竭病史者；③明確診斷為非結(jié)核分枝桿菌感染者。其中男26例，女14例；年齡38～60歲，平均(48.5±6.2)歲；CHB病程1～25年，平均(10.7±2.6)年。按照隨機(jī)數(shù)字表法，將患者分為對(duì)照組(n=20)、治療組(n=20)。兩組年齡、性別、病程等比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t/χ2=0.51,1.75, 0.25，P>0.05)。本研究符合《赫爾辛基宣言》，入選對(duì)象均簽署知情同意書。

二、方法

對(duì)照組給予2HRZE/4HR 方案，即異煙肼(H，山西汾河制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H14022402)0.4g/次、利福平(R，廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司，國藥準(zhǔn)字H44020771)0.60g/次、吡嗪酰胺(Z，廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司，國藥準(zhǔn)字H44020761)1.5 g/次、乙胺丁醇(廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司，國藥準(zhǔn)字H44020758)0.75 g/次，總療程6個(gè)月。治療過程定期檢測肝功能，當(dāng)谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)指標(biāo)升高時(shí)口服甘草酸二銨0.15g護(hù)肝治療，持續(xù)到治療全部結(jié)束。觀察組在此基礎(chǔ)上定期給予拉米夫定進(jìn)行預(yù)防性抗病毒治療，100 mg/次，1次/天，連續(xù)治療6個(gè)月。

三、觀察指標(biāo)

1 標(biāo)本采集:分別于治療2、6個(gè)月后采集適量清晨空腹肘靜脈血，肝素抗凝，送實(shí)驗(yàn)室備檢。

2 HBV DNA、HBV RNA定量檢測:取2 mL肝素抗凝靜脈血，按常規(guī)方法用淋巴細(xì)胞分離液分離出外周血單核細(xì)胞(PBMCs)，與乙型肝炎病毒核酸定量測定試劑盒(湖南圣湘生物科技有限公司)充分混合、裂解，分別提取PBMCs中HBV DNA、HBV RNA，采用ABI 7000實(shí)時(shí)免疫熒光定量PCR儀(美國ABI公司)進(jìn)行PCR、RT-PCR。試劑盒檢測下限為200 copies/mL。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、兩組不同時(shí)間PBMCs中HBV DNA、HBV RNA比較

治療前，兩組PBMCs中HBV DNA、HBV RNA水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療后2個(gè)月，兩組PBMCs中HBV DNA、HBV RNA水平較治療前顯著升高，治療組治療后6個(gè)月PBMCs中HBV DNA、HBV RNA水平較治療后2個(gè)月顯著下降，與治療前比較均無顯著性差異(P>0.05)，且均顯著低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表1)。

二、兩組不同時(shí)間T淋巴細(xì)胞、IFN-γ水平比較

表1 兩組不同時(shí)間PBMCs中HBV DNA、HBV RNA比較 log copies/mL)

表2 兩組不同時(shí)間T淋巴細(xì)胞、IFN-γ水平比較

三、HBV DNA、HBV RNA與免疫功能指標(biāo)的相關(guān)性

表3 PBMCs中HBV DNA、HBV RNA與免疫功能指標(biāo)的相關(guān)性

討 論

目前，肺結(jié)核的臨床治療方案已經(jīng)較為成熟，但對(duì)肺結(jié)核合并CHB患者如何在確保治療效果同時(shí)減輕對(duì)肝功能的損害，一直是該領(lǐng)域臨床醫(yī)生關(guān)注的熱點(diǎn)問題[7]。HBV再激活是指HBV病毒攜帶者在接受細(xì)胞毒性藥物或免疫抑制劑等治療后HBV復(fù)制力增強(qiáng)，是繼發(fā)藥物性肝損害主要原因之一，其發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，化療、免疫抑制劑可直接或間接促進(jìn)HBV復(fù)制，但對(duì)于抗結(jié)核治療過程中出現(xiàn)的HBV再激活尚缺乏足夠證據(jù)[8]。研究表明，PBMCs作為免疫細(xì)胞，其感染HBV可能與CHB病情反復(fù)加重或某些病理?xiàng)l件作用有關(guān)，被視為HBV再激活的基礎(chǔ)[1]。

近年來研究表明，ccc DNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成RNA是病毒復(fù)制的開端，也是反復(fù)感染的關(guān)鍵因素，徹底清除ccc DNA才能治愈CHB，但ccc DNA檢測侵入性的局限性極大限制其發(fā)展與應(yīng)用[9]。PBMCs中HBV RNA主要為pg RNA，其來源可能為HBV復(fù)制過程中核衣殼包裹的pg RNA未進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄時(shí)獲得包膜并從感染的肝細(xì)胞中釋放入血，被稱為HBV RNA病毒樣顆粒，可以反映cccDNA水平及轉(zhuǎn)錄活性，可作為指導(dǎo)抗病毒治療及安全停藥的一個(gè)生物標(biāo)志物[10-11]。根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)，HBV治療1個(gè)月可開始激活，1.5～2個(gè)月達(dá)到高峰，因此治療后2個(gè)月檢測能夠有效反映病毒再激活現(xiàn)象。本研究結(jié)果顯示，兩組抗結(jié)核治療后2個(gè)月PBMCs中HBV DNA、HBV RNA表達(dá)較治療前顯著升高，提示該時(shí)期HBV出現(xiàn)大量復(fù)制、再激活，而治療組治療后6個(gè)月PBMCs中HBV DNA、HBV RNA水平明顯回落，恢復(fù)至治療前水平，且顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，說明預(yù)防性應(yīng)用抗病毒治療有助于抑制HBV再激活，降低HBV pgRNA載量，進(jìn)而降低抗結(jié)核治療過程的肝損傷[12]。

綜上所述，預(yù)防性抗病毒治療可有效降低PBMCs中HBV pgRNA表達(dá)，抑制抗結(jié)核治療過程中CHB再激活，改善機(jī)體免疫功能，同時(shí)免疫學(xué)變化可能參與了CHB再激活，但其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。