酵母菌和雙歧桿菌發(fā)酵對大麥苗SOD 及抗氧化活性的影響

張 雪 ，邊傳周 ，唐桂芬 ，陳復(fù)生

（1.河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450011；2.河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院實驗中心省級重點實驗室，河南 鄭州 450011；3.河南工業(yè)大學(xué)，河南 鄭州 450000）

大麥苗是我國種植面積較廣的農(nóng)業(yè)資源，其幼苗富含葉綠素、類黃酮、維生素、抗氧化酶及蛋白質(zhì)等多種功能營養(yǎng)成分[1]?！侗静菥V目》記載：“麥苗解盅毒，除煩悶，解時疫狂熱，退胸隔熱，利小腸[2]”。目前，大麥苗加工方式簡單粗放，加工產(chǎn)品口感粗糙，不利于人體腸道的吸收和消化。為滿足人們?nèi)找嬖鲩L的營養(yǎng)健康需要，需深入研究大麥苗加工工藝，提高其功能成分含量，生產(chǎn)出易于人體消化的產(chǎn)品[3]。大麥苗粉是以大麥嫩葉加工而成的微粉，是超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶的豐富來源[4]，也是一種能增強人體免疫力的功能食品[5-6]。但其溶解性較低，難以充分體現(xiàn)大麥苗的市場價值和優(yōu)勢。

目前關(guān)于大麥苗精深加工的研究已有一些文獻(xiàn)報道。徐春[7]以新鮮大麥苗和鮮牛奶為主要原料，通過添加適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵劑及輔料，研制出一種口感良好的大麥苗酸乳；高飛虎等[8]以大麥苗和小麥粉作為主要原料，加工成富含麥綠素的營養(yǎng)面條，具有較好的食療功效；陳為鳳等[9]對大麥苗飲料的穩(wěn)定性進(jìn)行了探討。但同時采用酵母菌、雙歧桿菌分段發(fā)酵大麥苗，并探究組合發(fā)酵對大麥苗SOD 活性及抗氧化活性影響的研究較少報道。

本文以大麥苗粉為原料，以酵母菌和雙歧桿菌為菌種，分別采用SOD 活力和雙歧桿菌濃度為主要指標(biāo)，通過調(diào)配、分段發(fā)酵等步驟，對大麥苗的發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化。大麥苗可為酵母菌發(fā)酵提供碳源，同時其自身的組分被代謝轉(zhuǎn)化為次生產(chǎn)物，如超氧化物歧化酶的前體物；進(jìn)一步采用雙歧桿菌發(fā)酵，可使大麥苗中的酚類化合物形態(tài)轉(zhuǎn)化，從而提高其生物活性。本研究可為組合發(fā)酵改善大麥苗的功能特性提供理論依據(jù)，同時提升其經(jīng)濟效益和應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

大麥苗粉、D-阿洛酮糖：上?；菡\生物科技公司；酵母菌（食品級）：安琪酵母股份公司；雙歧桿菌（食品級）：北京川秀科技有限公司；三羥基氨基甲烷、濃鹽酸、乙二胺四乙酸二鈉、焦性沒食子酸、氫氧化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、氯化鈉、無水碳酸鈉、硫酸亞鐵、30%過氧化氫、磷酸氫二鈉（均為分析純）：國藥集團上?；瘜W(xué)試劑有限公司；超氧化歧化酶、福林酚，莫匹羅星鋰鹽和半胱氨酸鹽酸鹽改良乳酸菌（MRS）培養(yǎng)基（均為生化試劑）：國藥集團上?；瘜W(xué)試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

UV Power 紫外可見分光光度計：北京萊伯泰科儀器有限公司；PYX-DHS-500BS 恒溫培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；pHS-25 pH 計：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；SW-CJ-1F 超凈工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程

大麥苗粉→調(diào)配、均質(zhì)→酵母菌活化→接種→29 ℃發(fā)酵28 h→滅菌→冷卻→雙歧桿菌活化→接種→恒溫發(fā)酵→37 ℃發(fā)酵24 h→4 ℃冷藏→成品

1.2.2 操作要點

1.2.2.1 調(diào)配、均質(zhì)

