結(jié)核感染T 細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)在肺結(jié)核合并糖尿病診斷中的作用

王喜泰，陳創(chuàng)坤，鄭智鑫，陳挺陽(yáng)

汕頭市澄海區(qū)人民醫(yī)院感染科，廣東汕頭 515800

肺結(jié)核是臨床上比較棘手的疾病之一， 我國(guó)是全球結(jié)核病發(fā)病率較高的一個(gè)國(guó)家，疫情十分復(fù)雜。 研究指出[1-3]結(jié)核病的危險(xiǎn)因素較多，比如男性、飲酒、吸煙、腎臟疾病、體重過(guò)輕、家庭接觸、糖尿病等。 按照國(guó)際糖尿病聯(lián)盟公布的資料[4]，發(fā)現(xiàn)全球20～79 歲成人中糖尿病患病率接近10%。 一些報(bào)道與臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)[5]，臨床收治的肺結(jié)核患者中部分患者合并糖尿病， 導(dǎo)致其臨床診斷難度增加，甚至?xí)蓴_診斷結(jié)果，這為臨床診斷方法的選擇提出了難題。 過(guò)去診斷結(jié)核病的方式主要有結(jié)核菌素試驗(yàn)（TST）檢查、痰抗酸桿菌涂片、結(jié)核感染T 細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)（T-SPOT.TB）、結(jié)核菌培養(yǎng)及結(jié)核抗體檢測(cè)等，其中結(jié)核菌培養(yǎng)是診斷結(jié)核病的金標(biāo)準(zhǔn)，但其細(xì)菌培養(yǎng)速度緩慢，無(wú)法滿(mǎn)足及時(shí)、快速診斷的要求[6]；結(jié)核抗體檢測(cè)準(zhǔn)確度雖然比其他診斷方式高，但費(fèi)用高昂，技術(shù)要求高，對(duì)于一些家庭條件差、醫(yī)院設(shè)施差的地方難以廣泛開(kāi)展[7]；T-SPOT.TB 診斷以抗原特異性T 細(xì)胞反應(yīng)作為理論基礎(chǔ)，價(jià)格合適，有一定的推廣應(yīng)用條件。 為了進(jìn)一步分析肺結(jié)核合并糖尿病診斷中應(yīng)用T-SPOT.TB 的作用， 該院就2018 年5 月—2020年5 月收治的肺結(jié)核合并糖尿病患者30 例與單純糖尿病未合并肺結(jié)核患者30 例進(jìn)行了對(duì)照研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機(jī)選擇該院收治的肺結(jié)核合并糖尿病患者30例作為觀察組， 同期收治的單純糖尿病未合并肺結(jié)核患者30 例作為對(duì)照組。 對(duì)照組：男17 例、女13 例；年齡30～78 歲，平均（45.84±10.22）歲；糖尿病病程1～18年，平均（7.66±1.52）年。 觀察組：男16 例、女14 例；年齡36～78 歲，平均（46.99±10.16）歲；糖尿病病程1～19年，平均（7.83±1.72）年；初治肺結(jié)核25 例、復(fù)治肺結(jié)核5 例。兩組患者年齡、性別、病程比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。此外，該研究經(jīng)該院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

診斷標(biāo)準(zhǔn)： 肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)參考中華醫(yī)學(xué)會(huì)結(jié)核病學(xué)分會(huì)制定的有關(guān)于《肺結(jié)核診斷和治療指南》中的肺結(jié)核標(biāo)準(zhǔn)[8]。 糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)參考2012 年美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)（ADA）制定的《ADA 糖尿病診療指南》中有關(guān)于糖尿病標(biāo)準(zhǔn)[9]：糖化血紅蛋白≥6.5%，或空腹血糖不低于7.0 mmol/L；或75 g 口服葡糖糖耐量試驗(yàn)2 h 血糖不低于11.1 mmol/L。

