菌酶聯(lián)合反應(yīng)制備兔血抗氧化低聚肽

周媛媛，肖 嵐，鮮丹丹，周李鑫，杜雙巧，楊 瑤

（四川旅游學(xué)院食品學(xué)院，四川 成都 610100）

目前，利用動物血液蛋白制備抗氧化低聚肽的研究報道較多，姜紅[1]探討了馬鹿茸血酶解肽免疫活性及抗氧化活性；徐月敏[2]進(jìn)行了魚皮低聚肽和鹿血低聚肽抗氧化活性研究；肖嵐等[3]對牦牛血抗氧化低聚肽的制備工藝進(jìn)行了優(yōu)化；安攀宇等[4]研究了菌酶聯(lián)合制備豬血抗氧化低聚肽。然而，利用兔血蛋白制備抗氧化低聚肽的研究報道較為鮮見，兔血的研究報道主要集中在兔血中生物活性物質(zhì)的提取及應(yīng)用，韋瑩玨等[5]使用硫酸銨分級沉淀、凝膠過濾層析、DEAE 離子交換層析、親和層析、醋酸纖維薄膜電泳、凝膠電泳（SDS-PAGE）、高效液相色譜（HPLC）等方法制備了兔血清白蛋白和γ-球蛋白（IgG），并測定其相對分子量，鑒定其均一性；曾麗[6]采用新鮮兔血為原料提取超氧化物歧化酶（SOD），并以牛乳為載體，SOD 作為功能因子，研制富含SOD 的酸奶，在此過程中主要研究了超聲波制備溶血液和熱變性法除雜蛋白的最佳工藝條件，SOD 的純化及其部分性質(zhì)，SOD 酸奶對人工胃腸道消化液的穩(wěn)定性和儲藏穩(wěn)定性；雷燕[7]采用利凡諾沉淀法純化兔血清白蛋白（RSA），以RSA 為載體，以戊二醛為交聯(lián)劑，采用兩步交聯(lián)法制備STa 與RSA 的共價偶聯(lián)物，再經(jīng)SDS-PAGE 鑒定偶聯(lián)效果，并測定了偶聯(lián)物分子量及偶聯(lián)比。

我國是世界排名第一的兔產(chǎn)品出口大國[8]，兔血資源極為豐富。然而，由于兔血血腥味較重、口感差、不利于人體消化等原因，導(dǎo)致大量兔血被丟棄，并未得到充分利用[9]。這不僅造成蛋白質(zhì)資源的浪費(fèi)，而且對環(huán)境造成嚴(yán)重污染。本試驗(yàn)擬將枯草芽孢桿菌發(fā)酵與堿性蛋白酶酶解結(jié)合建立菌酶聯(lián)合的方法制備兔血抗氧化低聚肽，通過單因素試驗(yàn)并結(jié)合響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化兔血抗氧化低聚肽的制備工藝，以ABTS＋·清除率和多肽含量作為體外抗氧化活性評價指標(biāo)，確定菌酶聯(lián)合法制備兔血抗氧化低聚肽的最佳工藝參數(shù)，為其工業(yè)化生產(chǎn)以及在食品添加劑、醫(yī)療、保健用品等領(lǐng)域的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

兔血：家云鮮兔火鍋店購買（成都市龍泉驛區(qū)）；枯草芽孢桿菌（SICC.197.菌種）：四川省微生物資源平臺菌種保藏中心；Lowry 法蛋白濃度測定試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；堿性蛋白酶（酶活力85.61 U/mg）：上海 Kayon 公司；牛肉膏、瓊脂、葡萄糖、蛋白胨、氯化鈉、ABTS、K2S2O8、三氯乙酸（TCA）、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等，成都科龍試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

