胃癌中DNA甲基化對(duì)miR-200c 141表達(dá)組分析

張睿 張郭亮 王飛娟

(銅川市人民醫(yī)院，1.腫瘤科;2.重癥科,陜西 銅川 727000)

miRNA在腫瘤因子的萌芽、發(fā)展以及轉(zhuǎn)歸的過(guò)程中起著巨大的作用，為醫(yī)學(xué)界對(duì)腫瘤的研究提供了新思路、新方向[1-2]。竇維佳等[3]研究中表明miR-200c與miR-141在結(jié)腸癌組織中具有增加癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的作用。近年來(lái)，隨著科技的迅速發(fā)展，對(duì)于腫瘤疾病的靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)的更新?lián)Q代速度也在逐步加快，腫瘤疾病的研究也在不斷深入[4]。然而，目前醫(yī)學(xué)界仍尚未明確miR-NAs自身的調(diào)控機(jī)制[5]。近期有學(xué)者在研究中指出，DNA甲基化通過(guò)調(diào)節(jié)miR-200 c以及miR-141的水平對(duì)于一些腫瘤因子和正常細(xì)胞的表達(dá)起著重要的作用，但是在胃癌中表達(dá)的調(diào)控機(jī)制上不明確[6]。鑒于此，本次研究旨在為臨床研究miR-200 c/141在胃癌中表達(dá)的調(diào)控機(jī)制提供參考依據(jù)。報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取我院2018年2月至2019年2月收治的58例胃癌患者納入至本次調(diào)研中，所有患者均接受胃癌根治術(shù)治療，且術(shù)前為接受任何放化療或新輔助治療。收集患者非壞死部分的腫瘤組織以及距腫瘤組織5 cm以上的癌旁組織作為檢測(cè)標(biāo)本，樣本收集完成后全部放置在凍存管中進(jìn)行保存。收集患者的相關(guān)病例資料，在收集的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)有1例患者的數(shù)據(jù)資料遺漏，58例患者中男性45例，女性12例；年齡42～76歲，平均(54.73±2.56)歲。

1.2檢測(cè)所用試劑 Trizol試劑、GoTaq? Hot Start Green Master Mix、GoTaq? qPCR Master Mix以及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均來(lái)自于上海玉博生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1PCR擴(kuò)增 實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)人員按照GoTaq? Hot Start Green Master Mix的說(shuō)明書進(jìn)行操作，將通過(guò)亞硫酸鹽處理后的DNA作為試驗(yàn)?zāi)０?，進(jìn)行PCR反應(yīng)檢測(cè)。檢驗(yàn)結(jié)果顯示miR-200 c/141-M(miR-200 c/141甲基化引物)上游引物為：5′-GTAAATCGGTGTGTGTCGCGGGTCG-3′；下游引物為：5′-CAAACCCTCCGAAACCCCTCGACCG-3′。miR-200 c/141-UM(miR-200 c/141非甲基化引物)上游引物為：5′-GTAAATTGGTGTGTGTTGTGGGTTG-3′；下游引物為5′-CAAACCCTCCAAAACCCCTCAACCA-3′。所有檢測(cè)標(biāo)本皆設(shè)置為空白對(duì)照，采用2.0%瓊脂糖凝膠將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，觀察軟件掃描結(jié)果，判斷甲基化率。

1.3.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR 利用Trizol試劑提取胃癌組織或癌細(xì)胞中的RNA，并進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將miRNA或mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后根據(jù)GoTaq? qPCR Master Mix說(shuō)明書中所提供的內(nèi)容調(diào)配反應(yīng)溶劑，然后根據(jù)PCR反應(yīng)溶劑檢測(cè)情況判斷檢測(cè)結(jié)果。檢測(cè)中應(yīng)用到的特異引物為：hsa-miR-200 c-RT：GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGATCCATC；hsa-miR-200 c-Forward：GGCCTAATACTGCCGGGTAAT；hsa-miR-141-RT：GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCATCT；hsa-miR-141-Forward：CCCGGGTAACACTGTCTGGTAA。

1.4觀察指標(biāo) (1)觀察并分析miR-200 c以及miR-141在胃癌組織中的表達(dá)水平情況；(2)統(tǒng)計(jì)所有胃癌患者標(biāo)本中miR-200 c/141CpG島的甲基化水平；(3)分析miR-200 c/141CpG島的甲基化水平與miR-200 c以及miR-141之間的關(guān)系。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0分析，計(jì)數(shù)資料miR-200 c以及miR-141在胃癌組織中的表達(dá)水平、所有胃癌患者標(biāo)本中miR-200 c/141CpG島的甲基化水平，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，以%表示，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義為P<0.05。

2 結(jié) 果

2.1miR-200 c以及miR-141在胃癌組織中的表達(dá)水平情況對(duì)比 58例胃癌患者標(biāo)本中(1例數(shù)據(jù)資料遺漏)，miR-200 c和miR-141的表達(dá)下調(diào)例數(shù)分別是44例、42例，占比為77.19%、73.68%，通過(guò)觀察可知，較之于癌旁組織標(biāo)本，胃癌組織中的miR-200 c和miR-141的表達(dá)有明顯下降(P<0.05)。見圖1。

