二甲雙胍對(duì)2型糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變和細(xì)胞焦亡的影響及機(jī)制研究

周 群，石 婷

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院 南京市第一醫(yī)院 藥學(xué)部，江蘇 南京 210006)

2型糖尿病(Type 2 diabetes)是指胰島素相對(duì)缺乏，患者主要由于胰島素分泌不足或耐受導(dǎo)致血糖升高，并且具有多飲、多尿、多食、體重降低這一典型的“三多一少”癥狀，是目前臨床最常見的慢性病及基礎(chǔ)疾病之一，隨著我國人口老齡化與生活方式的變化，發(fā)病率逐年增高[1]。糖尿病患病率從1980年的0.67%飆升至2013年的10.4%，我國糖尿病以2型糖尿病為主，1型糖尿病及其他類型糖尿病少見[2]。糖尿病的各種慢性并發(fā)癥是糖尿病患者殘疾、致死的最重要原因，糖尿病慢性并發(fā)癥中以糖尿病視網(wǎng)膜病變(Diabetic retinopathy，DR)致殘率最高，但目前臨床上缺乏其無創(chuàng)的篩查方法[3]。糖尿病視網(wǎng)膜病變作為糖尿病患者常見的眼部并發(fā)癥，是工作年齡段人群中常見的致盲原因，我國糖尿病人群中DR的患病率為25.0%～43.1%，而其發(fā)病是環(huán)境因素和遺傳因素共同作用的結(jié)果，高血糖、高血壓和糖尿病長病程是促進(jìn)糖尿病視網(wǎng)膜病變重要的環(huán)境因素[4]。二甲雙胍是雙胍類降糖藥，也是首選用于單純飲食控制及體育鍛煉治療無效的、特別是肥胖的2型糖尿病一線和首選的口服藥物，早期研究認(rèn)為二甲雙胍可以通過活化AMP依賴的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)降低肝糖原的生成、提高周圍組織對(duì)葡萄糖的利用度來降低血糖，近年研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍具有多重效應(yīng)，如減少糖尿病患者大血管和微血管的并發(fā)癥以及腫瘤的發(fā)生率[5]。二甲雙胍廣泛應(yīng)用于2型糖尿病不僅是因?yàn)閷?duì)血糖控制作用良好，而且其對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變患者的微血管和大血管并發(fā)癥具有較好的保護(hù)作用，國內(nèi)外均有報(bào)道，二甲雙胍聯(lián)合傳統(tǒng)中藥或其他藥物可減輕糖尿病視網(wǎng)膜病變程度[6-7]。

弗氏、志賀氏桿菌誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞時(shí)可觀察到細(xì)胞發(fā)生程序性死亡，伴有細(xì)胞膜完整性喪失、細(xì)胞內(nèi)容物釋放及炎癥反應(yīng)，這些表現(xiàn)與已知細(xì)胞凋亡結(jié)果不同，這種死亡方式由半胱氨酸蛋白酶 1(Caspase-1)介導(dǎo)，而非傳統(tǒng)的 Caspase-3 介導(dǎo)，2001年首次提出“Pyroptosis”一詞來形容該類在巨噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的依托Caspase-1、伴隨炎癥反應(yīng)發(fā)生的細(xì)胞死亡方式，稱之為“細(xì)胞焦亡”[8]。糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機(jī)制與多種炎癥性疾病相似，包括細(xì)胞焦亡在內(nèi)的炎癥機(jī)制可能是糖尿病視網(wǎng)膜病變的中心環(huán)節(jié)之一，高血糖通過細(xì)胞焦亡或自噬等生物過程引起炎性反應(yīng)從而導(dǎo)致血管和視網(wǎng)膜組織損傷[9]。但目前二甲雙胍對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變的改善作用的機(jī)制報(bào)道較少，本研究將在2型糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠中探討二甲雙胍對(duì)細(xì)胞焦亡的影響。

