5-Aza-CdR干擾人子宮內膜樣癌JEC細胞后ER拮抗劑對細胞增殖、形態(tài)及p57kip2蛋白表達的影響

鐘 櫟，周 俊，張春英，周正平

(1.遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 病理科，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)科大學 電鏡室，貴州 遵義 563099；3.遵義醫(yī)科大學 病理學教研室，貴州 遵義 563099)

子宮內膜癌是發(fā)達國家最常見的婦科腫瘤，其發(fā)病率逐年上升[1]。據美國癌癥協(xié)會估計，2019年在美國被診斷為子宮內膜癌的女性患者有61 880例，其中12 160例死于此病[2]。我國子宮內膜癌發(fā)病率約為60/10萬，死亡率約為20/10萬[3]。根據子宮內膜癌的致病機理和生物學行為特征，將其分為Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型的主要組織學類型為子宮內膜樣癌(Endometrioid carcinoma,EC)，其發(fā)病率約為80%～90%[4]。EC的發(fā)生發(fā)展主要與雌激素長期刺激有關[5]。雌激素與靶細胞雌激素受體(Estrogen receptor,ER)結合后，可通過核受體與膜受體兩條途徑，調節(jié)靶基因轉錄，促進細胞增殖[6]。ER拮抗劑分ER調節(jié)劑(Selective estrogen receptor modulator,SERM)和ER降解劑(Selective estrogen receptor degrading,SERD)，SERM常使用他莫昔芬(Tamoxifen,TAM)，TAM有Z型和E型兩種構型，Z型與ER結合后表現(xiàn)抗雌激素作用，抑制細胞增殖，而E型則表現(xiàn)為弱雌激素樣作用。SERD主要包括氟維司群(ICI-182780,ICI)，ICI直接與ER結合并阻止ER的激活，發(fā)揮拮抗雌激素作用[7]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，TAM對JEC細胞有弱促增殖作用，ICI則有明顯抗雌激素作用[8]。

EC的發(fā)生還與細胞周期的異常調控有關。p57kip2是細胞周期蛋白依賴性激酶(Cyclin-dependent-kinase,CDK)抑制劑(CKI)CIP/KIP家族的一員，可抑制細胞周期蛋白(Cyclin)D/E-CDK復合物活性，阻礙細胞從G1期向S期進展，抑制細胞增殖[9]。p57kip2在大多數腫瘤組織中，未見基因突變事件，異常表達可能與表觀遺傳改變中的DNA甲基化有關[10]。生理情況下，抑癌基因啟動子常處于非甲基化狀態(tài)，但由于其啟動子區(qū)內富集的胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤(CpG)序列，故抑癌基因啟動子較易發(fā)生甲基化[11]。癌基因的低甲基化、抑癌基因的高甲基化促進了腫瘤的發(fā)生發(fā)展[12]。5-氮雜-2'-脫氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-CdR)是一種DNA甲基化轉移酶(DNA Methyltransferase,DNMT)抑制劑，在低濃度下具有去甲基化作用，恢復抑癌基因的活性[13]。本實驗擬使用亞硫酸氫鹽測序(Bisulfite sequencing PCR,BSP)法檢測5-Aza-CdR干擾前后JEC細胞p57kip2啟動子區(qū)的甲基化率；分別用甲基偶氮唑鹽比色(MTT)法、光鏡和電鏡、蛋白印跡(Western blot)法檢測5-Aza-CdR干擾后TAM、ICI對JEC細胞的增殖、形態(tài)改變和p57kip2蛋白的表達情況的影響，進一步探討p57kip2基因的DNA甲基化、ER拮抗劑與子宮內膜癌細胞增殖和分化的關系，為EC的內分泌輔助治療提供一定的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 人EC中分化JEC細胞株[14]由遵義醫(yī)科大學微生物教研室提供。雌二醇(β-estradiol,E2)、TAM、ICI購自Sigma公司，鼠抗人P57kip2單克隆抗體購自英國Abcom公司，鼠抗人β-actin單克隆抗體購自碧云天生物技術(上海)研究所。酶標儀(美國Thermoscientific公司)，倒置顯微鏡CKX41(日本 OLYMPUS公司)，透射電子顯微鏡H-7650(日本日立公司)，Western blot相關儀器(BIO-RAD公司)。

