燕山地區(qū)板栗果實(shí)香氣成分的GC-MS 分析

李 杰，王 雨，劉詩(shī)源，高 倩，韓繼成

（河北省農(nóng)林科學(xué)院昌黎果樹研究所，河北 昌黎 066600）

板栗（Castanea mollissima Blume.）為山毛櫸科栗屬植物，原產(chǎn)于我國(guó)，是我國(guó)特有的優(yōu)良經(jīng)濟(jì)林樹種之一[1]。板栗植株耐瘠薄，抗寒性和抗旱性較強(qiáng)，適合在我國(guó)北方燕山板栗栽培區(qū)的山地、丘陵栽培，是山區(qū)農(nóng)民脫貧致富的主要產(chǎn)業(yè)和提高農(nóng)民收入的主要經(jīng)濟(jì)來(lái)源。板栗果實(shí)不僅營(yíng)養(yǎng)豐富，還可養(yǎng)胃健脾、補(bǔ)腎強(qiáng)筋[2]。燕山地區(qū)板栗果實(shí)呈橢圓形，果皮褐色，果面明亮，果肉淡黃色，肉質(zhì)細(xì)糯，風(fēng)味香甜，澀皮易剝離，適于炒食，是糖炒板栗的主要品種來(lái)源。

香氣成分是構(gòu)成和影響板栗果實(shí)鮮食及加工產(chǎn)品的重要因素之一[3-5]，是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。但與蘋果[6-8]、梨[9-11]、葡萄[12-13]、桃[14-15]等果實(shí)的香氣研究相比，國(guó)內(nèi)外關(guān)于板栗香氣的研究報(bào)道還是較少。梁建蘭等[3]采用溶液萃取法對(duì)“燕龍”板栗的香氣成分進(jìn)行了研究；Krist 等[5]使用非極性柱RTx-5 結(jié)合溶液萃取法檢測(cè)到烤意大利板栗中香氣物質(zhì)，因其萃取時(shí)使用有機(jī)溶劑且分析樣品量大、操作過(guò)程復(fù)雜，在測(cè)定過(guò)程中很有可能造成部分香氣組分的損失；Künsch等[16]、Morini 等[17]、葉興乾等[18]相繼測(cè)定不同品種及不同加工方式中板栗的香氣成分，但并未對(duì)萃取頭及色譜柱的選用進(jìn)行篩選，局限了香氣種類的測(cè)定。固相微萃取方法（Solid Phace Microextraction, SPME）具有不需有機(jī)溶劑，分析樣品量少，操作簡(jiǎn)單、快速、費(fèi)用低，集采樣、萃取、濃縮及進(jìn)樣于一體等優(yōu)點(diǎn)，能有效避免香氣組分的損失[19]。為更好地了解燕山地區(qū)特有板栗品種的香氣成分及組成，本試驗(yàn)采用固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）聯(lián)用技術(shù)，通過(guò)比較在使用強(qiáng)極性色譜柱 HP-INNOWAX（60 m×0.25 mm，0.25 μm）條件下7 種不同萃取頭萃取香氣成分的差異，篩選出一種適合萃取板栗香氣的最佳效果的萃取頭，對(duì)“大板紅”、“冀栗 1 號(hào)”及“燕山早豐”3 個(gè)板栗品種的果實(shí)香氣成分進(jìn)行測(cè)定分析和比較，以期為板栗果實(shí)品質(zhì)鑒定及其香氣物質(zhì)的遺傳分析提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

以河北省農(nóng)林科學(xué)院昌黎果樹研究所孔莊基地13 年生的“大板紅”、“冀栗 1 號(hào)”及“燕山早豐”為試材，基地土壤肥沃，采用常規(guī)管理，樹體生長(zhǎng)良好。

D-葡萄糖酸內(nèi)酯、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpyrrolidone，PVPP）、4-甲基-2-戊醇(4M2P)、C7-C20正構(gòu)烷烴。

1.1.2 儀器與設(shè)備

GCMS-QP2010 型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本SHIMADZU 公司；HP-INNOWAX（60 m×0.25 mm，0.25 μm）極性色譜柱，美國(guó)Agilent 技術(shù)有限公司；ME303E/02 型電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Heraeus Megafuge 8R 型高速離心機(jī)，熱電實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司奧斯特羅德分公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集及處理