XW-80A 型漩渦混合器：上海馳塘電子有限公司；GZ-150-S 型生化培養(yǎng)箱：韶關(guān)市廣智科技有限公司；各規(guī)格移液槍：德國Brand 公司；超濾管（＜5 kDa）：德國 Sartorius 公司；FALL04N 型電子天平：常州市衡正電子儀器有限公司；UV Power紫外可見分光光度計：北京萊伯泰科有限公司；XHF-D 型高速分散器：寧波新芝生物科技有限公司；GM-0.33 型隔膜真空泵：天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；WP-UP-UV-20 超純水機(jī)：四川沃特爾科技有限公司；JJ-CJ-2FD 型潔凈工作臺：蘇州市金凈凈化設(shè)備科技發(fā)展有限公司；HHS-8S 型電子恒溫不銹鋼水浴鍋：上海光地儀器有限公司；H2050R臺式高速冷凍離心機(jī)：長沙湘儀離心機(jī)有限公司；QYC-2102C 恒溫振蕩培養(yǎng)箱：上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；STARTER 3100 pH 計：上海奧豪斯設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 枯草芽孢桿菌發(fā)酵兔血工藝的優(yōu)化

挑取活化后的枯草芽孢桿菌，接入裝有50.00 mL液體培養(yǎng)基的錐形瓶中[10]，放在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度為 35 ℃，轉(zhuǎn)速 135 r/min，培養(yǎng) 12 h，得到種子培養(yǎng)液（1×109CFU/mL）。以多肽含量作為評價指標(biāo)，選取底物濃度、接菌量、發(fā)酵時間（發(fā)酵溫度35 ℃、pH 9.8）3 個因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)[11]。

（1）接菌量：在250 mL 錐形瓶中配制濃度為10 g/mL 的兔血勻漿 100 mL，121 ℃（0.2 MPa）下滅菌20 min。分別接入 2.5、3.5、4.5、5.5、6.5 mL 種子液，35 ℃、135 r/min 振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 3.0 d。

（2）底物濃度：在250 mL 錐形瓶中配制濃度分別為 6、8、10、12、14 g/mL 的兔血勻漿 100 mL，在 121 ℃（0.2 MPa）下滅菌 20 min，接入 4.5 mL 種子液，35 ℃、135 r/min 振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3.0 d。

（3）發(fā)酵時間：在250 mL 的錐形瓶中配制濃度為 10 g/mL 的兔血勻漿 100 mL，121 ℃（0.2 MPa）下滅菌 20 min，接入 4.5 mL 的種子液，35 ℃，135 r/min 振蕩培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng) 2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 d。

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以ABTS·+清除率作為響應(yīng)值（Y1），對兔血發(fā)酵底物濃度、發(fā)酵時間、枯草芽孢桿菌接種量因素進(jìn)行Box-Behnken Design（BBD）響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，得出制備兔血抗氧化低聚肽的最佳發(fā)酵工藝。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計見表1。

表1 發(fā)酵工藝響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments to optimize fermentation process

1.2.2 酶解兔血的工藝優(yōu)化

將最優(yōu)條件制備的兔血發(fā)酵解液于6 000 r·min-1離心15 min 得上清液，研究酶底比、pH、酶解溫度、酶解時間對上清液中ABTS+·清除率的影響。

（1）酶底比：100 mL 兔血發(fā)酵上清液在 60 ℃，pH為 9.8，酶底比分別為 100、200、300、400、500 U/g 條件下酶解3.0 h。

（2）pH：100 mL 兔血發(fā)酵上清液在 60 ℃，酶底比300 U/g，pH 分別為 8.6、9.2、9.8、10.4、11.0 條件下酶解3.0 h。

（3）酶解溫度：100 mL 兔血發(fā)酵上清液分別在溫度50、55、60、65、70 ℃，pH 為 9.8，酶底比 300 U/g 條件下發(fā)酵3.0 h。

（4）酶解時間：100 mL 兔血發(fā)酵上清液在60 ℃，pH為 9.8，酶底比 300 U/g 條件下分別發(fā)酵 2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h。

多肽含量對低聚肽的生物活性也會產(chǎn)生影響。因此，本試驗(yàn)根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以兔血低聚肽多肽含量為響應(yīng)值（Y2），以酶底比、pH、酶解溫度、酶解時間為特征值，通過Box-Behnken Design 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化兔血抗氧化低聚肽的酶解工藝。響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平見表2。

表2 酶解工藝響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平Table 2 Factors and levels of response surface experiments to optimize enzymatic process