1.2 細胞培養(yǎng) 配制完全培養(yǎng)液(10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素、90%RPMI 1640培養(yǎng)液)體外培養(yǎng)JEC細胞，培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃、5%CO2。

1.3 方法

1.3.1 BSP法檢測JEC細胞p57kip2啟動子區(qū)的甲基化率 分別用含0 mol/L、1.25×10-5mol/L的5-Aza-CdR的培養(yǎng)基培養(yǎng)JEC細胞24 h后，經胰酶消化后離心成細胞團塊，送生工生物工程(上海)股份有限公司提取DNA后通過BSP法分別檢測5-Aza-CdR(0 mol/L)組、5-Aza-CdR(1.25×10-5mol/L)組細胞p57kip2啟動子區(qū)32個CPG位點的甲基化狀態(tài)。引物序列為：Forward,5’-GTTAGTAGGTGTGTGAGGGTTTTAG-3’,Reverse:5’-CTCCTTTATCTACAAACRAAAACCTC-3’,擴增長度298 bp。PCR反應條件：95 ℃預變性3～5 min，94 ℃變性30 s，55～60℃變性30 s，72 ℃退火30～50 s，循環(huán)35次，最后72 ℃延伸5～8 min后測序。

1.3.2 檢測5-Aza-CdR干擾后ER拮抗劑對JEC細胞的影響

1.3.2.1 實驗分組 將JEC細胞分為對照組、E2組、TAM組、ICI組、E2+TAM組、E2+ICI組，各組藥物的終濃度均為1.0×10-6mol/L。使用等量且濃度為1.25×10-5mol/L的5-Aza-CdR預先處理各組細胞24 h后，體外繼續(xù)培養(yǎng)各組24、48、72 h；72 h時段的各組細胞在培養(yǎng)48 h時追加一次等量且濃度為1.25×10-5mol/L的5-Aza-CdR。

1.3.2.2 MTT法檢測JEC細胞的增殖活性 取對數生長期的JEC細胞，制成單細胞懸液(1.0×105個/mL)后接種于96孔板中，每孔100 μL，每組設 5個復孔。經上述藥物處理，分別培養(yǎng)各組24、48、72 h后，棄培養(yǎng)液，PBS溶液沖洗后各孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL(避光操作)，放入培養(yǎng)箱中充分反應4h，棄MTT溶液后每孔再加入100 μL DMSO，避光振蕩10 min，在酶聯(lián)免疫檢測儀波長490 nm處檢測各孔的OD值。OD值越大，活細胞數量越多，細胞的增殖能力越強。實驗重復3次。

1.3.2.3 倒置顯微鏡觀察JEC細胞的生長情況 6孔板培養(yǎng)JEC細胞，每組設3個復孔。經上述藥物處理，培養(yǎng)各組72 h后，通過倒置顯微鏡觀察細胞的密度和形態(tài)的改變。實驗重復3次。

1.3.2.4 透射電鏡觀察JEC細胞的超微結構 經上述藥物處理，培養(yǎng)各組72 h后，經胰酶消化后高速離心成細胞團塊，加入固定液(2.5%戊二醛)固定，經脫水、浸透、包埋聚合，用超薄切片機行超薄切片、電子染色后，在透射電鏡下進行觀察。

1.3.2.5 Western blot法檢測JEC細胞p57kip2蛋白的表達情況 經上述藥物處理，培養(yǎng)各組72 h后，加入RIPA裂解液200 μL/孔，冰上裂解0.5 h，超速離心后提取蛋白，行BCA法定蛋白濃度。配制分離膠及濃縮膠(濃度分別為12%、5%)，行SDS-PAGE分離蛋白；將分離后的目的蛋白所在區(qū)域的凝膠切下，轉移至PVDF膜上后，搖床上用封閉液(5%脫脂奶粉)封閉2 h，加入一抗[鼠抗人P57kip2和β-actin單克隆抗體(體積稀釋比例分別為1∶200和1∶1 000)]孵育過夜，經TBST洗膜3次后加入二抗[兔抗鼠IgG(體積稀釋比例為1∶10 000)]，室溫下充分反應2 h，再用TBST洗膜3次，最后用Odyssey系統(tǒng)將PVDF膜掃描成像后檢測蛋白條帶的D值。以目的條帶與內參照β-actin條帶灰度值之比表示目的蛋白的相對表達水平。實驗重復3次。