果實(shí)于成熟期采收。于樹冠外圍中部隨機(jī)摘取20 個(gè)果實(shí)，每個(gè)品種3 株。之后每品種隨機(jī)選取30個(gè)果實(shí)，果實(shí)去皮后稱取約50 g 用液氮冷凍，加入0.5 g D-葡萄糖酸內(nèi)酯和1 g PVPP，迅速破碎成粉末狀，置于-80 ℃冰箱中保存，用于香氣物質(zhì)的測(cè)定。

樣品取出后，迅速解凍，4 ℃條件下于8 000 r/min離心10 min，吸取上清液4 mL 置于樣品瓶中，加入10 μL 內(nèi)標(biāo)4-甲基-2-戊醇水溶液（1.038 8 g/L）后，迅速用帶有聚四氟乙烯隔墊的蓋子擰緊，靜置20 min，使揮發(fā)性成分在液體中、頂空和萃取頭三相中分布達(dá)到平衡，然后將老化過(guò)的萃取頭插入樣品瓶的頂空部分，在磁力加熱攪拌器上于40 ℃萃取30 min，取下萃取頭，立即在GC 進(jìn)樣口250 ℃條件下解析5 min。每個(gè)樣品重復(fù)萃取進(jìn)樣3 次。

1.2.2 萃取頭篩選

選擇7 種萃取頭對(duì)板栗果實(shí)香氣成分進(jìn)行萃取，比較萃取到的香氣種類，以期選擇1 個(gè)最佳萃取效果的萃取頭。各萃取頭在使用前根據(jù)使用說(shuō)明對(duì)萃取頭在一定的溫度下進(jìn)行一定時(shí)間的老化。各萃取頭特點(diǎn)見表1。

1.2.3 氣相色譜-質(zhì)譜條件分析

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀型號(hào)為GCMS-QP2010。氣相色譜條件：色譜柱為HP-INNOWAX（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣He 氣（純度 99.999%）；柱流量 1 mL/min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；色譜柱升溫程序?yàn)椋撼跏紲囟?0 ℃，保持 3 min，以 3.5 ℃/min 升至 120 ℃，保持3 min，再以 13 ℃/min 升至 250 ℃，保持 3 min；進(jìn)樣：不分流進(jìn)樣。質(zhì)譜條件：電離方式EI，電子能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍：30～500 amu，離子源溫度 230 ℃，接口溫度250 ℃。

1.2.4 香氣成分定性定量分析

定性方法：依據(jù)保留指數(shù)法進(jìn)行定性分析。正構(gòu)烷烴在同樣的氣相色譜-質(zhì)譜條件下進(jìn)樣，獲得正構(gòu)烷烴內(nèi)各組分的保留時(shí)間，利用自動(dòng)質(zhì)譜圖解卷積和鑒定系統(tǒng)（Automatic Mass Spectral Deconvolution andIdentification System，AMDIS）建立保留指數(shù)校正庫(kù)，利用保留指數(shù)及NIST11 譜庫(kù)，比對(duì)在同樣極性色譜柱條件下測(cè)得的香氣成分保留指數(shù)結(jié)果進(jìn)行定性，將定性結(jié)果依靠可信度強(qiáng)弱分類并詳細(xì)記錄，確定各化學(xué)成分。

表1 不同萃取頭涂層的使用調(diào)節(jié)指南Table 1 Conditioning guidelines of different SPME fiber coatings

定量方法：采用峰面積歸一法進(jìn)行各香氣組分的定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 萃取頭的選擇

