GSK-3β在砷致糖代謝紊亂中的作用

代露露，余 琴，陳中寶，周遠(yuǎn)忠，申旭波

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)教研室，貴州 遵義 563099；3.遵義醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

糖原合成酶激酶-3(GSK-3)是從兔骨骼肌中分離出來的第一種能夠磷酸化糖原合酶(GS)的激酶之一，也是為數(shù)不多的通過磷酸化失活的蛋白激酶之一，在調(diào)節(jié)血糖中起關(guān)鍵作用。GSK-3α和GSK-3β是其2個亞型，分別由獨(dú)立的基因編碼，它們彼此之間的同源性為85%，在激酶結(jié)構(gòu)域中具有95%的同一性[1]。

GSK-3β是多種疾病的靶標(biāo)，例如2型糖尿病、慢性炎癥性疾病、心肌病和神經(jīng)退行性病變等[2-3]。在2型糖尿病中，GSK-3β的作用主要是調(diào)節(jié)葡萄糖穩(wěn)態(tài)。GSK-3β可抑制胰島素信號傳導(dǎo)和胰島素受體底物蛋白IRS-1和IRS-2的磷酸化[4-8]。GSK-3β蛋白的活性主要受Ser 9(抑制)和Tyr 216(激活)的磷酸化調(diào)節(jié)[9]，研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病患者中GSK-3β活性增加了兩倍[10]。胰島素和葡萄糖可調(diào)節(jié)GSK-3β的磷酸化水平；正常狀態(tài)下，胰島素可促進(jìn)Ser9-GSK-3β表達(dá)，從而抑制GSK-3β的活性，促進(jìn)了糖原合酶的去磷酸化，因此其活化作用將UDP葡萄糖轉(zhuǎn)化為糖原則血糖降低[11]。反之，如果GSK-3β活性增加，糖原合酶的活性被抑制，血糖則會升高。

砷致糖尿病已被多個研究證實(shí)，但砷致糖尿病的具體機(jī)制還未弄清楚。研究證明動物組織暴露于不同濃度的亞砷酸鈉后，可抑制GSK-3β的磷酸化，GSK-3β活性增加[12]。這提示砷可增加GSK-3β活性；由此提出假設(shè)砷暴露可通過增加GSK-3β活性，從而糖原合酶的活性被抑制，血糖則會升高，引起糖代謝紊亂。本研究擬通過建立砷致糖代謝紊亂大鼠模型，觀察亞慢性砷暴露對大鼠糖代謝的影響，并在GSK-3β抑制劑的干預(yù)下，探究GSK-3β在砷致糖尿病發(fā)病中可能的作用，因此，本研究將通過動物實(shí)驗(yàn)探索砷致糖代謝紊亂的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 體重200 g左右的 SD雄性大鼠60只，由重慶醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供(許可證SCXK[渝]2017-0001)。

1.2 主要試劑 NaAsO2(成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司)；LiCl(GSK-3β抑制劑，上海Adamas試劑有限公司)；大鼠胰島素(INS)ELISA試劑盒(上海江萊生物科技有限公司)；GSK-3β多克隆抗體和GSK-3β(Ser9)多克隆抗體購于美國CST公司。

1.3 方法

1.3.1 造模及干預(yù)實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)動物分為6組，C組(空白組)、L組(低砷組)、H組(高砷組)、CN組(空白GSK3抑制劑組)、LN組(低砷GSK3抑制劑組)、HN組(高砷GSK3抑制劑組)，染砷劑量按照：低砷L、LN組(5 mg/kg)劑量，高砷H、HN組(10 mg/kg)劑量[13]。除對照組、空白GSK3抑制劑組自由飲用水(蒸餾水)外，其余各組按照大鼠體重與實(shí)際飲水量進(jìn)行配制含砷水[NaAsO2(mg)=染砷劑量(5/10 mg/kg)×體重(g)/實(shí)際飲水量(mL)×給水量]，6組均自由進(jìn)食。染砷13周后，空白GSK3抑制劑組、低砷GSK3抑制劑組、高砷GSK3抑制劑組大鼠腹腔隔天注射GSK-3β抑制劑(LiCl)15 mg/kg[14-15]。

1.3.2 血糖、糖化血紅蛋白 空腹血糖監(jiān)測：用安穩(wěn)血糖儀檢測各組大鼠空腹血糖(每周2次)。血紅蛋白測定：喂養(yǎng)13周，全自動生化分析儀檢測糖化血紅蛋白濃度。

1.3.3 胰島素水平的檢測 計(jì)算胰島素敏感指數(shù)(insulin sensitive,ISI)和胰島素抵抗指數(shù)(insulin resistance index,IRI)；按照試劑盒說明檢測胰島素水平，然后根據(jù)計(jì)算公式[16]ISI= Ln 1/FBG×1/INS。采用穩(wěn)態(tài)模型[17]計(jì)算IRI=FBG×INS/22.5。