1 材料與方法

1.1 構(gòu)建模型 選取4周齡的雄性Wistar大鼠90只，隨機(jī)選取30只給與標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，設(shè)為對(duì)照組。取60只大鼠設(shè)為實(shí)驗(yàn)組給與高脂飼料(10%豬油；20%蔗糖；1.0%膽汁酸；2.5%膽固醇；66.5%標(biāo)準(zhǔn)飲食)，1周后實(shí)驗(yàn)組腹腔注射30 mg/kg的STZ，對(duì)照組腹腔注射同等劑量的溶劑，連續(xù)注射1周以構(gòu)建高血糖模型[10]。實(shí)驗(yàn)組繼續(xù)高脂高糖飲食喂養(yǎng)1個(gè)月，至大鼠出現(xiàn)高血糖、胰島素抵抗則認(rèn)為2型糖尿病模型構(gòu)建成功。2型糖尿病模型構(gòu)建成功后，實(shí)驗(yàn)組繼續(xù)高脂高糖飲食喂養(yǎng)1個(gè)月，直至出現(xiàn)視網(wǎng)膜病變，則2型糖尿病視網(wǎng)膜病變模型構(gòu)建成功。將實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)、平均分為模型組與二甲雙胍組。

1.2 模型評(píng)價(jià) 高血糖模型：以空腹血糖≥11.1 mmol/L判定模型構(gòu)建成功；2型糖尿病模型：禁食一晚后測量空腹血糖及空腹胰島素，并進(jìn)行葡萄糖耐量檢測量試驗(yàn)，空腹血糖≥11.1 mmol/L及出現(xiàn)胰島素抵抗為2型糖尿病模型構(gòu)建成功[10]。2型糖尿病視網(wǎng)膜病變模型：隨機(jī)取6只大鼠，取雙眼視網(wǎng)膜，進(jìn)行HE染色，大鼠視網(wǎng)膜出現(xiàn)相關(guān)病變癥狀即為構(gòu)建成功。

1.3 分組 本次實(shí)驗(yàn)共選取90只雄性Wistar大鼠，其中30只設(shè)為對(duì)照組，給予標(biāo)準(zhǔn)飲食，每天以等量的溶劑(1%羧甲基纖維素)灌胃；模型組共27只，給予高脂高糖飲食，每天以等量的溶劑(1%羧甲基纖維素)灌胃；二甲雙胍組共27只，給與高脂高糖飲食，每天以300 mg/kg二甲雙胍(溶劑為1%羧甲基纖維素)灌胃[11]。干預(yù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行2個(gè)月。

1.4 觀察指標(biāo) 每日測量大鼠體重，觀察是否存在死亡情況。尾靜脈采血后檢測甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、血糖水平。

1.5 伊文思藍(lán)試驗(yàn) 配制30 mg/mL伊文思藍(lán)溶液(Sigma)并用微孔濾膜過濾。干預(yù)結(jié)束后，以45 mg/kg的伊文思藍(lán)尾靜脈注射入大鼠體內(nèi)，2 h后取大鼠眼球制備視網(wǎng)膜鋪片并在熒光顯微鏡下觀察。以上操作均需避光。

1.6 HE染色 取大鼠視網(wǎng)膜組織并制成石蠟切片。切片經(jīng)高溫及不同濃度的乙醇脫蠟至水后，用蘇木素染液(碧云天)染色3 min，快速將切片置入清水中終止染色。以1%鹽酸浸泡切片0.5 min后蒸餾水中蕩洗切片，用1%氨水浸泡切片0.5 min使藍(lán)色復(fù)染后洗滌切片。用伊紅染液(碧云天)浸泡切片2 min。以中性樹脂封片后鏡下觀察。

1.7 Western blot實(shí)驗(yàn) 提取視網(wǎng)膜組織總蛋白并制備蛋白樣品；制備不同濃度的SDS-PAGE膠，樣品在膠中電泳以分離不同分子量大小的蛋白；在恒流條件下將膠中蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜中，完成后用5%牛奶封閉2 h。在4度條件下，孵育一抗過夜(NLRP3：Proteintech，19771-1-AP；Caspase-1：Proteintech，22915-1-AP)。以5%牛奶配制辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗，37℃孵育1 h；加入化學(xué)發(fā)光顯影液并拍照。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn) 提取大鼠視網(wǎng)膜組織總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(南京諾唯贊)將各組RNA逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA并進(jìn)行擴(kuò)增。

