石蠟包埋組織結(jié)核分枝桿菌檢測方法的對比分析

張繼偉，李欽麗，聶 秀

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的極具危害性的肉芽腫性病變，以肺結(jié)核最為常見。目前，組織病理學(xué)檢查已成為結(jié)核病診斷的重要手段?？顾崛旧鳛榻Y(jié)核病主要輔助檢查手段，其靈敏度、特異性均較低[1-2]?！吨袊Y(jié)核病病理學(xué)診斷專家共識》提出結(jié)核病的病理診斷標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)結(jié)核病的病理變化及結(jié)核分枝桿菌基因檢測陽性才能作出明確診斷。文獻(xiàn)報道qRT-PCR法通過特異性擴增結(jié)核分枝桿菌的DNA，現(xiàn)已成為結(jié)核病的檢測手段[3-4]。然而，其在石蠟包埋組織結(jié)核分枝桿菌檢測中的應(yīng)用較少，且各實驗室報道的陽性率差異較大[5-6]。本實驗采用qRT-PCR法進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌檢測，同時與傳統(tǒng)的抗酸染色進(jìn)行比較，結(jié)果顯示qRT-PCR優(yōu)于抗酸染色檢測，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料收集2018年5月～2019年11月華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院病理科經(jīng)病理擬診為結(jié)核病或符合結(jié)核的石蠟包埋組織1 218例，包括手術(shù)標(biāo)本683例和活檢標(biāo)本535例，其中男性716例，女性502例；年齡2個月～83歲，中位年齡50歲。病變組織種類詳見表1，其他包括乳腺、子宮腔、腕部、腹腔、胸壁腫物等組織標(biāo)本159例。

1.2 主要儀器和試劑Mx3000P型熒光定量PCR儀(美國安捷倫公司)，石蠟包埋組織基因組DNA提取試劑盒(QIAGEN公司，德國)，結(jié)核分枝桿菌核酸定量檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)(湖南圣湘生物公司)，抗酸染色液(珠海貝索生物公司)。

表1 病變組織種類及抗酸染色和qRT-PCR法檢測

1.3 qRT-PCR檢測石蠟包埋組織5 μm厚連續(xù)切片，手術(shù)標(biāo)本5片，活檢標(biāo)本10片，置于1.5 mL EP管中，按照石蠟包埋組織基因組DNA提取試劑盒的操作說明書進(jìn)行樣本DNA提取。樣本DNA的濃度及純度經(jīng)紫外分光光度法檢測合格后，按結(jié)核分枝桿菌核酸定量檢測試劑盒說明書，進(jìn)行樣本結(jié)核分枝桿菌檢測。樣本檢測時均設(shè)陽性對照和陰性對照。結(jié)果分析：目標(biāo)基因的Ct參考值為39，內(nèi)標(biāo)的Ct參考值為40。對于測定Ct≤39的樣本，報告為結(jié)核分枝桿菌DNA陽性；對于測定Ct>39的樣本，同時內(nèi)標(biāo)檢測為陽性(Ct≤40)，報告注明結(jié)核分枝桿菌DNA低于試劑盒檢測下限，若內(nèi)標(biāo)Ct>40或無顯示，該檢測無效。

1.4 抗酸染色石蠟包埋組織3 μm厚連續(xù)切片，生物透明劑康萊脫蠟2次，每次5 min，去離子水沖洗2 min。滴加石炭酸復(fù)紅染液染色30 min，染色過程中注意觀察染液的液面。去離子水沖洗2 min；分化液分化3～4次，至切片呈無色為止，部分組織可呈淡粉色；去離子水沖洗2 min。亞甲基藍(lán)溶液復(fù)染10～30 s，去離子水沖洗2 min。常規(guī)脫水、晾干、封片。染色結(jié)果判讀：抗酸桿菌呈鮮紅色，紅細(xì)胞呈粉紅色，細(xì)胞核及背景呈淡藍(lán)色。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)資料采用例和百分率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。采用Kappa檢驗比較兩種方法的一致性。