2 結果

2.1 BSP法檢測JEC細胞p57kip2啟動子區(qū)甲基化率的結果 培養(yǎng)24 h后，JEC細胞p57kip2啟動子區(qū)甲基化率在5-Aza-CdR(0mol/L)組為88.1%，在5-Aza-CdR(1.25×10-5mol/L)組為76.2%(見圖1)。

圖1 5-Aza-CdR(0 mol/L)組和5-Aza-CdR(1.25×10-5mol/L)組JEC細胞p57kip2啟動子區(qū)的甲基化率

2.2 5-Aza-CdR干擾后ER拮抗劑對JEC細胞的影響

2.2.1 MTT檢測結果 與對照組相比，E2組和TAM組的細胞增殖活性在24、48、72 h均升高，其中E2組在24 h升高更顯著(P<0.05)；ICI組、E2+TAM組、E2+ICI組在各時間段的細胞增殖活性均下降，且均在24 h下降更明顯(P<0.05)。與E2組相比，ICI組、E2+TAM組、E2+ICI組的細胞增殖活性在各時間段均下降，其中以E2+TAM組在24、48 h下降最明顯(P<0.05)，E2+ICI組在72 h下降最顯著(P<0.05)。在同一藥物分組下：與24 h比較，對照組、TAM組、ICI組、E2+TAM組的細胞增殖活性在48 h升高(P<0.05)，E2組、TAM組、E2+TAM組、E2+ICI組的細胞增殖活性在72 h升高不明顯(P<0.05,見圖2)。

■:P<0.05 vs 對照組；▲:P<0.05 vs E2組；*:P<0.05 vs 24 h 對照組、TAM組、ICI組、E2+TAM組；**:P<0.05 vs 24 h E2組、TAM組、E2+TAM組、E2+ICI組。

2.2.2 倒置顯微鏡觀察JEC細胞的生長情況 培養(yǎng)72 h，對照組細胞均勻布滿視野的70%～80%，細胞形態(tài)呈梭形或不規(guī)則形，可見圍腺腔樣結構。與對照組相比，E2組細胞密度明顯升高，TAM組稍增加，ICI組、E2+ICI組、E2+TAM組細胞密度均降低，其中以E2+TAM組下降最明顯(見圖3)。

A：對照組；B：E2組；C：TAM組；D：ICI組；E：E2+TAM組；F：E2+ICI組。

2.2.3 透射電鏡觀察JEC細胞的超微結構 培養(yǎng)72 h，對照組細胞呈圓形或類圓形，細胞游離緣可見少量微絨毛；細胞內可見一定數量的線粒體，部分細胞內可見擴張的內質網和自噬溶酶體，偶見分泌泡；細胞核大而不規(guī)則，核仁明顯；與對照組比較，E2+TAM組細胞游離緣微絨毛稍增多，其余各實驗組細胞游離緣微絨毛均有所減少；各實驗組細胞內均可見較為豐富的線粒體及稍擴張的內質網，可見少量自噬溶酶體散在分布于胞質內；TAM組、ICI組、E2+TAM組、E2+ICI組細胞內分泌泡增多，其中以E2+TAM組、E2+ICI組分泌泡數量最多；TAM組、E2+ICI組部分細胞可見凋亡小體(見圖4)。

A：對照組(Bar=2.0 μm)；B：E2組(Bar=2.0 μm)；C：TAM組(Bar=2.0 μm)；D：ICI組(Bar=5.0 μm)；E：E2+TAM組(Bar=2.0 μm)；F：E2+ICI組(Bar=5.0 μm)。

2.2.4 Western blot結果 培養(yǎng)72 h，與對照組相比，E2組的p57kip2蛋白表達減少(P<0.05)；ICI組、E2+TAM組、E2+ICI組中p57kip2蛋白的表達量均明顯增高(P<0.05)，其中E2+TAM組增高最明顯(P<0.05)；TAM組的p57kip2蛋白的表達量略高于對照組(P>0.05，見圖5～6)。

1：對照組；2：E2組；3：TAM組；4：ICI組；5：E2+TAM組；6：E2+ICI組。

★：P<0.05 vs 對照組；◆：P<0.05 vs E2組。

3 討論

子宮內膜癌是最常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一,在我國的發(fā)病率僅次于宮頸癌，嚴重威脅女性健康[3]。子宮內膜癌的主要病理類型是EC，其發(fā)生發(fā)展除無孕激素拮抗的雌激素長期刺激外[5,15]還與基因突變[16]、細胞周期調控異常和表觀遺傳改變等因素有關[17]。