1.2.3 兔血抗氧化低聚肽超濾處理

對菌酶聯(lián)合法制備的兔血抗氧化低聚肽采用截留分子量為0～5 kD 的超濾膜進(jìn)行離心分離（4 ℃，4 000 r/min，10 min），獲得分子量＜5 kD 的兔血抗氧化低聚肽[4]。

1.2.4 測定項目與方法

1.2.4.1 多肽含量

參照陳昌琳等[12]的方法，取4 mL 15%(m/V)的三氯乙酸水溶液，再加入同等體積的多肽樣品于渦旋混合器上均勻混合，靜置使大分子蛋白沉淀，在高速離心機(jī)6 000 r/min 轉(zhuǎn)速下離心15 min，再用Lowry 法測定上清液中的多肽含量。

1.2.4.2 ABTS+·清除率

將濃度為7.00mmol/L 的ABTS 溶液與2.45 mmol/L的K2S2O8溶液等體積混合均勻，混合液置于室溫避光條件下靜置12～16 h，以磷酸鹽緩沖液（0.20 mol/L，pH 7.4）稀釋混合液，使其在734 nm 時吸光度達(dá)到0.70±0.02，形成墨綠色 ABTS+·測定液。

取4.00 mL 的ABTS+·測定液，加入待測溶液100 μL，振蕩 30 s，測定溶液在 734 nm 處的吸光值?？瞻坠苡昧姿猁}緩沖液代替樣品，對照管用磷酸鹽緩沖液代替ABTS+·測定液。

ABTS+·清除率計算公式如下：

ABTS+·清除率（%）=[A0-（A1-A2）]/A0×100

式中：A0為空白管的吸光度；A1為測定樣品的吸光度；A2為對照管的吸光度。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 兔血枯草芽孢桿菌發(fā)酵工藝優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 枯草芽孢桿菌發(fā)酵兔血單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖1 接菌量對多肽含量的影響Fig.1 Effects of inoculum amount on polypeptide content

如圖1 所示，枯草芽孢桿菌發(fā)酵上清液中的多肽含量呈先升高后下降的變化趨勢，這與適當(dāng)?shù)目莶菅挎邨U菌接種量有關(guān)，當(dāng)接菌量為4.5 mL 時，多肽含量達(dá)到最高值2.19 mg/mL，與多肽含量最低值（1.15 mg/mL）差異顯著（P＜0.05）。

如圖2 所示，發(fā)酵上清液中的多肽含量隨底物濃度的增加顯著升高，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?0 g/mL 時，達(dá)到最高值2.75 mg/mL，之后隨著底物濃度增加，多肽含量反而下降。

圖2 底物濃度對多肽含量的影響Fig.2 Effects of substrate concentration on polypeptide content

如圖3 所示，發(fā)酵時間對發(fā)酵上清液多肽含量的影響顯著，隨發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵上清液中多肽含量上升，當(dāng)發(fā)酵時間為3.5 d 時達(dá)到最高值2.54 mg/mL，隨后（4 d）降為1.56 mg/mL，這可能與枯草芽孢桿菌的過度發(fā)酵降解了多肽有關(guān)。

圖3 發(fā)酵時間對多肽含量的影響Fig.3 Effects of fermentation time on polypeptide content

2.1.2 枯草芽孢桿菌發(fā)酵兔血響應(yīng)面試驗(yàn)

利用Design Expert 軟件對響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析，結(jié)果見表3。對該模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4。

由表4 所示，此模型的P＜0.000 1，即響應(yīng)面回歸模型極顯著，失擬項（P=0.129 8＞0.05）不顯著，說明非試驗(yàn)因素對試驗(yàn)結(jié)果的影響不大。