納入標(biāo)準(zhǔn)：觀察組滿(mǎn)足肺結(jié)核標(biāo)準(zhǔn)與糖尿病標(biāo)準(zhǔn)；對(duì)照組滿(mǎn)足糖尿病標(biāo)準(zhǔn)且排除肺結(jié)核；臨床資料完整；簽署知情同意書(shū)。 排除標(biāo)準(zhǔn)：依從性差者；合并嚴(yán)重心肝腎病變者；合并惡性腫瘤者；合并硅沉著病者；合并HIV 感染者；妊娠期或哺乳期；精神疾病者；合并免疫系統(tǒng)疾病者。

1.2 方法

1.2.1 痰抗酸桿菌涂片診斷 抽取早晨、夜間、即時(shí)痰液3 份，留取痰樣本放在特制痰盒，用折斷的竹簽挑取痰樣本中膿樣、干酪樣或可疑部分0.05～0.1 mL，放置在載玻片正面靠右2/3 處， 均勻涂抹為卵圓形痰膜， 面積10 mm×20 mm。 痰膜朝上靜置， 自然干燥后染色及鏡檢。 干燥的痰涂片經(jīng)火焰固定5 s，往痰膜滴入石碳酸復(fù)紅溶液，將痰膜蓋滿(mǎn)，然后加熱，直到蒸汽出現(xiàn)后停止，加熱期間勿讓染色液沸騰。 染色5 min，以水沖凈，加入5%鹽酸乙醇脫色液，直到完全去掉紅色，加入亞甲藍(lán)復(fù)染30 s，以水沖洗、晾干、讀片。 讀片時(shí)按照從左往右原則，完成這邊讀片時(shí)，就應(yīng)縱向往下轉(zhuǎn)換視野，從右往左觀察，以此類(lèi)推。 讀片時(shí)按照《中國(guó)結(jié)核病防治規(guī)劃實(shí)施工作指南》 中的有關(guān)規(guī)定轉(zhuǎn)換300 個(gè)視野觀察，連續(xù)300 個(gè)視野觀察均無(wú)檢出抗酸桿菌，判斷為陰性；轉(zhuǎn)換300 個(gè)視野時(shí)，菌數(shù)1～8 條為抗酸桿菌陽(yáng)性（+）；轉(zhuǎn)換100 個(gè)視野時(shí)，菌數(shù)3～9 條為抗酸桿菌陽(yáng)性（1+）；轉(zhuǎn)換10 個(gè)視野時(shí)，菌屬1～9 條為抗酸桿菌陽(yáng)性（2+）； 在每個(gè)視野均可顯示1～9 條菌數(shù)則為為抗酸桿菌陽(yáng)性（3+）[10]。

1.2.2 TST 診斷 采用結(jié)核菌純蛋白衍生物注射液 （生產(chǎn)批號(hào)20170211）0.1 mL，于左側(cè)前臂內(nèi)側(cè)以孟都法注射，讓注射部位形成皮丘。 待72 h，觀察有無(wú)硬結(jié)，有硬結(jié)則測(cè)量硬結(jié)的直徑，并進(jìn)行判斷。 硬結(jié)直徑＜5 mm 評(píng)估為陰性（-），直徑5～9 mm 評(píng)估為弱陽(yáng)性（+），直徑10～19 mm 評(píng)估為陽(yáng)性（++），直徑不低于20 mm 評(píng)估為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）[11]。

