石油污染對(duì)場地中細(xì)菌群落的影響及其反饋機(jī)制

鄭一鳴， 何小松， 單光春,2， 崔 駿， 虞敏達(dá)， 趙航正,4， 席北斗*

1.中國環(huán)境科學(xué)研究院， 國家環(huán)境保護(hù)地下水污染模擬與防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100012 2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)環(huán)境學(xué)院， 黑龍江 哈爾濱 150090 3.中國環(huán)境科學(xué)研究院固體廢物污染控制技術(shù)研究所， 北京 100012 4.中國礦業(yè)大學(xué)(北京)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院， 北京 100083

石油污染改變了土壤和地下水中微生物群落的組成與結(jié)構(gòu)[1-2]. 在污染場地中，石油分布不均[3]，不同污染特征中的細(xì)菌群落分布與組成差異性較大[4]. 隨著分子生物學(xué)和高通量測序技術(shù)的發(fā)展，微生物組學(xué)的研究越來越深入[5]. Baas-Becking[6]認(rèn)為“萬物無處不在，但環(huán)境選擇一切”. 不同生存環(huán)境下，確定性過程與隨機(jī)性過程發(fā)揮著不同的作用[7-8]. 傳統(tǒng)上，人們認(rèn)為環(huán)境選擇等確定性過程決定了群落組裝過程[9]. 例如，生態(tài)位理論認(rèn)為，生物和非生物因素對(duì)環(huán)境中細(xì)菌群落的相對(duì)豐度有重要影響，甚至影響某一物種的生存與否[10]. 其中，pH是確定性過程中對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響的主要驅(qū)動(dòng)力[11-12]. 地理距離、土壤有機(jī)質(zhì)以及無機(jī)鹽離子也會(huì)對(duì)細(xì)菌群落分布產(chǎn)生重要影響[3,12]. 環(huán)境壓力和物種性狀在確定性過程中起著至關(guān)重要的作用[13]. 當(dāng)外界干擾較小時(shí)，環(huán)境中細(xì)菌群落的演替方向變化也較小，當(dāng)外界持續(xù)不斷干擾時(shí)，外源微生物入侵，可能會(huì)導(dǎo)致土著細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化，改變其演替方向[14]. 確定性過程會(huì)在不同尺度上影響群落的組裝[15]. 然而現(xiàn)有研究也發(fā)現(xiàn)，隨機(jī)性過程在某些群落組裝的過程中起主導(dǎo)作用[16-17]. 例如，中性理論認(rèn)為，微生物的繁殖、遷移、死亡過程影響了隨機(jī)性過程[18]，并不是環(huán)境選擇而是微生物演替的隨機(jī)性影響了細(xì)菌物種相對(duì)豐度的變化[19]. 中性理論假設(shè)物種在生態(tài)位上都是等效的，隨機(jī)的出生、死亡、漂移以及物種的生成與滅絕等隨機(jī)性因素影響了微生物的群落結(jié)構(gòu). 已有研究證明，確定性過程和隨機(jī)性過程皆會(huì)對(duì)群落組裝產(chǎn)生重大影響[20]，但是在不同污染特征中其重要性存在差異[21-22]. 在高多樣性的環(huán)境中，隨機(jī)性過程占主導(dǎo)地位；而在多樣性低的環(huán)境中，確定性過程占主導(dǎo)地位[23]. 理解微群落組裝過程的基本生態(tài)機(jī)制是群落生態(tài)學(xué)尤其是微生物群落生態(tài)學(xué)的一大挑戰(zhàn). 判斷確定性過程與隨機(jī)性過程在污染場地細(xì)菌群落組裝中發(fā)揮的作用對(duì)于理解污染生態(tài)學(xué)具有非常重要的意義. 目前對(duì)于石油污染場地中細(xì)菌群落特征的研究較少，且主要集中在石油污染對(duì)細(xì)菌群落多樣性的影響方面，然而在不同石油污染特征下細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化與群落組裝機(jī)制仍不明確.

該研究選擇7個(gè)受石油污染程度不同的土壤樣品和2個(gè)受石油污染含水層沉積物樣品，采用熒光定量PCR(qPCR)和DNA高通量測序技術(shù)，分析了好氧與厭氧特征降解基因拷貝數(shù)和細(xì)菌群落多樣性差異，評(píng)估了不同石油污染生境對(duì)細(xì)菌群落多樣性的影響，分析了細(xì)菌對(duì)石油污染的反饋過程，揭示不同石油污染環(huán)境下細(xì)菌群落多樣性與污染特征的關(guān)系，進(jìn)而明確不同污染生境細(xì)菌群落組裝的機(jī)制.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)場地與樣品采集

如圖1所示，樣品采集于甘肅省某石化場地，它是我國西北地區(qū)石化場地的典型代表，場地中存在油泥堆積區(qū)域，部分區(qū)域土壤污染嚴(yán)重.