研究表明，對已接受乳腺切除術的乳腺導管原位癌患者使用TAM治療后會出現(xiàn)子宮內膜增生、子宮內膜癌等不良反應，這可能與TAM的組織選擇性有關，在乳腺組織可拮抗ER發(fā)揮拮抗雌激素作用，而在子宮內膜組織中激活ER發(fā)揮雌激素樣作用[18]。ICI對ER具有很高的親和力，與ER結合后能完全阻斷ER的轉錄活性并降解ER，從而發(fā)揮抗雌激素作用，而不誘導子宮內膜增殖(無類雌激素樣作用)[7]。

p57kip2是定位于11p15.5的抑癌基因，是CIP/KIP家族成員中最晚被發(fā)現(xiàn)的。p57kip2蛋白由316個氨基酸組成，其氨基末端與Cyclin-CDK復合物結合后，能抑制CDK活性，負向調控細胞周期[9]。研究發(fā)現(xiàn)，p57kip2蛋白在淋巴瘤、乳腺癌、前列腺癌、肺癌[19-22]等組織中的表達明顯下調或缺乏。

p57kip2是父系等位基因沉默，母系等位基因表達的印記基因，其表達的下調或缺乏可能與表觀遺傳修飾相關[10]。表觀遺傳修飾常為DNA甲基化、組蛋白乙酰化[23]。DNA甲基化指甲基(CH3)基團在DNMT的催化下共價結合到DNA序列上的胞嘧啶殘基上，生成5-甲基胞嘧啶的過程，整個過程不改變DNA序列，而只對部分堿基對進行甲基化修飾[11]。DNA的過度甲基化是引起抑癌基因失活的重要方式之一。目前許多研究證明腫瘤抑癌基因的失活與該基因的啟動子區(qū)的CpG島高甲基化狀態(tài)有關[24]。在肺鱗癌和早期聲帶癌的研究中發(fā)現(xiàn)p57kip2基因啟動子區(qū)的高甲基化與p57kip2蛋白不表達或低表達有關[25-26]。

5-Aza-CdR是一種胞嘧啶類似物，能代替胞嘧啶捕獲DNMT并摻入DNA中，隨細胞的分裂，導致DNMT降解，從而降低腫瘤細胞中抑癌基因啟動子區(qū)的高甲基化水平，解除高甲基化對抑癌基因生物學功能的抑制，使抑癌基因重新表達或使其表達上調，誘導腫瘤細胞凋亡或向正常細胞分化[13]。已有研究顯示，5-Aza-CdR能逆轉RASSF1A基因高甲基化狀態(tài)，使因高甲基化而完全失活的RASSF1A基因重新表達，抑制子宮內膜癌HEC-1-B細胞的增殖[27]。本實驗研究結果表明，1.25×10-5mol/L的5-Aza-CdR干擾JEC細胞后，可以使其p57kip2啟動子區(qū)高甲基化水平明顯下調。由于DNA甲基化不是遺傳學上的DNA序列改變，而是一種是可逆的表觀遺傳學改變，因此5-Aza-CdR可有效逆轉p57kip2啟動子區(qū)的高甲基化狀態(tài)，可能使因p57kip2啟動子區(qū)高甲基化而低表達的p57kip2蛋白上調到相對較高水平，恢復p57kip2作為腫瘤抑制因子的生物學效應，負調控細胞周期，抑制腫瘤細胞增殖。