圖1 miR-200 c以及miR-141在胃癌組織中的表達(dá)水平情況對(duì)比

2.2所有胃癌患者標(biāo)本中miR-200 c/141CpG島的甲基化水平情況對(duì)比 58例胃癌患者標(biāo)本中(1例數(shù)據(jù)資料遺漏)，miR-200 c/141CpG島的甲基化水平上升的例數(shù)為47例，占比為82.46%；通過(guò)觀察可知，較之于癌旁組織標(biāo)本，胃癌組織中的miR-200 c/141CpG島的甲基化水平有明顯上升(P<0.05)。見圖2。

圖2 所有胃癌患者標(biāo)本中miR-200 c/141CpG島的甲基化水平情況對(duì)比

2.3miR-200 c/141CpG島的甲基化水平與miR-200 c以及miR-141之間的關(guān)系 miR-200 c/141CpG島的甲基化水平與miR-200 c/141表達(dá)水平為負(fù)相關(guān)關(guān)系。

3 討 論

胃癌是臨床上常見的消化道腫瘤，具有高發(fā)病率、高死亡率等特點(diǎn)[7]。近年來(lái)我國(guó)胃腸疾病患者的數(shù)量不斷增加[8]。胃癌是胃腸疾病病變的終極表現(xiàn)，也是最有可能導(dǎo)致人體死亡的疾病，此外有研究表明胃癌手術(shù)有可能因手術(shù)時(shí)間長(zhǎng)、感染等因素誘發(fā)重癥肺炎、重癥腹腔感染，且入住重癥監(jiān)護(hù)室(ICU)后還有較高風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生ICU綜合征，嚴(yán)重影響了患者的生命安全[9]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WTO)的調(diào)查結(jié)果顯示，東亞地區(qū)是全球胃癌疾病的高發(fā)區(qū)域，其中我國(guó)胃癌病死率接近與全球胃癌死亡人口的五分之二[10-11]。因此，如何改善胃癌患者的治療環(huán)境，降低胃癌患者的病死率成為我國(guó)乃至全球醫(yī)學(xué)界需要重點(diǎn)研究的問題[12]。近幾十年來(lái)，醫(yī)學(xué)界的工作人員通過(guò)不斷研究，發(fā)現(xiàn)了miRNAs在腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展過(guò)程中起著中要的作用，能有效抑制腫瘤因子的成長(zhǎng)[13]。

作為一種小分子非編碼RNA，miRNAs其種類多樣，其中最常見的是miR-200，而miR-200 c、miR-141是miR-200組合中的重要組成部分，其主要分布在人體的第12常染色體上[14]。本次研究結(jié)果表明miR-200 c與miR-141在胃癌組織中的表達(dá)有明顯的下降，這與李鷹飛等[15]研究報(bào)告中所述基本一致。這說(shuō)明在胃癌疾病的生長(zhǎng)發(fā)展過(guò)程中，miR-200 c與miR-141發(fā)揮著重要的作用，臨床醫(yī)生與學(xué)者可將miR-200 c與miR-141作為生物靶點(diǎn)，為患者提供有效的抗腫瘤治療方案[16-17]。

隨著醫(yī)學(xué)界對(duì)miRNAs的深入研究中發(fā)現(xiàn)，人類miRNAs基因主要分布在染色體易位或染色體缺失的位置，且遺傳學(xué)因素是影響miRNAs的重要因素，其中DNA甲基化是主要影響因素[18]。本次研究結(jié)果表明胃癌組織中的miR-200 c/141CpG島的甲基化水平有明顯上升，miR-200 c/141CpG島的甲基化水平與miR-200 c/141表達(dá)水平為負(fù)相關(guān)關(guān)系，這與周欣亮等[19]人研究報(bào)告中所述基本一致。

BS-MSP方法是比較新穎的基因甲基化檢測(cè)模式，具有耗時(shí)較短、檢測(cè)速度快、實(shí)用性強(qiáng)、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可快速檢測(cè)出CpG位點(diǎn)中甲基化的狀況，在研究腫瘤相關(guān)表達(dá)調(diào)控機(jī)制中具有極大的現(xiàn)實(shí)意義，能夠較好的獲取CpG島中的相關(guān)遺傳學(xué)信息，使研究者可明確DNA甲基化在miR-200 c與miR-141中的作用[20-21]。

綜上所述，在胃癌組織中，miR-200 c以及miR-141的水平隨著miR-200 c/141CpG島的甲基化水平的升高而降低。同時(shí)BS-MSP方法有利于研究者從分子水平領(lǐng)域探究胃癌疾病發(fā)展的病因，為臨床診治胃癌疾病提供依據(jù)和方向，可在臨床中推廣和廣泛使用。