圖1 采樣點(diǎn)分布Fig.1 Distribution of the sampling sites

于2019年12月選擇3個(gè)不同污染程度的區(qū)域表層(0～3 cm)采集石油污染固態(tài)樣品，分別為油泥堆積區(qū)域(A)、石油污染土壤區(qū)域(B)和未污染土壤區(qū)域(C)，以上3種環(huán)境均可認(rèn)為是好氧環(huán)境；同時(shí)，對(duì)發(fā)生石油泄漏污染地下水的區(qū)域進(jìn)行鉆井，獲得含水層沉積物樣品(D)，可認(rèn)為是厭氧環(huán)境. 樣品信息見表1. 在油泥區(qū)域采集2個(gè)樣品，分別標(biāo)記為S1和S2；石油污染土壤區(qū)域采集2個(gè)樣品，分別標(biāo)記為S3和S4；在未污染土壤區(qū)域采集3個(gè)樣品，分別標(biāo)記為S5、S6和S7；含水層沉積物樣品選擇2個(gè)井的沉積物；分別標(biāo)記為S8和S9.

土壤樣品采集方法：在1 m2區(qū)域內(nèi)，隨機(jī)選擇3～5個(gè)采樣點(diǎn)，用無菌鏟迅速采集表層(0～3 cm)土壤500 g放入塑封袋中密封低溫保存. 含水層沉積物樣品采集方法：在場地開鑿鉆孔，將含水層沉積物樣品去除泥皮，采集飽和含水層巖芯500 g，并用錫紙包裹放入密封袋中低溫保存，盡量排出袋內(nèi)空氣. 所有樣品一式兩份，一份用于測試石油濃度，另一份用于測試細(xì)菌群落多樣性. 石油濃度的測試根據(jù)LU等[23]所述的方法進(jìn)行.

表1 受石油污染的土壤與沉積物樣品的污染特征Table 1 Contamination characteristics of samples of petroleum-contaminated soils and sediments

1.2 熒光定量PCR

研究表明，alkB基因編碼的烷烴單加氧酶和nah基因編碼的萘雙加氧酶是研究細(xì)菌群落在生物修復(fù)位點(diǎn)好氧降解石油潛力的理想標(biāo)記[24-26]. 烷基琥珀酸合成酶(ASS)的編碼基因ass被認(rèn)為是厭氧體系中烷烴降解的唯一標(biāo)志[27]. 也有研究表明，在厭氧環(huán)境中，大多數(shù)芳烴化合物都經(jīng)過微生物作用，形成中間體6-十六氧環(huán)烯基-CoA. 該物質(zhì)開環(huán)反應(yīng)的關(guān)鍵酶是bamA基因編碼的6-十六氧環(huán)-1-烯-1-羰基CoA水解酶[28]. 采用熒光定量PCR技術(shù)，測試了alkB、nah、ass、bamA與石油降解有關(guān)的特征基因拷貝數(shù). 每個(gè)樣品的4個(gè)基因均測試了6次，表2為各特征基因的引物名稱及序列.

1.3 細(xì)菌群落多樣性分析

用E.Z.N.A.?DNA Kit進(jìn)行土壤微生物DNA樣品提取，用338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)兩個(gè)引物對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因的V4～V5區(qū)進(jìn)行了PCR擴(kuò)增.

表2 擴(kuò)增特征基因所用的引物名稱與引物序列Table 2 The primer name and primer sequences used to amplify characteristic genes

用含4 μL的5×fastpfu緩沖液、2 μL 2.5 mmol/L dNTPs、0.8 μL 5 μmol/L引物、0.4 μL fastpfu聚合酶和10 ng模板DNA的混合物20 μL進(jìn)行PCR反應(yīng). 用試劑盒提取擴(kuò)增子在Illumina MiSeq平臺(tái)測序. 原始fastq文件用QIIME進(jìn)行質(zhì)量過濾.