由于各種萃取頭的涂層材料及涂層厚度不同，導(dǎo)致萃取頭的極性不同，所以各萃取頭對(duì)不同揮發(fā)性物質(zhì)的吸附能力也是不同的。根據(jù)“相似相溶”的原則，PDMS 為非極性萃取頭，其主要吸附為非極性物質(zhì)；PDMS/DVB 萃取頭為極性萃取頭，主要吸收極性揮發(fā)性醇類、胺類物質(zhì)；PA 萃取頭和DVB/CAR/PDMS 萃取頭為極性萃取頭，其中PA 的極性要弱于DVB/CAR/PDMS。運(yùn)用GC-MS-計(jì)算機(jī)聯(lián)用檢測(cè)技術(shù)，得到7 種不同萃取頭萃取到的板栗果實(shí)香氣成分總離子圖（圖1）。由圖1 可見，7 種萃取頭均能檢測(cè)到板栗果實(shí)的部分香氣成分，并且50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取頭檢測(cè)到的香氣成分中包括了其他6 種萃取頭所能檢測(cè)出的揮發(fā)性物質(zhì)?？傊?，通過(guò)比較7 種不同萃取頭對(duì)板栗果實(shí)香氣成分萃取效果發(fā)現(xiàn)，50/30 μm DVB/CAR/PDMS 的萃取效果明顯好于其他6 種萃取頭。因此，后續(xù)板栗果實(shí)香氣成分研究工作中將采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取頭。

圖1 7 種萃取頭得到的板栗果實(shí)香氣成分的GC-MS 總離子流圖Fig.1 Total ionic chromatograms of aroma components with 7 different fiber coatings

2.2 板栗果實(shí)香氣成分的測(cè)定分析

采用 50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取頭提取板栗品種“大板紅”、“冀栗1 號(hào)”及“燕山早豐”果實(shí)香氣成分，各組分質(zhì)譜經(jīng)與計(jì)算機(jī)譜庫(kù)NIST11 和Wiley檢索及保留指數(shù)分析，確認(rèn)其香氣成分，運(yùn)用峰面積歸一化法，求得各香氣成分的相對(duì)含量（表2）。由表2可見，從3 個(gè)板栗品種的果實(shí)中共檢測(cè)到62 種香氣成分，“大板紅”、“冀栗 1 號(hào)”及“燕山早豐”分別檢測(cè)到33、38 和34 種；各品種的主要香氣成分差異較大，且相對(duì)百分含量排在各品種板栗前10 位的芳香成分依次分別為己醛、3-戊烯-2-酮、乙酸己酯、庚醛、1-己醇、1-丁醇、2,3-丁二酮、乙酸丁酯、2-己烯醛、2-己醇；乙醛、3-戊烯-2-酮、庚醛、1-己醇、1-丁醇、反-2-辛烯醛、2-丁烯醛、1-庚醇、1-辛烯-3-醇、2-戊酮；己醛、3-戊烯-2-酮、庚醛、1-己醇、1-丁醇、1-庚醇、2,3-丁二酮、2-丁烯醛、2-戊酮、乙醛。3-戊烯-2-酮、庚醛和1-己醇在3 個(gè)品種中均具有較高的相對(duì)含量，含量在8%～13%，為板栗的主要香氣成分。

表2 燕山地區(qū)板栗品種香氣成分的GC-MS 分析Table 2 GC-MS analysis of aroma components in chestnuts cultivars in Yanshan region

續(xù)表2 燕山地區(qū)板栗品種香氣成分的GC-MS 分析Continue table 2 GC-MS analysis of aroma components in chestnuts cultivars in Yanshan region

2.2.1 醛類成分的差異

由表2 可見，醛類化合物是測(cè)定板栗果實(shí)香氣成分中相對(duì)含量最高的一類化合物，共檢測(cè)到11 種醛類化合物，“大板紅”、“冀栗 1 號(hào)”及“燕山早豐”3 個(gè)品種板栗分別為4 種、5 種、11 種，其相對(duì)含量分別為40.96%、38.78%和50.38%；檢測(cè)到共有醛類化合物有2 種，一種為庚醛，以“燕山早豐”的相對(duì)含量最高，達(dá)9.07%，分別是“大板紅”、“冀栗1 號(hào)”含量的1.13、1.10 倍；另一種為反-2-辛烯醛，以“冀栗1 號(hào)”的相對(duì)含量最高，達(dá)4.25%，分別是“大板紅”、“燕山早豐”含量的7.59、3.24 倍。板栗品種間成分差異較大，如“大板紅”和“燕山早豐”以C6 醛類中的己醛為主，相對(duì)含量最高，分別為30.24%、35.41%；而“冀栗1 號(hào)”中以乙醛為主，含量高達(dá)22.20%；同時(shí)，還分別從3 個(gè)品種中檢測(cè)到含量較低的反-2-辛烯醛、丁醛、2-丁烯醛等成分。