大麥苗粉10 g，加500 mL 純凈水混合，攪拌充分溶解并均質(zhì)。

1.2.2.2 酵母菌活化

添加活性干酵母（Saccharomyces cerevisiae AM262831），將其加入試管中，按 1∶10（g/mL）加入去離子水（36 ℃），充分溶解，36 ℃恒溫水浴活化15 min。

1.2.2.3 接種

將活化液接種到麥苗汁（接種量0.85%），然后于29 ℃發(fā)酵28 h，定期通風(fēng)以保證充分溶氧。

1.2.2.4 雙歧桿菌活化

取雙歧桿菌（Bifidobacterium longum NCC2705）接種于10 mL 滅菌MRS 培養(yǎng)基中，接種量1%，活化3 次，每次 12 h。

1.2.2.5 接種

取1 mL 活化后的雙歧桿菌菌液，離心，去上清，加入1 mL 滅菌生理鹽水重懸，按1.5%的比例添加，混勻溶解后分裝前述酵母菌發(fā)酵液中，于37 ℃發(fā)酵24 h，置于 4 ℃后熟 12 h 即得樣品。

1.2.3 大麥苗酵母菌發(fā)酵工藝單因素試驗設(shè)計

雙歧桿菌對于營養(yǎng)成分利用的速率快于酵母菌，因此在麥苗的發(fā)酵過程中，先進(jìn)行酵母菌發(fā)酵，再進(jìn)行雙歧桿菌發(fā)酵[10]。

1.2.3.1 酵母菌發(fā)酵D-阿洛酮糖添加量的考察

固定發(fā)酵溫度29 ℃、pH 4.0、酵母接種量0.85%、發(fā)酵時間24 h，D-阿洛酮添加量分別為2%、4%、6%、8%、10%進(jìn)行發(fā)酵。結(jié)束發(fā)酵后，進(jìn)行SOD 活力測定，篩選D-阿洛酮糖最適添加量。

1.2.3.2 酵母菌發(fā)酵接種量的考察

固定發(fā)酵溫度29 ℃、pH 4.0、D-阿洛酮糖添加量6.0%、發(fā)酵時間24 h，分別接種0.25%、0.45%、0.65%、0.85%、1.05%酵母進(jìn)行發(fā)酵。結(jié)束發(fā)酵后，進(jìn)行SOD活力測定，篩選酵母菌最適接種量。

1.2.3.3 酵母菌發(fā)酵溫度的考察

固定pH 4.0、酵母接種量0.85%、D-阿洛酮糖添加量 6.0%、發(fā)酵時間 24 h，分別在 25、27、29、31、33 ℃條件下進(jìn)行發(fā)酵。結(jié)束發(fā)酵后，進(jìn)行SOD 活力測定，篩選最適發(fā)酵溫度。

1.2.3.4 酵母菌發(fā)酵時間的考察

固定發(fā)酵溫度29 ℃、pH 4.0、D-阿洛酮糖添加量6.0%、酵母接種量0.85%，分別發(fā)酵 6、12、18、24、30、36h。結(jié)束發(fā)酵后，進(jìn)行SOD 活力測定，篩選最適發(fā)酵時間。

1.2.4 大麥苗酵母菌發(fā)酵正交試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，以D-阿洛酮糖添加量、接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間四個因素設(shè)計L9(34)正交試驗（表1），仍選擇之前的指標(biāo)，研究麥苗酵母菌發(fā)酵的最佳工藝條件。

表1 大麥苗酵母菌發(fā)酵正交試驗設(shè)計Table 1 Orthogonal design of barley seedling yeast fermentation

1.2.5 大麥苗酵素雙歧桿菌發(fā)酵工藝優(yōu)化

在酵母菌發(fā)酵時間達(dá)到最佳，即SOD 活力達(dá)到最高時，向發(fā)酵液中接種雙歧桿菌，進(jìn)行雙歧桿菌發(fā)酵。

1.2.5.1 雙歧桿菌發(fā)酵pH 的研究

當(dāng)麥苗酵素酵母菌發(fā)酵SOD 活力達(dá)到最高值時，酵素液pH 降至3.0，而雙歧桿菌最適pH 在6.5附近，因此有必要對酵素液pH 做出調(diào)整，確定麥苗酵素雙歧桿菌發(fā)酵的最適pH。調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH，分別在初始 pH 6.1、6.3、6.5、6.7、6.9、7.1 條件下，接種2.0%雙歧桿菌，發(fā)酵24 h 后，取酵素液測定指標(biāo)，以確定麥苗酵素雙歧桿菌發(fā)酵階段的適宜初始pH。