決定系數(shù)R2為0.997 5，校正后的決定系數(shù)為0.994 2，與R2接近，表明該模型與實(shí)際試驗(yàn)擬合較好，該模型能夠解釋ABTS+·清除率有99.42%的變化來源于所選變量，因此該模型方程在試驗(yàn)范圍內(nèi)，能夠適用于預(yù)測發(fā)酵條件對兔血低聚肽ABTS+·清除率影響的分析。從表4 還可以看出對 ABTS+·清除率影響極顯著（P＜0.01），X3的影響顯著（P＜0.05），即接菌量、底物濃度、發(fā)酵時間以及接菌量與發(fā)酵時間的交互作用對兔血低聚肽的ABTS+·清除率有顯著影響，且各因素對ABTS+·清除率影響程度由大到小為：底物濃度＞接菌量＞發(fā)酵時間。

表4 回歸模型方差分析表Table 4 Analysis of variance for regression model

對表3 中的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合分析，以發(fā)酵上清液ABTS+·清除率為響應(yīng)值（Y1），得到各因素對響應(yīng)值的二次多項回歸方程為：

由方程預(yù)測的枯草芽孢桿菌發(fā)酵兔血最佳工藝為：接菌量5.58 CFU/mL，底物濃度10.74 g/mL，發(fā)酵時間3.55 d，此時ABTS+·清除率為84.64%。為了方便實(shí)際操作，將優(yōu)化條件調(diào)整為：接菌量5.5 CFU/mL，底物濃度10 g/mL，發(fā)酵時間3.5 d，該條件下測得的ABTS+·清除率為84.42%，接近于理論值，多肽含量為2.84 mg/mL。

通過回歸方程所作出響應(yīng)面曲面圖及等高線見圖4，可直觀反映接菌量與發(fā)酵時間交互作用對發(fā)酵上清液ABTS+·清除率的影響。由圖4 可見，響應(yīng)面曲面坡度較陡，說明交互作用對響應(yīng)值影響顯著，這與表4 中方差分析一致。

圖4 接菌量與發(fā)酵時間的交互作用對發(fā)酵上清液ABTS+·清除率的影響Fig.4 Influence of interaction between inoculation amount and fermentation time on ABTS+·clearance rate of fermentation supernatant

2.2 酶解工藝優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 酶解單因素試驗(yàn)結(jié)果

為了進(jìn)一步提升兔血低聚肽的抗氧化活性，通過單因素試驗(yàn)初步篩選堿性蛋白酶酶解兔血發(fā)酵上清液的工藝參數(shù)。由圖5 可知，ABTS+·清除率隨酶底比的增高呈先上升后下降趨勢，當(dāng)酶底比為200 U/g時，ABTS+·清除率最高，為 87.58%，此時的 ABTS+·清除率顯著高于其他酶底比處理（P＜0.05）。此外，關(guān)于酶底比進(jìn)一步增加而ABTS+·清除率下降，可能與過量堿性蛋白酶有關(guān)，導(dǎo)致某些具有抗氧化活性的多肽、寡肽過度酶解。

圖5 酶底比對ABTS+·清除率的影響Fig.5 Effects of enzyme-substrate ratio on ABTS+·clearance rate

如圖6 所示，pH 對ABTS+·清除率的影響顯著，ABTS+·清除率隨pH 的增加而增加，當(dāng)pH 為10.4 時，ABTS+·清除率達(dá)到最高值82.79%；然而pH 進(jìn)一步增加ABTS+·清除率降低，這可能與堿性蛋白酶的最適pH 有關(guān)，從而影響其對兔血低聚肽的酶解程度，特別是具有抗氧化活性的兔血低聚肽的產(chǎn)生。

圖6 pH 對ABTS+·清除率的影響Fig.6 Effects of pH on ABTS+·clearance rate

由圖7 可知，隨著酶解溫度的升高，ABTS+·清除率增加，酶解溫度65 ℃時，ABTS+·清除率最高，為83.56%，酶解溫度進(jìn)一步升高，ABTS+·清除率降低，這與堿性蛋白酶的最適酶解溫度有關(guān)。

圖7 酶解溫度對ABTS+·清除率的影響Fig.7 Effects of enzymolysis temperature on ABTS+·clearance rate