1.3.4 實(shí)時熒光定量 PCR 冰上低溫進(jìn)行操作，根據(jù)說明書進(jìn)行10 μL體系的逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增，根據(jù)Livak循環(huán)數(shù)Ct值為統(tǒng)計(jì)參數(shù)計(jì)算，2-△△Ct法分析Ct值并計(jì)算RNA相對表達(dá)量，引物序列(見表1)。

表1 引物序列

1.3.5 蛋白免疫印跡 按照常規(guī)方法提取肝臟組織的總蛋白，然后轉(zhuǎn)模、封閉，與一抗、二抗孵育等。凝膠成像系統(tǒng)處理分析目標(biāo)蛋白條帶的分子量和凈光密度值。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況及體重的變化 整個實(shí)驗(yàn)階段，染砷第13周時H組大鼠死亡1只。對照組大鼠飲水、進(jìn)食及活動均正常，生長良好。與對照組比，各染砷組大鼠進(jìn)食量、飲水量均明顯減少，毛發(fā)出現(xiàn)干枯、暗沉、易脫落，精神狀態(tài)不佳，易激惹等狀態(tài)。染毒第10～15周，高砷(H、HN)染毒組大鼠體重低于對照組和低砷組(P<0.05)，低砷(L、LN)染毒組與對照組體重?zé)o差異(P>0.05,見表2)。

表2 砷暴露后不同時間段大鼠體重變化情況

2.2 空腹血糖、空腹胰島素的變化情況 染砷13周，與對照組比較，各染砷組大鼠空腹血糖均升高(P<0.05)，且血糖高于7.0 mmol/L。與L組比較，高砷(H、HN)染毒組血糖均升高(P<0.05)。13周后開始腹腔注射GSK-3β抑制劑(LiCl)至15周。染砷15周后，H和L組大鼠血糖仍高于對照組(P<0.05)；LN和HN組大鼠血糖與對照組大鼠無差異且血糖低于7.0 mmol/L(P>0.05)。

染砷13周后，與對照組比較，各染砷組大鼠空腹胰島素均降低(P<0.05)。染砷15周后，L和H組大鼠空腹胰島素仍低于對照組(P<0.05)；LN和HN組大鼠胰島素與對照組大鼠無差異(P>0.05)；LN組空腹胰島素高于L和H組(P<0.05)，HN組空腹胰島素高于L和H組(P<0.05，見表3)。

表3 染砷13周和15周后大鼠空腹血糖和空腹胰島素水平

2.3 糖化血紅蛋白 染砷13周后，與對照組比較，各染砷組大鼠空腹糖化血紅蛋白水平均增高(P<0.05，見圖1)。

*：與C組比較，P<0.05。

2.4 胰島素抵抗指數(shù)、胰島素敏感指數(shù)的變化情況 砷暴露13周后，與對照組比，各染砷組大鼠胰島素抵抗指數(shù)增加(P<0.05)。15周后，L和H組大鼠胰島素抵抗指數(shù)仍高于對照組(P<0.05)，HN組胰島素胰島素抵抗指數(shù)低于H組(見表4)。

砷暴露13周后，與對照組比，各染砷組大鼠胰島素敏感指數(shù)降低(P<0.05)，H組大鼠胰島素敏感指數(shù)低于L組。15周后，L和H組大鼠胰島素敏感指數(shù)仍低于對照組(P<0.05)，H組大鼠胰島素敏感指數(shù)低于L組(P<0.05)，LN組胰島素敏感指數(shù)高于L組(P<0.05)，且 HN組胰島素敏感指數(shù)高于H組(P<0.05，見表4)。

表4 染砷13、15周后大鼠胰島素抵抗指數(shù)和胰島素敏感指數(shù)的變化情況

2.5 大鼠肝組織中GSK-3β基因mRNA表達(dá)水平的變化 砷暴露后，與對照組比較，L和H組大鼠肝臟GSK-3βmRNA增高(P<0.05)，LN和HN組大鼠肝臟GSK-3β mRNA無差異(P>0.05)；與H組比較，HN組GSK-3βmRNA降低(P<0.05，見圖2)。

*：與C組比較，P<0.05; $：與H組比較，P <0.05。

2.6 大鼠肝組織中GSK-3β及p-GSK-3β蛋白表達(dá)水平的變化 GSK-3β蛋白水平在各組大鼠肝臟無明顯差異。與對照組比較，L和H組大鼠肝臟Ser9-GSK-3β蛋白水平降低(P<0.05)，LN和HN組大鼠肝臟Ser9-GSK-3β蛋白水平無差異(P>0.05)；與L組比較，LN組大鼠Ser9-GSK-3β蛋白水平增高(P<0.05)；與H組比較，HN組大鼠Ser9-GSK-3β蛋白水平增高(P<0.05)。