PCR反應(yīng)參數(shù)：95 ℃持續(xù)3 min；95 ℃持續(xù)30 s，27 ℃持續(xù)30 s，72 ℃持續(xù)45 s，循環(huán)55次；72 ℃持續(xù)45 s，10 ℃直至停止.

2 結(jié)果與討論

2.1 場地污染特征

油泥中的石油濃度較高，S1的石油濃度為 100 834 mg/kg，S2的石油濃度為 202 097 mg/kg. 油泥采樣地點(diǎn)為儲(chǔ)罐區(qū)，大量的石油產(chǎn)品長期泄露，導(dǎo)致該區(qū)域污染較為嚴(yán)重，成為油泥狀；石油污染土壤次之，S3的石油濃度為 1 255.12 mg/kg，S4的石油濃度為321.7 mg/kg；在場地中的部分區(qū)域雖然不是污染源區(qū)，但是由于石油具有一定的揮發(fā)性和遷移性，導(dǎo)致部分遷移性較強(qiáng)的石油入侵未污染區(qū)域，造成污染范圍擴(kuò)大[29-30]；未污染土壤中也有極少量的石油，S5的石油濃度為0.13 mg/kg，S6的石油濃度為0.46 mg/kg，S7的石油濃度為0.34 mg/kg；含水層沉積物樣品的石油濃度差異性較大，S8的石油濃度為58 mg/kg，S2的石油濃度為 2 028 mg/kg. 由于地下環(huán)境異質(zhì)性較強(qiáng)，水文地質(zhì)條件較復(fù)雜[31]，地下環(huán)境的異質(zhì)性導(dǎo)致了不同含水層沉積物污染特征的差異性[32].

注： A—油泥；B—石油污染土壤；C—未污染土壤；D—石油污染沉積物. 下同.圖2 不同污染特征的環(huán)境中4種降解基因的拷貝數(shù)Fig.2 Copies of four degradation genes in environments with different pollution characteristics

2.2 微生物降解基因與污染特征的關(guān)系

油泥、石油污染土壤和未污染土壤皆為好氧環(huán)境，而沉積物處于厭氧環(huán)境中. 圖2為不同污染特征下4種具有降解石油功能的基因拷貝數(shù). 由圖2可見，油泥中alkB基因拷貝數(shù)(平均值為6.21×107copies/g)較高，石油污染土壤和未污染土壤中相對(duì)較少(平均值分別為1.38×107和1.88×107copies/g)，在受污染沉積物中最低(平均值為1.58×106copies/g)，較上述3種好氧環(huán)境下低了1個(gè)數(shù)量級(jí). 油泥中，nah基因拷貝數(shù)較高(平均值為9.3×106copies/g)，可能是由于油泥中的高濃度石油促進(jìn)了其增殖，nah基因拷貝數(shù)在石油污染土壤和未污染土壤中較少(平均值分別為9.94×105和3.37×105copies/g)，含水層受污染沉積物中nah基因拷貝數(shù)也較少(平均值為5.2×105copies/g).ass和bamA基因拷貝數(shù)在不同污染特征的環(huán)境中均較低，其中，ass基因拷貝數(shù)在油泥、石油污染土壤、未污染土壤和含水層沉積物中的平均值依次為1.99×105、2.11×105、8.86×105和9.43×103copies/g，bamA基因拷貝數(shù)則分別為3.51×107、5.08×107、8.84×107和4.86×106copies/g. 可見，在油泥、石油污染土壤和未污染土壤的好氧環(huán)境下，厭氧基因的增殖受到了限制. 在沉積物的厭氧環(huán)境下，厭氧基因拷貝數(shù)也較低，可能是由于在厭氧條件下很多微生物僅表現(xiàn)出石油的抗性，厭氧基因并不能有效增殖.