圖8 酶解時間對ABTS+·清除率的影響Fig.8 Effects of enzymolysis time on ABTS+·clearance rate

由圖8 可知，酶解時間對ABTS+·清除率的影響顯著，隨著酶解時間的延長，ABTS+·清除率呈先上升后下降趨勢。堿性蛋白酶對兔血發(fā)酵上清液的酶解時間將直接影響兔血低聚肽的肽段組成，特別是具有抗氧化活性的肽段的數(shù)量。當(dāng)酶解時間為2.5 h 時，ABTS+·清除率最高，達(dá)到91.63%。

2.2.2 酶解響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對兔血低聚肽多肽含量進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表5。對回歸模型的方差分析見表6。

運(yùn)用Design-Expert 6.0 軟件對表5 中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到二次多元回歸方程：

Y2=3.85+0.095A+0.098B-0.17C+0.25D-0.021AB+0.14AC+0.053AD+0.090BC+0.14BD+0.024CD-0.30A2-0.27B2-0.58C2-0.51D2

由表6 可知，模型的P＜0.000 1，即響應(yīng)面回歸模型極顯著，失擬項（P=0.109 3＞0.05）不顯著，說明非試驗(yàn)因素對試驗(yàn)結(jié)果的影響不大；各因素對兔血低聚肽多肽含量的影響程度由大到小為：D＞C＞B＞A，即酶解溫度的影響最大，其次是pH 和酶解時間，酶底比的影響最小。交互項中，AC（酶底比和pH）和BD（酶解時間和酶解溫度）對多肽含量的影響顯著（P＜0.05），二次項中 A2、B2、C2和 D2對多肽含量的影響極顯著（P＜0.01）。

表5 酶解工藝響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計方案及結(jié)果Table 5 Experimental design and results for response surface analysis to optimize enzymatic process

表6 回歸模型方差分析Table 6 Analysis of variance for regression model

續(xù)表6 回歸模型方差分析Continue table 6 Analysis of variance for regression model

圖9 和圖10 分別表示酶底比與pH、酶解時間與酶解溫度的交互作用對兔血低聚肽多肽含量影響的響應(yīng)曲面圖，坡度均較明顯，與表6 結(jié)果相符。

圖9 酶底比與pH 的交互作用對多肽含量影響的響應(yīng)曲面圖和等高線圖Fig.9 Response surface and contour diagrams of the effect of interaction between enzyme-substrate ratio and pH on polypeptide content

圖10 酶解時間與酶解溫度的交互作用對多肽含量影響的響應(yīng)曲面圖和等高線圖Fig.10 Response surface and contour diagrams of the effect of interaction between the enzymolysis time and temperature on polypeptide content

通過Design-Expert 6.0 軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，得到最佳酶解兔血條件為：酶底比214.83 U/g，酶解時間2.62 h，pH 10.34，酶解溫度61.40 ℃，此時多肽含量為3.91 mg/mL。為了驗(yàn)證預(yù)測值與理論值之間的擬合，檢查其可靠性，根據(jù)實(shí)際可行性，為便于工業(yè)化生產(chǎn)，對上述酶解條件進(jìn)行修正，最終優(yōu)化的條件為：酶底比 200 U/g，酶解時間 2.5 h，pH 10.4，酶解溫度60 ℃，經(jīng)過3 次平行試驗(yàn)，ABTS+·清除率為87.22%，多肽含量為(3.81±0.42) mg/mL，與理論預(yù)測值較接近，說明該模型能較好地預(yù)測實(shí)際多肽含量。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用菌酶聯(lián)合法制備兔血抗氧化低聚肽，并通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化得到其最優(yōu)制備工藝，枯草芽孢桿菌發(fā)酵兔血最佳工藝為：接菌量5.5 CFU/mL，底物濃度10 g/mL，發(fā)酵時間3.5 d，此時ABTS·+清除率為84.42%，多肽含量為2.84 mg/mL；酶解最優(yōu)工藝為：酶底比200 U/g，酶解時間2.5 h，pH 10.4，酶解溫度60 ℃，此時多肽含量為3.81 mg/mL，ABTS+·清除率為87.22%。

綜上，本試驗(yàn)采用菌酶聯(lián)合法制備兔血抗氧化低聚肽，較傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵法[13]或酶解法可提高兔血低聚肽的抗氧化活性以及多肽的含量，降低商業(yè)酶的使用量。