1.9 電鏡 取視網(wǎng)膜組織加入4%戊二醛溶液并將樣品置于4 ℃冰箱中過夜。棄去上清并洗滌后，用1%的鋨酸固定2 h。洗滌后將樣品用酒精脫水后加入丙酮，靜置。將樣品逐步包埋后靜置1 d。樣品切片后，用 3 %醋酸鈾-檸檬酸鉛進(jìn)行染色并在電鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 二甲雙胍對(duì)體重、血糖的影響 二甲雙胍治療2型糖尿病伴視網(wǎng)膜病變大鼠2個(gè)月后，檢測體重、空腹血糖和空腹胰島素的變化。通過表1，相對(duì)于對(duì)照組，模型組和二甲雙胍組大鼠體重顯著下降，但二甲雙胍組體重相對(duì)于模型組較高；模型組與二甲雙胍組大鼠空腹血糖和胰島素水平均高于對(duì)照組，經(jīng)二甲雙胍治療后，均顯著下降。

表1 各組大鼠體重、血糖及胰島素水平對(duì)比(n=30)

2.2 二甲雙胍對(duì)生化指標(biāo)的影響 經(jīng)二甲雙胍治療后，大鼠血清生化指標(biāo)的變化。2型糖尿病伴視網(wǎng)膜病變大鼠總膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白水平較對(duì)照組升高，但經(jīng)二甲雙胍治療后，顯著降低；相對(duì)于對(duì)照組，模型組和二甲雙胍組大鼠高密度脂蛋白顯著下降，但二甲雙胍組水平相對(duì)于模型組較高(見表2)。

表2 各組大鼠體重、血糖及胰島素水平對(duì)比(n=30)

2.3 二甲雙胍對(duì)視網(wǎng)膜病變的影響 如圖1A所示，對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜血管形態(tài)正常，紅色熒光染料均勻分布于血管中，邊緣清晰且無滲漏；模型組大鼠視網(wǎng)膜背景熒光增強(qiáng)，出現(xiàn)明顯的滲漏點(diǎn)，出現(xiàn)明顯的血管擴(kuò)張現(xiàn)象；經(jīng)二甲雙胍治療的大鼠，滲漏點(diǎn)相對(duì)于模型組顯著減少，血管擴(kuò)張現(xiàn)象較輕。如圖1B所示，對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜層次清晰，排列整齊，未出現(xiàn)毛細(xì)血管病變；模型組大鼠視網(wǎng)膜各層變厚且排列紊亂，視網(wǎng)膜外存在萎縮現(xiàn)象；而二甲雙胍組視網(wǎng)膜外層清晰，未見萎縮現(xiàn)象。經(jīng)以上實(shí)驗(yàn)，二甲雙胍可以明顯改善2型糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠的血管擴(kuò)張現(xiàn)象。

A：用伊文思藍(lán)試驗(yàn)觀察各組視網(wǎng)膜血管滲漏情況；B：HE染色在200倍鏡下觀察各組大鼠視網(wǎng)膜病變情況；每組均隨機(jī)選取6個(gè)樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.4 二甲雙胍對(duì)細(xì)胞焦亡的影響 NLRP3(Pryrin 結(jié)構(gòu)域蛋白3，nod-like receptor protein 3)和Caspase-1均為細(xì)胞焦亡的標(biāo)志性蛋白。在模型組大鼠視網(wǎng)膜組織中，NLRP3和Caspase-1蛋白與mRNA水平均顯著升高，而經(jīng)二甲雙胍治療后，明顯下降。以上結(jié)果表明，二甲雙胍能夠改善視網(wǎng)膜組織細(xì)胞的焦亡現(xiàn)象。

A：Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測二甲雙胍作用后各組視網(wǎng)膜組織中NLRP3和Caspase-1蛋白表達(dá)情況；B：實(shí)時(shí)熒光定量 PCR實(shí)驗(yàn)檢測二甲雙胍作用后各組視網(wǎng)膜組織中NLRP3和Caspase-1的mRNA表達(dá)情況；*：與對(duì)照組相比，P<0.05；#：與模型組相比，P<0.05。每組均隨機(jī)選取6個(gè)樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3 討論