2.2.2 醇類成分的分析

由表2 可見，“大板紅”、“冀栗1 號(hào)”及“燕山早豐”3 個(gè)品種板栗香氣成分中檢測(cè)到19 種醇類，分別為13 種、13 種和12 種；而總醇的相對(duì)含量在20%左右，3 個(gè)品種分別為18.24%、23.67%、18.95%。醇類成分多為1-丁醇和C6 醇類（1-己醇），以“冀栗 1 號(hào)”果實(shí)中1-丁醇的相對(duì)含量最高，達(dá)4.96%，“大板紅”次之，“燕山早豐”最低（3.12%）；“燕山早豐”果實(shí)中 C6醇類（1-己醇）含量最高，為8.01%，“燕山早豐”次之，“大板紅”最低，僅為7.09%。

此外，從果實(shí)中檢測(cè)了到少量的3-甲基-1-丁醇、反-2-己烯-1-醇，1-戊醇、1-辛烯-3-醇等成分。

2.2.3 酮類成分的分析

由表 2 可見，“大板紅”、“冀栗 1 號(hào)”及“燕山早豐”3 個(gè)品種板栗香氣成分中檢測(cè)到11 種酮類，分別為4 種、8 種和5 種；而總酮的相對(duì)含量在20%左右，3 個(gè)品種分別為 15.91%、19.10%、17.11%。3 個(gè)品種板栗果實(shí)香氣成分中均以3-戊烯-2-酮相對(duì)含量最高，分別為11.76%、11.81%、12.56%。同時(shí)，還分別從3 個(gè)品種中檢測(cè)到含量較低的四氫-6-甲基-2H-吡喃-2-酮、3-羥基-2-丁酮、2-羥基3-戊酮等成分。

2.2.4 酯類和其他成分分析

3 個(gè)品種板栗果實(shí)中共檢測(cè)到2 種酯類成分，為乙酸丁酯和乙酸己酯。其中只有在“大板紅”中檢測(cè)到這兩種物質(zhì)，相對(duì)含量分別為2.25%、11.58%，而其他兩個(gè)板栗品種中均未檢測(cè)到酯類物質(zhì)。

其他香氣成分相對(duì)含量在1%以下，包括10 種烷烴、4 種呋喃、2 種胺、2 種酸和 1 種醚類。

2.3 香氣成分的類別比較

由表3 可以看出，在檢測(cè)到的9 類化合物中，參試的3 個(gè)板栗品種相對(duì)含量差異明顯。同一品種板栗不同種類化合物之間相對(duì)含量不同，“大板紅”以醛類、醇類、酮類和酯類為主，而“冀栗1 號(hào)”和“燕山早豐”以醛類、醇類和酮類為主；在同類化合物中，不同品種板栗的相對(duì)含量存在明顯差異，其中醛類以“燕山早豐”相對(duì)含量最高（50.38%），分別是“大板紅”與“冀栗 1 號(hào)”的 1.23、1.30 倍；醇類以“冀栗 1 號(hào)”最高（23.67%），分別是“大板紅”與“燕山早豐”的1.30、1.25 倍；而酮類以“冀栗1 號(hào)”相對(duì)含量最高（19.10%），分別是“大板紅”與“燕山早豐”的1.20、1.12 倍。

表3 不同板栗品種果實(shí)香氣成分類別及相對(duì)含量Table 3 Aroma categories and relative contents of different Chinese chestnuts cultivars