1.2.3 T-SPOT.TB 診斷 選擇T-SPOT.TB 試劑盒（生產(chǎn)批號(hào)20170807）檢測(cè)，嚴(yán)格按照儀器說(shuō)明書(shū)執(zhí)行。 先用肝素鈉抗凝管收集外周靜脈血5 mL，常規(guī)分離后，根據(jù)密度梯度離心制備單個(gè)核細(xì)胞，其中離心參數(shù)包括半徑1 cm、速率7 000 r/min、時(shí)間10 min。 然后實(shí)施洗滌，將內(nèi)源性γ 干擾素除去。 獲取的樣本加γ 干擾素抗體平板內(nèi)，每孔100 μl。于陽(yáng)性對(duì)照孔內(nèi)加入5 mg/L 植物血凝素5 μl，陰性對(duì)照孔不加任何刺激素。 實(shí)驗(yàn)孔內(nèi)加入蛋白培養(yǎng)液10 與早期分泌靶性抗原6， 并將最終濃度控制在5 mg/L。 取細(xì)胞混懸液制備為1∶5 細(xì)胞稀釋液，計(jì)數(shù)，并加樣孵育，時(shí)間16～20 h，培養(yǎng)結(jié)束，洗板，加檢測(cè)抗體、親和素各孵育1 h，顯色后再洗板，晾干后鏡下檢查與計(jì)數(shù)斑點(diǎn)情況，做好記錄。 T-SPOT.TB 診斷標(biāo)準(zhǔn)參考如下：陰性對(duì)照品斑點(diǎn)數(shù)不超過(guò)5，且A 或B 孔斑點(diǎn)與陰性斑點(diǎn)數(shù)差值不低于6，或陰性對(duì)照品斑點(diǎn)數(shù)不低于6， 且A 或B 孔斑點(diǎn)數(shù)不低于2 倍陰性對(duì)照斑點(diǎn)數(shù)為陽(yáng)性；若A 孔與B 孔斑點(diǎn)數(shù)不滿(mǎn)足陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)，但陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)良好為陰性[12]。

1.3 觀察指標(biāo)

將臨床病理診斷結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)， 比較兩組3 種檢查方式相關(guān)結(jié)果，予以統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

選擇SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料的表達(dá)方式為[n(%)]，采用χ2檢驗(yàn)， P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 T-SPOT.TB 診斷兩組患者符合率情況

T-SPOT.TB 診斷兩組符合率分別為90.00%、93.33%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 見(jiàn)表1。

表1 T-SPOT.TB 診斷兩組符合率情況比較[n(%)]

2.2 TST 診斷兩組患者符合率情況

TST 診斷兩組符合率分別為56.67%、83.33%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 見(jiàn)表2。

表2 TST 診斷兩組符合率比較[n(%)]

2.3 痰抗酸桿菌涂片診斷兩組患者符合率情況

痰抗酸桿菌涂片診斷兩組符合率分別為30.00%、96.67%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 見(jiàn)表3。

表3 痰抗酸桿菌涂片診斷兩組患者符合率比較[n(%)]

2.4 3 種診斷方式符合率比較

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示T-SPOT.TB 診斷觀察組符合率明顯高于其他兩種檢測(cè)方法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但在診斷對(duì)照組符合率上3 種檢測(cè)方法差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。 見(jiàn)表4。

表4 3 種診斷方式符合率對(duì)比[n(%)]

3 討論

肺結(jié)核與糖尿病均為全球公共衛(wèi)生問(wèn)題， 按照世界衛(wèi)生組織在2011 年的報(bào)道顯示[13]，全球結(jié)核病發(fā)病人數(shù)與死亡人數(shù)分別為870 萬(wàn)、140 萬(wàn)， 而近幾年肺結(jié)核病發(fā)病率與病死率居高不下， 嚴(yán)重影響患者的正常生活、工作及學(xué)習(xí)，需引起重視。 多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)[14]，糖尿病是肺結(jié)核獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一， 同時(shí)在多項(xiàng)薈萃分析中指出糖尿病患者罹患肺結(jié)核的相對(duì)危險(xiǎn)達(dá)到3.11。糖尿病患者更易發(fā)生肺結(jié)核的原因可能和血糖控制不良有關(guān)，加上肺結(jié)核合并糖尿病臨床癥狀、影像學(xué)不典型，容易誤診，為此尋求一種早期快速診斷肺結(jié)核合并糖尿病的方式十分關(guān)鍵。 肺結(jié)核傳統(tǒng)診斷方式較多，如涂片法、細(xì)菌培養(yǎng)法、結(jié)核抗體法、影像學(xué)檢查、紅細(xì)胞沉降率等，但都或多或少有明顯缺陷，應(yīng)用有局限性。T-SPOT.TB 檢查作為酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)展出的結(jié)核桿菌檢測(cè)新技術(shù)，在一些地區(qū)逐漸推廣起來(lái)，證實(shí)在肺結(jié)核及其合并疾病診斷中有不錯(cuò)的價(jià)值。

