基于RNA-seq技術的何首烏對衰老小鼠腦組織轉錄組學影響的研究

李文謙，楊江權，鄒佳益，吳德靜，徐 林，范 芳，葛正龍

(遵義醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室，貴州 遵義 563099)

衰老，為多種因素造成的機體退行性過程。隨著全球性人口老齡化問題的日益突出，預計到2025年，中國60歲以上人口將達到3億，成為老齡化大國，給現(xiàn)代的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、衛(wèi)生醫(yī)療保障體系帶來一定的沖擊[1]。同時，衰老也是許多疾病的危險因素，如阿爾茨海默癥、帕金森病、糖尿病、癌癥等[2-3]。阿爾茨海默癥是一種慢性神經(jīng)退行性病變，也是老年癡呆癥中較常見的類型，發(fā)病率在老年癡呆中占50%～60%。隨著人口老齡化，預計到2050年，全球患者將達到1.5億人[4]。帕金森病是第二大中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，在我國65歲以上人群的患病率為1 700/10萬，患病總人數(shù)已達260萬例，約占世界PD患者一半，隨著人口老齡化，預計每年新增PD患者20萬例，至2030年將有500萬例[5]，嚴重威脅人類健康。因此，揭示衰老本質和尋求抗衰老方法、藥物的研究已成為當今的世界性重大醫(yī)學課題。

在抗衰老藥物研究中，中藥及其有效成分對表觀遺傳的作用正日益受到重視，中藥可以作用于表觀遺傳的多個環(huán)節(jié)，參與調(diào)控基因轉錄及其表達，包括當歸、人參、靈芝、何首烏、三七等，其中以何首烏和靈芝研究最為廣泛[6]。何首烏，是貴州重要的地道藥材之一，為蓼科植物。全株皆可用藥，尤以根部為佳[7]，其干燥塊根味苦、甘、澀,性溫,歸肝、心、腎經(jīng)，具有補肝腎、益精血、烏須發(fā)、強筋骨、抗衰老的作用[8-9]，已有研究證實何首烏在阿爾茨海默病、高脂血癥等疾病中有強大的藥用價值[10]，可消除衰老動物體內(nèi)自由基[11-12]，達到抗衰老、延年、保護心臟的作用[13]，還可通過降低活性氧的產(chǎn)生來達到神經(jīng)保護作用[14]。

為了探索何首烏對延緩腦衰老的作用機制，本實驗將對何首烏提取液治療D-半乳糖導致的衰老小鼠腦組織的轉錄組數(shù)據(jù)進行分析，篩選出差異表達基因(DEG)，為探索何首烏提取液對延緩腦組織衰老的作用靶點提供實驗依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物 SPF級6～8周齡雄性C 57 BL/6小鼠30只，購于陸軍軍醫(yī)大學醫(yī)學實驗動物中心，許可證號SCXK(遼)015-0001。

1.2 試劑和儀器 D-半乳糖：美國Sigma藥品公司；何首烏粉末：遵義醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院中藥房，中國；Trizol、氯仿、75%乙醇、異丙醇等試劑自備；冷凍離心機(MICRO173，美國)；實時熒光定量PCR儀(EFX96，美國)；微量核酸蛋白分析儀(Eppendorf，德國)；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(Takara，日本)；TB GreenTM Premix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒(Takara，日本)。

1.3 藥物制備 將何首烏粉末與75%乙醇按1∶6進行回流煎煮1 h，共進行2次，將2次得到的提取液4 000 r/min進行離心，取上清液用旋轉蒸發(fā)儀真空濃縮回收乙醇至無醇味，使何首烏提取液濃度以生藥計為1 g/mL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 方法

2.1 動物分組及建模 將30只6～8周齡雄性C 57 BL/6小鼠，適應性飼養(yǎng)1周，燈光12 h交替照明，自由飲食。而后隨機分為空白組(CC)，模型組(MC)，何首烏提取液治療組(MM)，MC組和MM組每天腹腔注射D-半乳糖，連續(xù)60 d，構建亞急性衰老動物模型，CC組腹腔注射等量生理鹽水。MM組灌胃何首烏提取液，CC組和MC組灌胃等量生理鹽水，連續(xù)60 d，然后斷頭處死小鼠，取腦組織于-80 ℃保存?zhèn)溆肹15]。