1.2.5.2 雙歧桿菌發(fā)酵溫度的研究

將1.5%雙歧桿菌接種至發(fā)酵液，在發(fā)酵溫度分別為 33、35、37、39、41 ℃下，恒溫發(fā)酵 24 h，研究雙歧桿菌濃度和可滴定酸含量的變化。

1.2.5.3 雙歧桿菌發(fā)酵時間的研究

發(fā)酵溫度為38 ℃，將1.5%雙歧桿菌接種至發(fā)酵液，分別恒溫發(fā)酵 6、12、18、24、30、36、42、48 h，研究雙歧桿菌濃度和可滴定酸含量的變化。

1.2.5.4 雙歧桿菌發(fā)酵接種量的研究

發(fā)酵溫度為38 ℃，分別接種0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的雙歧桿菌，恒溫發(fā)酵24 h，研究雙歧桿菌濃度和可滴定酸含量的變化。

1.2.6 測定指標(biāo)與方法

1.2.6.1 發(fā)酵過程中理化指標(biāo)的測定

（1）SOD 活力

參照GB/T 5009.171—2003 中[11]的第二法和文獻(xiàn)[12]進(jìn)行測定。

式中：ΔA 為鄰苯三酚自氧化速率；ΔA′為 SOD 酶液抑制鄰苯三酚自氧化速率；4.5 為反應(yīng)液總體積，mL；V 為所加樣液體積，mL；D 為樣液的稀釋倍數(shù)。

（2）可滴定酸含量

參考文獻(xiàn)[13]和GB/T 12456—2008[14]中的方法測定。

（3）雙歧桿菌濃度

采用莫匹羅星鋰鹽和半胱氨酸鹽酸鹽改良MRS培養(yǎng)基對酵素液進(jìn)行平板接種計數(shù)，計算得出雙歧桿菌濃度，測定方法參考GB/T 4789.34—2016[15]。

1.2.6.2 抗氧化性指標(biāo)的測定

（1）總酚含量

配制0.2 mg/mL 3,4,5-三羥基苯甲酸標(biāo)液，分別量取標(biāo)液 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL 于比色管中，加入 1 mL 福林酚試劑、5 mL H2O 和 2 mL 10%Na2CO3，去離子水定容到刻度，760 nm 下測吸光度A760，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以0.5 mL 酵素液代替標(biāo)液重復(fù)上述步驟，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算總酚含量[16]。

（2）羥基自由基清除率

參考文獻(xiàn)[17-18]中的方法，略有改動。取稀釋10 倍的樣品1mL 于試管中，依次加入1 mL 鄰菲咯啉、1.5 mL 0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.4）、1 mL 0.75 mmol/L FeSO4和 1 mL 0.01%H2O2溶液，混勻后于 37 ℃水浴避光反應(yīng)30 min，536 nm 波長處測吸光度。以H2O2和不加樣品為空白。按下式計算羥自由基清除率：

式中：A0為不加樣品組的吸光度值；A1為樣品組的吸光度值；A 為以水代替樣品和H2O2組的吸光度值。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)均為3 次重復(fù)試驗的平均值，應(yīng)用SPSS 9.0進(jìn)行顯著性和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌發(fā)酵工藝優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 酵母菌發(fā)酵D-阿洛酮糖添加量的考察