該次就該院收治的肺結(jié)核合并糖尿病與單純糖尿病患者進(jìn)行T-SPOT.TB 診斷研究， 同時(shí)和傳統(tǒng)診斷方式TST 診斷、痰抗酸桿菌涂片診斷進(jìn)行對(duì)照，將臨床病理結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)， 最終發(fā)現(xiàn)T-SPOT.TB 診斷肺結(jié)核合并糖尿病、 單純糖尿病的符合率為90.00%與93.33%，TST 診斷則為56.67%與83.33%，痰抗酸桿菌涂片則為30.00%與96.67%，比較發(fā)現(xiàn)在肺結(jié)核合并糖尿病上TSPOT.TB 診斷符合率明顯高于TST 診斷、 痰抗酸桿菌涂片（P＜0.05）。 該研究結(jié)果與同類(lèi)研究相似，劉立虎等學(xué)者[15]對(duì)104 例呼吸科收治的患者研究，其中確診為肺結(jié)核合并糖尿病的54 例為試驗(yàn)組，其余為未合并結(jié)核病的糖尿病是對(duì)照組， 實(shí)施TST、T-SPOT.TB 及痰抗酸桿菌涂片檢查，發(fā)現(xiàn)T-SPOT.TB 檢查靈敏度為90.7%，顯著高于TST 的55.6%、痰抗酸桿菌涂片檢查的24.1%（P＜0.05）。 TST 作為診斷肺結(jié)核輔助試驗(yàn)，是檢測(cè)機(jī)體有無(wú)結(jié)核變態(tài)反應(yīng)的方式，價(jià)格低廉、操作簡(jiǎn)單，滿(mǎn)足國(guó)情需求，但受到主觀因素、卡介苗接種、機(jī)體免疫水平等干擾，會(huì)有假陽(yáng)性或假陰性，無(wú)法排除非結(jié)核分枝桿菌感染，特別是糖尿病血糖較高水平下，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)受損， 合并肺結(jié)核后血清學(xué)檢測(cè)與TST 檢測(cè)出現(xiàn)假陰性幾率更高。 痰抗酸桿菌涂片盡管可作為金標(biāo)準(zhǔn)，但其培養(yǎng)周期較長(zhǎng)， 痰涂片陽(yáng)性率比單純肺結(jié)核陽(yáng)性率高， 可受到主觀因素與醫(yī)院條件限制， 陽(yáng)性率普遍不高。 T-SPOT.TB 診斷可根據(jù)γ-干擾素釋放試驗(yàn)（IGRAs）原理，用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)完成檢測(cè)，而IGRAs可檢測(cè)全血或分離后的全血中單核細(xì)胞于結(jié)核分枝桿菌上的特異性抗原刺激下的γ-干擾素含量， 從而判斷被試是否有結(jié)核分枝桿菌感染。 越來(lái)越多的研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)IGRAs 對(duì)潛伏性結(jié)核感染與活動(dòng)性肺結(jié)核診斷有良好的特異度與靈敏度， 受到了廣泛關(guān)注。 此外，TSPOT.TB 診斷以結(jié)核分枝桿菌特有基因片段（RDI 基因序列編碼ESAT-6、CFP-10 兩種蛋白質(zhì)）作為特異性抗原刺激特異性T 淋巴細(xì)胞，產(chǎn)生IFN-γ，經(jīng)測(cè)定其含量，可診斷結(jié)核分枝桿菌感染情況， 從而避開(kāi)普遍缺失前述蛋白的BCG 與非結(jié)核桿菌影響， 因這兩種蛋白沒(méi)在卡介苗與絕大部分非結(jié)核分枝桿菌基因組中編碼，為此有良好的特異性。

綜上所述， 肺結(jié)核合并糖尿病診斷中應(yīng)用結(jié)合感染T 細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)檢查，相比痰抗酸桿菌涂片、結(jié)核菌素試驗(yàn)檢查可進(jìn)一步提高診斷符合率。