2.2 轉錄組測序(RNA-Seq) 用mRNA富集法或rRNA去除法對totalRNA進行處理，用打斷buffer把獲得的RNA片段化，而后進行反轉錄，再合成cDNA二鏈形成雙鏈DNA，把合成的雙鏈DNA末端補平并5′端磷酸化，3′端形成突出一個“A”的粘末端，再連接一個3'端有凸出“T”的鼓泡狀的接頭，而后把連接產(chǎn)物通過特異的引物進行PCR擴增，其產(chǎn)物熱變性成單鏈后，再用一段橋式引物將單鏈DNA環(huán)化得到單鏈環(huán)狀DNA文庫，最后上機測序。mRNA文庫構建由華大基因完成。

2.3 差異表達基因的GO和KEGG通路分析 Gene Ontology 為功能富集研究的常用分析方法，分為分子功能(Molecular function，MF)、細胞組分(Cellular component,CC)和生物過程(Biological process,BP)三大功能類。而KEGG是了解高級功能和生物系統(tǒng)的實用程序數(shù)據(jù)庫。本研究使用DAVID:Functional Annotation Result Summary進行基因注釋分析及KEGG通路分析。MC/CC組和MM/MC組選取P<0.05且Count≥10的GO類別被認為有統(tǒng)計學意義，P<0.05且Count≥5的KEGG 通路被認為有統(tǒng)計學意義。在兩組均有變化的差異基因選取P<0.05且Count≥3的GO類別被認為有統(tǒng)計學意義，P<0.05且Count≥3的KEGG 通路被認為有統(tǒng)計學意義。

2.4 PPI網(wǎng)絡構成與Hub基因的確定 將測序得到的數(shù)據(jù)庫中差異倍數(shù)為1倍以上并且Q-value≤0.001的基因篩選為差異表達基因，通過STRING:functional protein association networks進行蛋白互作網(wǎng)絡(PPI)數(shù)據(jù)分析，用最低要求的互動分數(shù)Inimum required interaction score(medium confidence=0.400)提取PPI對，而后用Cytoscape軟件將PPI網(wǎng)絡可視化，用Cytoscape中的插件CytoHubba來計算蛋白質節(jié)點，我們認為連接度較高的節(jié)點在維持整個網(wǎng)絡的穩(wěn)定性方面更為重要，而前10個基因被認為是Hub基因。

2.5 腦組織RNA提取 每個組別取適量腦組織，加入1 mL Trizol后在玻璃勻漿器內(nèi)勻漿，室溫靜置5 min后12 000 g離心5 min，取上清液加入200 μL氯仿，震蕩混勻，室溫靜置5 min后12 000 g 4℃離心15 min，取上清液加入1 mL異丙醇，上下顛倒離心管使其充分混勻，室溫靜置10 min后12 000 g 4℃離心10 min，去掉上清液，向沉淀中加入1 mL 75%乙醇，輕輕上下顛倒洗滌離心管管壁，7 500 g 4℃離心5 min，洗2次后棄去上清液，保留沉淀，打開離心管蓋，置室溫干燥幾分鐘，加適量DEPC水溶解，而后用微量核酸蛋白分析儀測定OD260/OD280。結果在1.8～2.0說明RNA的純度和完整性較好，將完整性較好的RNA取1 μg用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒逆轉錄為cDNA后于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.6 實時熒光定量PCR驗證 結合RNA-Seq數(shù)據(jù)和Hub基因選取表達量較高的基因用TB GreenTM Premix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒進行熒光定量PCR驗證，以β-Actin為內(nèi)參，10 μL體系進行基因擴增，反應程序為95℃，30 s；GOTO(95℃，5 s；60℃，30 s)；95℃，10 s；60℃，5 s；95℃，50 s；共進行40個循環(huán)，而后通過 2-ΔΔCT法計算基因的相對表達水平?；蛞镆姳?。