D-阿洛酮糖作為一種新型的低熱量功能甜味劑，其甜度是蔗糖的70%，但熱量僅為蔗糖的0.3%，且與其他D-酮糖相比，其具有良好的乳化穩(wěn)定性和抗氧化性能，可改善產(chǎn)品的風(fēng)味、色澤及口感[19-21]，在食品研發(fā)中具有重要意義。由圖1 可知，D-阿洛酮糖可為酵母菌的發(fā)酵提供碳源，隨著D-阿洛酮糖添加量的逐漸增加，SOD 活力也隨之增大，添加量達(dá)到6%時，SOD 活力達(dá)到45.62 U/mL，D-阿洛酮糖添加量繼續(xù)增加，滲透壓增大，導(dǎo)致SOD 活力降低，且考慮到成本，故選取D-阿洛酮糖添加量在6%左右進(jìn)行正交試驗。

圖1 D-阿洛酮糖添加量對SOD 活力的影響Fig.1 Effects of D-allulose additions on SOD activities

2.1.2 酵母菌接種量的考察

由圖2 可知，隨著酵母菌接種量的增大，代謝速度加快，導(dǎo)致發(fā)酵液中SOD 活力隨之增大，當(dāng)添加量達(dá)到0.85%時，SOD 活力達(dá)到最高峰，其值為56.46 U/mL，添加量高于0.85%后，SOD 活力逐漸下降，可能是由于隨著發(fā)酵液內(nèi)菌體數(shù)量的增加，菌體間互相爭奪碳源等營養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致酵母菌代謝能力下降；同時酵母菌添加量過多，酵母菌自溶，從而使SOD 活力下降，故選取酵母菌添加量在0.85%左右進(jìn)行正交試驗。

圖2 酵母菌接種量對SOD 活力的影響Fig.2 Effects of yeast inoculation amounts on SOD activities

2.1.3 酵母菌發(fā)酵溫度的考察

20～30 ℃是酵母菌生長的最適溫度[22]。由圖3 可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，酵母菌代謝速度加快，SOD活力隨之增加，29 ℃時，SOD 活力值達(dá)到最大，為45.76 U/mL，溫度繼續(xù)升高時，酵母菌的活性受到抑制，SOD 活力逐漸減小，故選取發(fā)酵溫度29 ℃左右進(jìn)行正交試驗。

圖3 發(fā)酵溫度對SOD 活力的影響Fig.3 Effects of fermentation temperatures on SOD activities

2.1.4 酵母菌發(fā)酵時間的考察

由圖4 可知，發(fā)酵液中SOD 活力隨發(fā)酵時間的延長呈遞增趨勢，至24 h 時，酵母菌充分利用碳源，產(chǎn)生大量SOD，SOD 活力增加至最大值43.51 U/mL。由于SOD 是含金屬的酶，金屬離子是輔基，因此隨著發(fā)酵時間的繼續(xù)延長，酵母菌代謝產(chǎn)生的Fe3+和Mn2+數(shù)量增多，它們對酵母菌生長和SOD 活力有較明顯的抑制作用，SOD 活力開始逐漸下降，故選取發(fā)酵時間24 h 左右進(jìn)行正交試驗，李凡等[23]的研究也得出了相似的結(jié)果。

圖4 酵母菌發(fā)酵時間對SOD 活力的影響Fig.4 Effects of yeast fermentation times on SOD activities

2.1.5 大麥苗酵母菌發(fā)酵正交試驗結(jié)果

由表2 可知，影響大麥苗酵母菌發(fā)酵各因素的主次順序為：B＞D＞C＞A，即酵母菌接種量對SOD 活力的影響最大，其次是發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度，D-阿洛酮糖添加量的影響最??；所得出的大麥苗酵母菌發(fā)酵最優(yōu)方案為A2B2C3D3，即D-阿洛酮糖添加量6%，酵母菌接種量0.85%，發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵時間28 h，以此組合再次進(jìn)行驗證發(fā)酵，制成的麥苗酵素SOD活力最高，達(dá)76.9 U/mL。

2.2 麥苗酵素雙歧桿菌發(fā)酵工藝優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 雙歧桿菌發(fā)酵初始pH 的研究

發(fā)酵液的酸堿度是雙歧桿菌發(fā)酵的重要條件之一。由圖 5 可知，雙歧桿菌發(fā)酵最適 pH 在 6.5～6.9，在此pH 范圍內(nèi)，雙歧桿菌濃度及可滴定酸含量均最佳且穩(wěn)定，pH 高于或低于此范圍，指標(biāo)值均出現(xiàn)下降，權(quán)衡到酵母菌的生長，初始pH 為6.5 較為適宜。