2.3 石油污染對(duì)場地中細(xì)菌群落多樣性的影響

表3為7組土壤樣品與2組含水層沉積物樣品的微生物高通量測序結(jié)果，所有樣品的物種覆蓋度均超過98%，說明測序深度足夠可以覆蓋絕大部分物種.α-多樣性可以反映環(huán)境中細(xì)菌群落的豐富度(Shannon-Wiener指數(shù))、均勻度(Simpson指數(shù))與多樣性(Ace指數(shù)與Chao1指數(shù))[33-34]. 該研究中，隨著石油濃度的降低，土壤中細(xì)菌群落的Shannon-Wiener指數(shù)、Simpson指數(shù)、Ace指數(shù)與Chao1指數(shù)均呈增加趨勢. 不同污染特征的環(huán)境間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)具有明顯的差異性，不同污染特征的環(huán)境中細(xì)菌群落多樣性與石油濃度呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05). 圖3為不同污染程度下土壤和沉積物細(xì)菌群落之間的α-多樣性組間差異，結(jié)果顯示，未污染土壤與油泥之間細(xì)菌群落的α-多樣性組間差異性極為顯著(P<0.01)，未污染土壤與受污染沉積物之間的組間差異性也較為顯著(P<0.05). 與未污染土壤相比，油泥和受污染沉積物中細(xì)菌群落的α-多樣性降低了50%左右，而石油污染土壤中細(xì)菌群落的α-多樣性降低了33%左右. 石油污染土壤與受污染沉積物中的石油濃度相近，二者的α-多樣性也相近，氧氣含量對(duì)α-多樣性影響不大. 可見，高濃度石油污染是引起土壤和沉積物中微生物的群落組成變化的主要驅(qū)動(dòng)因子，能夠顯著降低微生物群落的α-多樣性，而氧氣濃度并不是造成土壤與沉積物中微生物群落變化的主要驅(qū)動(dòng)因子.

表3 9組土壤與沉積物樣品的微生物高通量測序結(jié)果Table 3 Result of bacteria high-throughput sequencing in 9 samples of soil and sediments

圖4 不同污染特征和不同濃度樣品的細(xì)菌群落Venn圖Fig.4 Venn diagram of bacteria community in different contaminated characteristic and different samples

注：*表示P<0.05，**表示P<0.01.圖3 不同污染特征的環(huán)境中α-多樣性組間差異Fig.3 The difference of α-diversity in environments with different pollution characteristics

圖5 9組樣品屬水平上細(xì)菌的相對(duì)豐度Fig.5 Relative abundance on genus level in 9 groups of samples

Venn圖可以區(qū)分共享的和唯一的OTUs(Operational Taxonomic Units)[35-36]. 由圖4可以看出，不同分組中油泥樣品中的特異性物種最少，僅有45個(gè)OTUs；石油污染土壤次之，有292個(gè)OTUs；未污染土壤樣品中的特異性物種最多，有 1 131 個(gè)OTUs；受污染沉積物中的特異性物種數(shù)量介于油泥和石油污染土壤之間，有124個(gè)OUTs. 油泥中石油含量最高，對(duì)土壤中微生物的毒害作用較大，導(dǎo)致其特異性物種數(shù)量降低[37]；石油污染土壤中含有幾百至幾千mg/kg濃度不等的石油，部分具有一定耐受性的物種可以在此環(huán)境中生存，其中微生物種群數(shù)量相對(duì)較高；未污染土壤中含有極少量的石油烴，遠(yuǎn)未達(dá)到對(duì)微生物的致死作用，部分具有降解能力的微生物還可以將土壤中的微生物解毒，使其轉(zhuǎn)化為無毒無害的可利用有機(jī)物[38]，導(dǎo)致其中的微生物種群數(shù)量最多；對(duì)于沉積物中的微生物來說，由于其生活環(huán)境為厭氧，相對(duì)于好氧環(huán)境，微生物數(shù)量總體較少，所以其特異性物種主要為具有厭氧環(huán)境下利用石油烴作為碳源或能源的微生物. 由圖4可以看出，在9組不同樣品中都能夠存活的細(xì)菌OTU數(shù)量為20，說明這20種微生物在不同濃度、不同氧氣含量的環(huán)境下都能夠生存，具有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性，但是這20種微生物是否具有石油降解能力仍然不明晰.

圖5為屬水平物種相對(duì)豐度，不同污染特征樣品間有一定的差異性[39]. 其中，石油濃度較高的土壤和沉積物中Pseudomonas相對(duì)豐度均較高，石油濃度較高的土壤中Acidovoras相對(duì)豐度較低，石油濃度較低的土壤和未污染土壤中Pseudarthrobacter相對(duì)豐度均較高，Pseudoxanthomonas只在油泥中有檢出，可能是較高的石油濃度選擇出具有石油降解能力(或具有石油抗性)的微生物[40].Methylotenera只在含水層沉積物中被檢測到，推測其與厭氧降解石油(厭氧石油抗性)有關(guān)，Spingomonas在油泥中未被檢出，而在未污染土壤和受污染沉積物中存在，但是在受污染沉積物中其相對(duì)豐度較低，可以推斷，這種微生物對(duì)石油的抗性較差，且在厭氧條件下活性較高.