表1 差異表達基因的Q-PCR引物序列

3 結果

3.1 差異表達基因分析 采用DEGseq法對CC組和MC組，MC組和MM組的基因表達量的原始數(shù)據(jù)進行篩選，選取Q-value≤0.001的基因，其基因分布如圖1。MC組和CC組相較，有5 571個基因產(chǎn)生差異表達，其中331個基因的表達有明顯差異[|Log2(Fold change)|≥1]，在這些明顯差異基因中，有110個基因上調(diào)，221個基因下調(diào)。而MM組和MC組相較，有4 375個基因產(chǎn)生差異性表達，其中225個基因的表達有明顯差異[|Log2(Fold change)|≥1]，在這些明顯差異基因中，有122個基因上調(diào)，103個基因下調(diào)。各組均有變化的基因有103個，其中41個明顯差異基因在MC/CC組上調(diào)，在MM/MC組下調(diào)，62個明顯差異基因在MC/CC組下調(diào)，在MM/MC組上調(diào)。各組差異基因的整體分布情況見火山圖(Volcano-plot)見圖2、圖3。其中上調(diào)的差異基因用紅色表示，下調(diào)的差異基因用藍色表示，差異不明顯基因用灰色表示。提示何首烏提取液對腦組織的轉錄水平有較大影響，可能通過影響腦的轉錄組來達到其抗衰老作用。

圖1 3組樣本共有的差異表達基因的分布

none：|Log2(Fold change)|<1 ,P>0.05；up：Log2(Fold change)≥1，P≤0.05；down：Log2(Fold change)≤-1，P≤0.05；橫坐標代表基因在不同樣本中表達倍數(shù)變化；縱坐標代表基因表達量變化差異的統(tǒng)計學顯著性。

none：|Log2(Fold change)|<1 ,P>0.05；up：Log2(Fold change)≥1，P≤0.05；down：Log2(Fold change)≤-1，P≤0.05；橫坐標代表基因在不同樣本中表達倍數(shù)變化；縱坐標代表基因表達量變化差異的統(tǒng)計學顯著性。

3.2 差異表達基因的功能富集分析 使用DAVID進行差異表達基因的GO功能和KEGG途徑富集分析(見表2～3)。MC組和CC組的GO分析結果表明差異表達基因主要富含CCs，包括細胞外泌體、細胞外區(qū)域、細胞外空間、質膜的組成部分，中間絲和編碼角質化包膜。BP分析顯示差異表達基因顯著富集離子轉運，炎癥應答，角化和角化細胞分化。MF分析顯示差異表達基因顯著富集結構分子活性，金屬離子結合和肌動蛋白結合。而KEGG通路分析的結果顯示差異表達基因顯著富集在細胞因子-細胞因子受體相互作用通路，擴張型心肌病通路，心律失常性右心室心肌病(ARVC)通路，肥厚型心肌病(HCM)通路，ECM-受體相互作用通路，蛋白質消化吸收通路和雌激素信號通路中。MM組和MC組的GO分析結果表明差異表達基因主要富含CCs，包括膜、細胞外區(qū)域、細胞外空間、質膜的組成部分，中間絲和編碼角質化包膜。BP分析顯示差異表達基因顯著富集離子轉運，跨膜轉運和炎癥應答。MF分析顯示差異表達基因顯著富集腫瘤壞死因子激活受體活性和離子通道活性。而KEGG通路分析的結果顯示差異表達基因顯著富集神經(jīng)活性配體-受體相互作用和ECM-受體相互作用通路中。

表2 CC/MC組差異表達基因的GO分析及KEGG分析

在MC/CC組和MM/MC組表達均有明顯差異的103個基因的GO分析和KEGG分析結果(見表4)顯示，明顯差異基因主要富含CCs，包括膜和質膜的組成。BP結果表示明顯差異基因主要富集在離子遷移和跨膜轉運中。MF結果表明差異基因主要富集在離子通道活性和鈣調(diào)蛋白結合中。而KEGG通路分析結果顯示，明顯差異基因顯著富集在心律失常性右室心肌病通路和細胞外基質-受體相互作用通路中。