2.2.2 雙歧桿菌發(fā)酵溫度的研究

由圖6 可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，雙歧桿菌代謝速度加快，雙歧桿菌濃度和可滴定酸含量大幅度增大，當(dāng)發(fā)酵溫度在37～39 ℃時，雙歧桿菌濃度和可滴定酸含量均達(dá)到最佳；當(dāng)發(fā)酵溫度＞39 ℃時，指標(biāo)值均快速減小?？紤]到能耗，選擇發(fā)酵溫度37 ℃較適宜。

表2 酵母菌發(fā)酵產(chǎn)SOD 活力的正交試驗結(jié)果Table 2 Orthogonal test result of SOD activities produced after yeast fermentation

圖5 初始pH 對雙歧桿菌濃度及可滴定酸含量的影響Fig.5 Effects of initial pH on bifidobacteria concentrations and titratable acidity contents

圖6 發(fā)酵溫度對雙歧桿菌濃度及可滴定酸含量的影響Fig.6 Effects of fermentation temperatures on bifidobacteria concentrations and titratable acidity contents

2.2.3 雙歧桿菌發(fā)酵時間的研究

由圖7 可知，隨著發(fā)酵時間的延長，雙歧桿菌不斷利用酵母菌發(fā)酵后樣液中的營養(yǎng)物質(zhì)，同時產(chǎn)生大量的酸，使得酸度值處于上升趨勢，但當(dāng)發(fā)酵時間＞24 h，雙歧桿菌數(shù)量和可滴定酸含量增加趨緩，考慮到實際生產(chǎn)的效率，將發(fā)酵時間定為24 h。

圖7 發(fā)酵時間對雙歧桿菌濃度及可滴定酸含量的影響Fig.7 Effects of fermentation times on bifidobacteria concentrations and titratable acidity contents

2.2.4 雙歧桿菌接種量的研究

由圖8 可知，隨著雙歧桿菌接種量的增大，雙歧桿菌濃度和可滴定酸含量增加迅速，當(dāng)接種量增加至1.5%時，雙歧桿菌濃度和可滴定酸含量增加趨緩，維持在5.89×109CFU/mL 和0.28%左右的水平；考慮到成本，雙歧桿菌接種量為1.5%較為適宜。

圖8 雙歧桿菌接種量對雙歧桿菌濃度及可滴定酸含量的影響Fig.8 Effects of bifidobacteria inoculation amounts on bifidobacteria concentrations and titratable acidity contents

2.3 抗氧化性分析結(jié)果

對制得的酵素總酚含量和羥基自由基清除率進(jìn)行了測定，同時以未發(fā)酵的大麥苗液作為對照，結(jié)果見表3。

由表3 可知，大麥苗酵素的總酚含量比對照組提高了81.63%，大麥苗酵素的羥基自由基清除率比未發(fā)酵對照組提高了109.03%，表明發(fā)酵可使大麥苗總酚含量和羥基自由基清除率顯著提高，這與郭艷萍等[24]的研究結(jié)果一致。

表3 麥苗酵素總酚和羥基自由基清除率對比Table 3 Comparison of total phenols contents and hydroxyl radical scavenging rates of wheat seedling enzymes

3 結(jié)論

通過單因素和正交試驗，確定大麥苗粉酵母菌發(fā)酵的最佳工藝條件為：D-阿洛酮糖添加量6%，酵母菌接種量0.85%，發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵時間28 h，制成的麥苗酵素SOD 活力最高，達(dá)76.9 U/mL；然后將發(fā)酵液pH 調(diào)至6.5，接種1.5%雙歧桿菌，發(fā)酵溫度37 ℃，發(fā)酵24 h，此條件下樣品的雙歧桿菌濃度和可滴定酸含量指標(biāo)最佳；同時對樣品的抗氧化活性進(jìn)行初步研究，結(jié)果表明酵母菌和雙歧桿菌組合發(fā)酵大麥苗粉酵素的總酚含量、羥基自由基清除率比對照組分別提高了81.63%和109.03%，顯示了較好的抗氧化活性。