以Ser9-GSK-3β/GSK-3β的比值表示GSK-3β蛋白活性，即比值越高，活性則越低。與C組比較，H和L組GSK-3β蛋白活性增高(P<0.05)，LN和HN組大鼠肝臟GSK-3β蛋白活性無差異(P>0.05)。與L組比較，LN組GSK-3β蛋白活性降低(P<0.05)。與H比較，HN組GSK-3β蛋白活性降低(P<0.05，見圖3)。

*：與C比較，P<0.05; #：與L組比較，P<0.05; $：與H組比較，P<0.05。

3 討論

近年來砷暴露與糖尿病的關(guān)聯(lián)性受越來越多的研究者關(guān)注和認(rèn)可，本研究前期人群試驗(yàn)也提示砷暴露可增加糖尿病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[18]。但砷致糖尿病的具體機(jī)制尚不清楚。研究顯示，砷可增強(qiáng)GSK-3β活性[19]；且2型糖尿病患者外周血中GSK-3β活性也明顯增強(qiáng)[20]。因此，可提出假設(shè)，砷致糖尿病可能與砷增強(qiáng)機(jī)體GSK-3β蛋白活性有關(guān)。

本研究開展了動物實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證以上假設(shè)，選擇飲水砷暴露對SD大鼠進(jìn)行染毒，每周檢測大鼠空腹血糖，砷暴露13周后，各染砷組大鼠空腹血糖和血紅蛋白均高于對照組，血糖均值高于7.0 mmol/L；這證明了砷暴露可干擾血糖穩(wěn)態(tài)；同樣時間檢測大鼠胰島素水平，各染砷組大鼠血清胰島素水平均低于對照組，根據(jù)公式計(jì)算得出各染砷組大鼠胰島素抵抗指數(shù)均高于對照組且胰島素敏感指數(shù)均低于對照組。因此，以上結(jié)果均證實(shí)砷暴露可致SD大鼠糖代謝紊亂，這提示砷致大鼠糖代謝紊亂模型建立成功。

研究證實(shí)小鼠整體的葡萄糖耐量可受GSK-3β活性的影響[21]。Kaidanovich等[22]研究中也顯示糖尿病鼠的GSK-3β活性也明顯增高。本研究結(jié)果顯示，各染砷組Ser9-GSK-3β蛋白水平降低，GSK-3β蛋白活性增加；綜上結(jié)果可猜測砷可抑制GSK-3β蛋白Ser9位點(diǎn)的磷酸化，增強(qiáng)GSK-3β蛋白活性，引起糖代謝紊亂，最終引發(fā)糖尿病。

進(jìn)一步分析本研究中GSK-3β抑制劑組大鼠的結(jié)果。LiCl為GSK-3β抑制劑，GSK-3β是它的主要作用靶點(diǎn)，它能使GSK-3β的Ser9位點(diǎn)磷酸化，從而抑制GSK-3β活性[23]。本研究在染砷13周后腹腔注射LiCl 2周，結(jié)果顯示：2個砷+LiCl組大鼠空腹血糖較低砷和高砷組下降，空腹胰島素水平增高；其次2個砷+LiCl組大鼠Ser9-GSK-3β/GSK-3β的比值高于低砷和高砷組，即2個砷+LiCl組大鼠GSK-3β蛋白活性低于低砷和高砷組。以上結(jié)果可揭示LiCl發(fā)揮了胰島素的效能，特異的調(diào)節(jié)了GSK-3β蛋白活性，使砷致糖代謝紊亂大鼠GSK-3β蛋白活性降低。綜上所述，染砷組和GSK-3β抑制劑干預(yù)組大鼠結(jié)果，可揭示砷暴露大鼠中，GSK-3β可調(diào)節(jié)大鼠血糖和胰島素水平，發(fā)生胰島素抵抗或胰島素敏感性降低，導(dǎo)致糖代謝紊亂。

然而，有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究砷通過增加GSK-3β蛋白活性引起糖代謝紊亂的具體機(jī)制。目前猜測可能通過以下兩個方向：(1)通過GSK3-PDX1依賴性軸導(dǎo)致β細(xì)胞衰竭[24]。(2)通過抑制GSK-3β調(diào)節(jié)肝臟糖原合酶合成過程[25]，降低了機(jī)體肝糖原的合成代謝。

結(jié)合以上結(jié)果可顯示砷可抑制GSK-3β的Ser9位點(diǎn)磷酸化，從而增強(qiáng)GSK-3β活性，機(jī)體發(fā)生胰島素抵抗和(或)胰島素分泌不足，最終引起糖代謝紊亂。由此可提出假想，GSK-3β可能是砷致糖代謝紊亂的生物標(biāo)志，可作為砷致糖尿病的一個治療靶點(diǎn)。但此假想還需要大量實(shí)驗(yàn)去證實(shí)。