表4 MC/CC和MM/MC組表達均有明顯差異的基因的GO分析和KEGG分析

3.3 PPI網(wǎng)絡構成與Hub基因的確定 用STRING工具預測篩選出的103個具有明顯差異表達基因之間的蛋白質的相互作用(見圖4)。PPI網(wǎng)絡共涉及97個節(jié)點和23個邊緣。通過PPI網(wǎng)絡中的聚類系數(shù)評估了前10個基因(見表5)。結果顯示，ATPase肌漿/內(nèi)質網(wǎng)Ca2+轉運1(Atp2a1；degree=2)為最優(yōu)基因，其次為ⅩⅩⅣ型膠原蛋白alpha 1鏈(Col24a1；degree=2)，Kelch-like 41(Klhl41；degree=2)，肌鈣蛋白T1，慢骨骼型(Tnnt1；degree=2)，鉀電壓門控通道亞家族H成員5(Kcnh5；degree=2)，腫瘤壞死因子受體超家族成員4(Tnfrsf4；degree=2)，X連鎖Kx血型相關4(Xkr4；degree=2)，磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C(Plcxd3；degree=2)，GPRIN家庭成員3(Gprin3；degree=2)，二?；视图っ?Dgkh；degree=1)。結合RNA-Seq結果,選取表達量較高的Tnfrsf4、Xkr4、Gprin3、Plcxd34個基因進行驗證。其中Tnfrsf4在MC組下調(diào)，MM組上調(diào)；Xkr4、Gprin3、Plcxd33個基因在MC組上調(diào)，MM組下調(diào)。

表3 MC/MM組差異表達基因的GO分析及KEGG分析

圖4 差異表達基因構建的蛋白質-蛋白質相互作用網(wǎng)絡

表5 前10個中心基因

3.4 實時熒光定量PCR驗證 RT-qPCR結果顯示，與空白對照組(CC)比較，衰老細胞組(MC)中的Tnfrsf4表達水平下調(diào)，Xkr4、Gprin3、Plcxd3表達水平上調(diào)。與MC組比較，何首烏提取液治療組(MM)中的Tnfrsf4表達水平上調(diào)，Xkr4、Gprin3、Plcxd3表達水平下調(diào)(見圖5)，且均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與RNA-seq測序結果一致(見表6)。

A：Tnfrsf4RT-qPCR結果；B：Xkr4RT-qPCR結果；C：Gprin3RT-qPCR；D：Plcxd3RT-qPCR結果衰老組與空白對照組比較，#：P<0.05，##：P<0.01，何首烏提取液治療組與D-Gal衰老組比較。

表6 Tnfrsf4、Xkr4、Gprin3、Plcxd3在轉錄組測序中的表達

4 討論

轉錄組學是從整體轉錄水平系統(tǒng)研究基因轉錄圖譜并揭示復雜生物學通路和性狀調(diào)控網(wǎng)絡分子機制的學科[16]。通過轉錄組測序可以對全部轉錄組或基因組的基因進行差異性篩選[17]，本實驗通過對篩選出的差異表達基因的分析，找出各組間的表達差異，初步確定何首烏延緩腦衰老的潛在作用靶點。

生物的衰老是一個極其復雜的生物化學過程，它涉及蛋白質、脂類和核酸等顯著性的改變，體現(xiàn)在生理完整性的逐步丟失，從而導致功能衰退，引發(fā)與年齡有關的疾病，包括神經(jīng)退行性疾病、動脈粥樣硬化、癌癥等，提高死亡的風險性[18-19]。而腦衰老是其中一個重要的表現(xiàn)。衰老時，病變最先發(fā)生于海馬區(qū)域，而后增強神經(jīng)細胞敏感性，使凋亡幾率增加，進而引起神經(jīng)退行性疾病[20]，如阿爾茨海默病、帕金森病等。若凋亡機制發(fā)生過多，則會造成不可逆的細胞丟失，嚴重的可引起缺血性損傷和自身免疫病等[21-22]。