注： 虛線表示確定性與隨機(jī)性的分界限.圖6 不同污染特征的環(huán)境中 細(xì)菌群落βNTI值Fig.6 βNTI diagram of bacteria community in environments with different pollution characteristics

2.4 細(xì)菌群落組裝

為了量化確定性過程和隨機(jī)性過程在石油污染場地細(xì)菌群落演替中的作用，該研究使用了加權(quán)豐度β-平均最近分類數(shù)值(βNTI)量化了群落組裝之間的系統(tǒng)發(fā)育距離(見圖6). βNTI<-2或βNTI>2表明確定性過程占主導(dǎo)地位；-2<βNTI<2表明隨機(jī)性過程占主導(dǎo)地位；βNTI為2或-2，則不能判斷群落組裝過程[20]. 不同污染特征的環(huán)境在受到石油入侵后，細(xì)菌群落組裝過程受到不同程度的影響. 油泥、石油污染土壤及未污染土壤等好氧環(huán)境下|βNTI|<2，表明細(xì)菌群落組裝是隨機(jī)性過程，受污染沉積物的厭氧環(huán)境下βNTI>2，細(xì)菌群落組裝為確定性過程. 這表明石油在入侵土壤后，多樣化過程和漂變過程占主導(dǎo)作用，而環(huán)境選擇對(duì)細(xì)菌群落的影響較小[41]，導(dǎo)致細(xì)菌能夠通過變異或者水平基因轉(zhuǎn)移等方式獲得新的表型并形成新的區(qū)系. 但是在受污染沉積物中，細(xì)菌群落組裝主要受環(huán)境選擇的影響[18]. 這說明含水層沉積物中可能存在部分物種有著獨(dú)特的、與厭氧石油污染環(huán)境相適應(yīng)的表型，使它們可以在厭氧石油污染下生存，而土壤環(huán)境中這類物種很少，可能是由于土壤環(huán)境不穩(wěn)定，微生物演替未完成，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)不僅受石油濃度的影響，而且還會(huì)受到其他環(huán)境因素的影響[42]. 好氧環(huán)境中，微生物的生態(tài)位在環(huán)境影響下會(huì)發(fā)生變化，石油對(duì)微生物的選擇作用不是絕對(duì)的環(huán)境優(yōu)勢，在油泥、石油污染土壤中發(fā)現(xiàn)了大量不能降解石油的微生物類群存在，在未污染土壤中同樣也發(fā)現(xiàn)了一些具有石油降解能力的微生物. 在厭氧環(huán)境中，環(huán)境相對(duì)封閉，與外界環(huán)境交流較少，石油濃度是有較大選擇作用的環(huán)境因子，且含水層沉積物中細(xì)菌種類相對(duì)較少，群落穩(wěn)定性較差，受到石油污染后，細(xì)菌群落迅速發(fā)生變化，其他環(huán)境因子的選擇作用相對(duì)較小. 但是在沉積物中厭氧降解石油的基因含量較低，可以推測，在石油污染含水層沉積物后，大量微生物類群滅亡，造成了細(xì)菌群落的改變，而部分未死亡的微生物也不具有石油降解能力.

3 結(jié)論

a) 石油污染改變了慶陽石化老廠區(qū)中土壤和沉積物中細(xì)菌群落的豐富度、多樣性及均勻度，細(xì)菌群落的α-多樣性與石油濃度呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05). 高濃度的石油能夠在好氧條件下促進(jìn)alkB基因和nah基因的增殖.

b) 該場地土壤和沉積物中的細(xì)菌種群數(shù)量與石油濃度呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，污染場地不同污染特征的環(huán)境中細(xì)菌群落在門水平上具由較高的相似度，需要在屬水平上加以區(qū)分. 污染源區(qū)與非污染源區(qū)土壤和沉積物之間的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異性較大，不同濃度石油的毒性作用差異性較大，不同微生物對(duì)石油的耐受程度不同，環(huán)境的差異性也會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌群落的差異性.

c) 在該石油污染場地的土壤中，土壤細(xì)菌群落組裝中隨機(jī)性過程占主導(dǎo)地位，含水層沉積物的細(xì)菌群落組裝中確定性過程占主導(dǎo)地位. 土壤環(huán)境中具有好氧石油降解基因，而在沉積物中厭氧降解石油的基因含量較低，大部分微生物在石油污染發(fā)生后死亡，部分生存的微生物不具有石油降解能力，僅有抗性的表型，或者是處于休眠狀態(tài).