目前研究顯示，5-Aza-CdR能增強化療藥物在表皮樣癌、膀胱癌中的敏感性[28-29]。本課題組前期研究結果顯示：TAM可微弱促進JEC細胞增殖，ICI能抑制JEC細胞增殖，E2+TAM組、E2+ICI組細胞增殖能力高于對照組[8]。而本實驗結果顯示5-Aza-CdR干擾JEC細胞后，ICI組、E2+TAM組、E2+ICI組細胞的增殖能力明顯被抑制。表明5-Aza-CdR干擾后，能增強JEC細胞對TAM的敏感性，使TAM發(fā)揮對JEC細胞增殖的抑制作用，并加強ICI對JEC細胞增殖的抑制，這可能與5-Aza-CdR能逆轉JEC細胞p57kip2啟動子的高甲基化狀態(tài)，從而恢復p57kip2負調控細胞周期的作用有關；同時5-Aza-CdR可能促進相關腫瘤特異性抗原及腫瘤特異性免疫刺激分子的分泌，降低JEC細胞的耐藥性，從而提高JEC細胞對ER拮抗劑的敏感性。此外，E2+TAM能明顯抑制JEC細胞增殖，可能還與5-Aza-CdR使因啟動子高甲基化而沉默的ERɑ基因重新表達有關。Tang等[30]研究發(fā)現(xiàn)，5-Aza-CdR可使因啟動子高甲基化而沉默的ERɑ基因重新表達，誘導ERɑ陰性乳腺癌表達ERɑ蛋白，恢復ERɑ陰性乳腺癌細胞對TAM的敏感性。而本課題組前期研究表明，JEC細胞不表達ERɑ蛋白[8]，推測JEC細胞中ERɑ蛋白的不表達可能與ERɑ基因啟動子高甲基化有關，5-Aza-CdR可能通過逆轉ERɑ基因啟動子高甲基化狀態(tài)，使沉默的ERɑ基因重新表達，增強TAM在EC中的敏感性。

在細胞形態(tài)結構上，本課題組前期研究結果顯示：JEC細胞內分泌泡不明顯，ICI組可見自噬現(xiàn)象[8]。而本實驗研究結果顯示：5-Aza-CdR干擾JEC細胞后，各組細胞內均可見擴張的內質網、自噬溶酶體及一定數量的分泌泡，其中以E2+TAM組、E2+ICI組分泌泡數量最多，提示細胞分泌功能增強；對照組、TAM組、E2+ICI組部分細胞可見凋亡現(xiàn)象。表明5-Aza-CdR不僅可使因啟動子高甲基化而呈表觀抑制的p57kip2恢復其抑癌因子的功能，抑制腫瘤細胞生長；其本身可能還具有促進腫瘤細胞向正常細胞分化或誘導腫瘤細胞凋亡以及使腫瘤細胞的分泌功能增強的作用。同時5-Aza-CdR干擾JEC細胞后，細胞內可見擴張的內質網，提示5-Aza-CdR可能對細胞有一定損傷作用。有文獻報道，高濃度的5-Aza-CdR能直接抑制DNA的合成而促進細胞死亡，產生細胞毒作用，而低濃度的5-Aza-CdR可使DNMT失活，除去抑癌基因啟動子區(qū)的高度甲基化狀態(tài)，抑制腫瘤細胞生長，并且這種去甲基化作用具有可遺傳性[31]。有研究證明，10μg/mL的5-Aza-CdR對纖維肉瘤細胞中的DNA、RNA及蛋白質合成沒有明顯的抑制作用[32]。而本實驗中用1.25×10-5mol/L的5-Aza-CdR干擾JEC細胞，主要為對其抑癌基因p57kip2啟動子的去甲基化作用，而非抑制DNA的合成的藥物細胞毒作用。

在p57kip2蛋白表達水平上，本課題組前期研究結果顯示：與對照組比較，TAM組和E2+ICI組中p57kip2蛋白的表達水平微弱上調，ICI組p57kip2蛋白的表達水平明顯上升，E2+TAM組p57kip2蛋白的表達水平無明顯改變[8]。本實驗的結果顯示：5-Aza-CdR干擾后，TAM、ICI、E2+ICI、E2+TAM均能上調p57kip2蛋白的表達水平，且TAM、ICI分別與E2的聯(lián)合使用比單獨使用TAM、ICI能更為顯著上調p57kip2蛋白的表達。表明DNA高甲基化所致抑癌基因p57kip2表達下調是可逆轉的，通過5-Aza-CdR逆轉p57kip2啟動子區(qū)的高甲基化狀態(tài)，可能恢復p57kip2基因的活性，上調p57kip2蛋白的表達水平，促進腫瘤細胞凋亡、抑制細胞增殖；5-Aza-CdR還可能協(xié)同TAM、ICI上調p57kip2蛋白的表達水平，拮抗E2對p57kip2蛋白水平的下調，達到削弱CDK的激酶活性，從而發(fā)揮負向調控細胞周期、抑制JEC細胞進一步生長的作用。