Tnfrsf4是腫瘤壞死因子(TNF)受體超家族的成員，通常被認為是一種共刺激分子[23-24]。研究表明，敲除Tnfrsf4后，抗凋亡分子、凋亡抑制劑Bcl-2、Bcl-xL和Survivin的表達顯著減少，而促凋亡蛋白BCL2L11的表達顯著增加[25]。在本研究中，GO及KEGG結果亦表明，Tnfrsf4主要參與炎癥反應過程、免疫反應過程并調(diào)控凋亡；轉錄組數(shù)據(jù)及RT-qPCR結果顯示，與正常組比較，衰老模型組中Tnfrsf4呈現(xiàn)低表達，而在經(jīng)何首烏灌胃后的小鼠腦組織中呈現(xiàn)高表達，因此，何首烏可能通過上調(diào)Tnfrsf4，使促凋亡蛋白減少而抗凋亡蛋白增加來達到延緩衰老的作用。Xkr4(XK-Kell血型復合亞單位相關家族，成員4)在小腦中廣泛表達[26-27]，并且與McLeod綜合征有關，包括運動、認知和精神障礙[28]。Suzuki J等人研究發(fā)現(xiàn)，凋亡細胞將磷脂酰絲氨酸(PtdSer)暴露在其表面，作為“吞噬我”的信號。而Xkr4可以組織特異性地支持凋亡的PtdSer暴露[29]，促進細胞凋亡。在本研究中，GO及KEGG結果亦表明，Xkr4主要為膜的組成部分，同時參與細胞凋亡過程；而轉錄組測序和RT-qPCR結果顯示，與正常組比較，衰老模型組中的Xkr4表達增加，而經(jīng)何首烏灌胃后的小鼠腦組織中的表達量降低，因此，何首烏可能通過下調(diào)Xkr4來抑制細胞凋亡，進而達到延緩衰老的作用。Gprin3為GPRIN家族成員3，是紋狀體中D2R功能的假定選擇性控制器，在紋狀體相關行為和細胞功能中起關鍵作用，用以解決與D2R相關的紋狀體功能障礙，例如精神分裂癥，帕金森病等[30]。楊嬋的研究表明參芪復方可通過靶向調(diào)節(jié)Gprin3來調(diào)控細胞增殖和凋亡，抑制炎癥反應[31]。本研究結果顯示，與正常組比較，衰老模型組的Gprin3表達增高，經(jīng)何首烏灌胃治療后的小鼠腦組織中的Gprin3表達降低，與楊嬋的實驗結果一致；而GO和KEGG的結果表明Gprin3參與調(diào)控凋亡過程。因此，何首烏通過下調(diào)Gprin3達到延緩衰老的作用機制可能與參芪復方控制細胞增殖和凋亡的作用機制相似。Plcxd3是磷酸肌醇特異性磷脂酶(PI-PLC)家族成員，是Gellatly等于2012年鑒定出的一類新的PI-PLC，因其結構中僅包含一個催化X結構域，稱為含磷脂酶C X結構域的蛋白質(PLCXD3)，在信使RNA(mRNA)水平上，Plcxd3表達在大腦中占主導地位[32]，當表達量降低時，機體胰島素分泌受損[33-34]。Plcxd3編碼的蛋白質參與磷酸肌醇信號通路，該通路與雙相情感障礙有關[35]。雙相情感障礙是一種嚴重的神經(jīng)精神疾病，其特征是躁狂和抑郁癥反復發(fā)作，影響思想、知覺、情感和社交行為[36]。有研究表明，雙向情感障礙與衰老加速相關，但這種關聯(lián)的基礎機制尚不清楚[37]。本研究結果顯示，與正常組相比，衰老模型組中的Plcxd3表達增高，經(jīng)何首烏灌胃治療后的小鼠腦組織中表達量降低；而GO和KEGG的結果表明Plcxd3主要參與脂質分解代謝和信號轉導過程，并具有水解酶活性和磷酸二酯水解酶活性。因此，何首烏可能通過下調(diào)Plcxd3來影響脂質的分解代謝，進而達到延緩衰老的作用，同時緩解雙向情感障礙癥狀。

綜上所述，何首烏可能通過上調(diào)Tnfrsf4的表達，下調(diào)Xkr4、Gprin3、Plcxd3的表達水平來調(diào)控凋亡過程，達到抗衰老的作用。