糖尿病確切的病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，對(duì)糖尿病的治療已成為需要全人類共同攻克的難題，2型糖尿病發(fā)展至后期會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的并發(fā)癥，如糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病腎病、糖尿病足等[12]。長期高血糖狀態(tài)容易使管壁周細(xì)胞減少，視網(wǎng)膜內(nèi)屏障遭到破壞，導(dǎo)致視網(wǎng)膜出血、滲出等癥狀，毛細(xì)血管基底膜增厚，血液循環(huán)受阻，視網(wǎng)膜缺血、缺氧，從而產(chǎn)生一系列增殖性改變，因此，有效控制血糖能夠有效降低糖尿病發(fā)病率的同時(shí)也能有效降低糖尿病患者視網(wǎng)膜病變的致盲率[13]。眾多因素對(duì)其發(fā)生發(fā)展過程產(chǎn)生影響。陳雪等[14-15]發(fā)現(xiàn)，收縮壓和脈壓變異性是影響2型糖尿病患者伴發(fā)視網(wǎng)膜病變的危險(xiǎn)因素，但甲狀腺功能減退與其發(fā)病無關(guān)。通過分析2型糖尿病視網(wǎng)膜病變患者與健康人群脈絡(luò)膜血管指數(shù)的差異及特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)脈絡(luò)膜血管指數(shù)可以直觀反映其內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化并且在健康人群中較高，具有較高的診斷意義[16]。二甲雙胍作為常見的治療糖尿病藥物，常與其它藥物聯(lián)合在糖尿病視網(wǎng)膜病變的治療中發(fā)揮重要作用。王化湘等[17]發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍聯(lián)合抗血管內(nèi)皮生長因子藥物治療糖尿病視網(wǎng)膜病變,能夠有效改善患者視力狀況。張哲等[18]研究中，聯(lián)合應(yīng)用二甲雙胍與抗血管內(nèi)皮生長因子藥物較單純使用更能改善糖尿病視網(wǎng)膜病變情況，能抑制血管內(nèi)皮生長因子所誘導(dǎo)的的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞增生及遷移，其作用機(jī)制可能與二甲雙胍抑制血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)有關(guān)。二甲雙胍聯(lián)合骨化三醇對(duì)2型糖尿病患者視網(wǎng)膜具有一定保護(hù)作用，并且臨床不良反應(yīng)較小,安全性較高[19]。在機(jī)制方面，YI等發(fā)現(xiàn)可降低血管內(nèi)皮生長因子受體2的磷酸化水平抑制VEGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[20]。并且二甲雙胍可能通過誘導(dǎo)microRNA-497a-5p的水平，從而導(dǎo)致視網(wǎng)膜新生血管減少[21]。在本研究中，二甲雙胍治療2型糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠后，降低模型組大鼠的血糖、血脂等相關(guān)生化指標(biāo)，并且顯著改善了視網(wǎng)膜病變情況。

焦亡作為一種細(xì)胞死亡的方式，其主要特征為細(xì)胞膜孔的快速形成，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)炎癥物質(zhì)的釋放和細(xì)胞破裂[22]。二甲雙胍不僅作為糖尿病治療的一線用藥，同時(shí)也具有直接的抗炎作用[23]。魏紅霞等[24]發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍增強(qiáng)脂多糖激活的腹腔巨噬細(xì)胞在ATP(腺嘌呤核苷三磷酸，Adenosine-triphosphate)刺激下的炎癥小體活化,提高caspase-1活化和成熟白細(xì)胞介素-1β釋放，促進(jìn)炎癥反應(yīng)。在糖尿病視網(wǎng)膜病變的研究中，Sirpa等[25]研究發(fā)現(xiàn)NLRP3炎性體在非增殖期糖尿病視網(wǎng)膜病變中是激活狀態(tài)。另外，在糖尿病視網(wǎng)膜病變患者的手術(shù)切除的增殖膜中，觀察到NLRP3、caspase-1和白細(xì)胞介素-1β表達(dá)增高，表明以上蛋白可能與病程的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠模型中，NLRP3、caspase-1表達(dá)升高，但經(jīng)二甲雙胍治療后，顯著降低。

本研究主要發(fā)現(xiàn)了二甲雙胍能夠顯著改善糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變情況，其與減少細(xì)胞焦亡水平有關(guān)，但其二甲雙胍影響細(xì)胞焦亡的具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。