3 討論與結(jié)論

基于“相似相溶”的原理，不同材料的萃取頭對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)吸附具有選擇性。在參照以往研究的基礎(chǔ)上，采用更準(zhǔn)確可靠的SPME-GC-MS 聯(lián)用技術(shù)對(duì)不同品種板栗果實(shí)的香氣成分進(jìn)行研究，結(jié)果表明：使用色譜柱 HP-INNOWAX（60 m×0.25 mm，0.25 μm）分析時(shí)，萃取頭 DVB/CAR/PDMS（50/30 μm）萃取到的香氣種類最多，因此，在后續(xù)試驗(yàn)測(cè)定不同板栗品種的香氣成分時(shí)可選用，該方法可以快速準(zhǔn)確地提取到板栗的多種香氣成分。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)板栗特征香氣成分尚無(wú)統(tǒng)一認(rèn)識(shí)，丁內(nèi)酯和2-羥基-γ-丁內(nèi)酯這兩種內(nèi)酯類物質(zhì)具有愉快的水果香和堅(jiān)果香，一般被認(rèn)為是烤板栗的特征性香氣物質(zhì)[5,20]。本研究發(fā)現(xiàn)，3 個(gè)生板栗品種（未加工處理）中均含有大量庚醛、1-己醇和3-戊烯-2-酮等果香味的成分；“大板紅”和“燕山早豐”中含有大量果香味的己醛；而具有甜香味的乙酸丁酯和乙酸己酯僅在“大板紅”中被檢出，并且相對(duì)含量很高。該分析結(jié)果為后續(xù)研究不同品種間板栗果實(shí)特征香氣組分分析和品質(zhì)評(píng)價(jià)奠定了基礎(chǔ)。

本研究支持板栗品種間香氣成分種類和含量存在差異的觀點(diǎn)?！按蟀寮t”板栗果實(shí)中己醛、3-戊烯-2-酮、乙酸己酯、庚醛、1-己醇為其主要香氣成分；“冀栗1 號(hào)”板栗果實(shí)中乙醛、3-戊烯-2-酮、庚醛、1-己醇、1-丁醇為主要香氣成分；“燕山早豐”板栗果實(shí)中己醛、3-戊烯-2-酮、庚醛、1-己醇、1-丁醇為主要香氣成分。這與草莓、杏、柑橘和獼猴桃上的研究一致[21-25]。同時(shí)，還在“大板紅”板栗果實(shí)中檢測(cè)出乙酸丁酯、乙酸己酯2 種酯類物質(zhì)，這些成分的嗅覺(jué)閾值很低，其香氣值（濃度/閾值）很高[26]，對(duì)果實(shí)的香味也有重要影響，但在其他兩個(gè)板栗品種中均未檢測(cè)到這兩種物質(zhì)，因此，乙酸丁酯和乙酸己酯有可能是“大板紅”板栗的特有香氣物質(zhì)?！把帻垺卑謇踔卸?nèi)酯、糠醛和5-（羥甲基）-2-糠醛的含量較高[3]，王文艷等[20]研究發(fā)現(xiàn)板栗生粉中己醛和二氫-5-戊基-2（3H）-呋喃酮的含量很高。本研究中“大板紅”、“冀栗1 號(hào)”及“燕山早豐”3 個(gè)品種同時(shí)檢測(cè)到的芳香成分有10 種，各個(gè)品種果實(shí)中均含有3-戊烯-2-酮、庚醛、1-己醇、1-丁醇等重要的芳香成分，但相對(duì)含量存在差異。Krist 等[5]和 Morini 等[17]在板栗中檢測(cè)出 3-羥基-2-丁酮、甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪3 種物質(zhì)，認(rèn)為該3 種物質(zhì)為烤板栗和煮板栗的主要香氣成分。葉興乾等[18]在糖炒板栗中有檢出2-戊基-呋喃，該物質(zhì)具有果香、青香的香氣。本試驗(yàn)雖然在“大板紅”和“冀栗1號(hào)”中也檢測(cè)到該物質(zhì)，但相對(duì)含量很低，“燕山早豐”中沒(méi)有檢測(cè)出，可能跟板栗果實(shí)的加工處理方法有關(guān)。以上結(jié)果表明：板栗果實(shí)中香氣成分的種類及其相對(duì)含量的異同使不同品種果實(shí)既具有板栗果實(shí)基本的香味特征，又具有各自獨(dú)特的香味特點(diǎn)。為此，根據(jù)其特有的香氣成分，或可為品種或種群的劃分提供依據(jù)，具體方法有待進(jìn)一步深入分析。