2 結(jié)果

2.1 抗酸染色和qRT-PCR法檢測結(jié)核分枝桿菌抗酸染色組織中呈亮紅色為結(jié)核分枝桿菌，長度3 μm左右(可有很大變化幅度)，呈纖細(xì)稍彎的桿狀或念珠樣成堆或散在分布，陰性為淺藍(lán)色背景下不能檢出亮紅色桿菌(圖1)。qRT-PCR檢測結(jié)核分枝桿菌內(nèi)標(biāo)曲線(藍(lán)色曲線)應(yīng)升起且Ct值≤40，結(jié)核分枝桿菌特異性基因擴增曲線(紅色曲線)升起且Ct≤39為陽性，否則為陰性(圖2)。1 218例標(biāo)本中抗酸染色陽性率為35.8%(436/1 218)，qRT-PCR檢測陽性率為51.2%(624/1 218)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=50.029，P<0.05，表1)。683例手術(shù)標(biāo)本中抗酸染色陽性率為43.5%(297/683)；qRT-PCR檢測陽性率為58.4%(399/683)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=30.477，P<0.05)。535例活檢小標(biāo)本中抗酸染色陽性率為26.0%(139/535)，qRT-PCR檢測陽性率為42.1%(225/535)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=54.058，P<0.05，表1，圖3)。其中病例數(shù)大于100例的肺、腸道、骨組織和淋巴結(jié)標(biāo)本中，抗酸染色陽性率分別為44.4%、11.35%、30.7%和42.2%，qRT-PCR檢測陽性率分別為63.3%、14.59%、50.4%和55.04%(表1，圖4)。

AB

2.2 抗酸染色和qRT-PCR檢測結(jié)核分枝桿菌的一致性本組1 218例標(biāo)本中，兩種方法檢測均陽性376例，均陰性534例，一致性為74.7%(κ=0.498，P<0.05，表2)。其中683例手術(shù)標(biāo)本采用兩種方法檢測有261例均陽性，248例均陰性，一致性為74.5%(κ=0.501，P<0.05)；535例活檢標(biāo)本采用兩種方法檢測均陽性115例，均陰性286例，一致性為75.0%(κ=0.458，P<0.05，圖5)。在病例數(shù)大于100例的肺、腸道、骨組織和淋巴結(jié)標(biāo)本中，兩種方法檢測的一致性分別為69%、91.3%、74.05%和74.3%(圖6)。376例兩種方法檢測均陽性的標(biāo)本中，qRT-PCR檢測的Ct值80%分布在24～36之間；在248例抗酸染色陰性而qRT-PCR檢測陽性病例中，qRT-PCR檢測的Ct值則80%分布在30～40之間(圖7)。

圖2 qRT-PCR法檢測結(jié)核分枝桿菌：A.陽性；B.陰性

圖3 抗酸染色和qRT-PCR法檢測手術(shù)標(biāo)本和活檢標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌的陽性率

表2 抗酸染色、qRT-PCR法檢測結(jié)核分枝桿菌一致性分析

3 討論

本實驗中抗酸染色和qRT-PCR檢測結(jié)核分枝桿菌的陽性率與文獻(xiàn)報道的結(jié)核分枝桿菌抗酸染色(31%～50.1%)和qRT-PCR檢測(50%～75.8%)結(jié)果基本一致[5-7]。本組對683例手術(shù)標(biāo)本和535例活檢標(biāo)本同時用兩種方法檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)活檢標(biāo)本抗酸染色和qRT-PCR檢測的陽性率為26.0%和42.1%，均顯著低于手術(shù)標(biāo)本的抗酸染色(43.5%)和qRT-PCR檢測(58.4%)。活檢標(biāo)本陽性率低于手術(shù)標(biāo)本的主要原因：活檢標(biāo)本組織量較少，大部分含菌量較低，經(jīng)常規(guī)HE和免疫組化染色后損失較多，同時活檢標(biāo)本前期組織處理不當(dāng)更容易導(dǎo)致DNA降解，顯著影響結(jié)核分枝桿菌qRT-PCR檢測。因此，活檢標(biāo)本進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌檢測時應(yīng)盡量避免組織損失，且盡量用敏感性高的qRT-PCR法進(jìn)行檢測。

圖4 抗酸染色和qRT-PCR法檢測不同組織標(biāo)本結(jié)核分枝桿菌的陽性率

圖5 抗酸染色和qRT-PCR法檢測手術(shù)標(biāo)本和活檢標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌的一致性

圖6 抗酸染色和qRT-PCR法檢測不同組織標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌的一致性

圖7 抗酸染色檢測結(jié)核分枝桿菌與qRT-PCR法檢測結(jié)核分枝桿菌Ct值分布：A.抗酸染色和qRT-PCR均陽性病例Ct值分布；B.抗酸染色陰性和qRT-PCR陽性病例Ct值分布

本組1 218例石蠟包埋組織中，對450例肺、185例腸道、127例骨組織和109例淋巴結(jié)標(biāo)本，同時采用抗酸染色和qRT-PCR檢測結(jié)核分枝桿菌的陽性率，結(jié)果表明肺標(biāo)本結(jié)核分枝桿菌采用抗酸染色(44.4%)和qRT-PCR(63.3%)檢測的陽性率均最高，其次為淋巴結(jié)(42.2%和55.04%)、骨組織(30.7%和50.4%)，而腸道標(biāo)本為11.35%和14.59%。上述結(jié)果與結(jié)核病在不同組織的發(fā)病率一致，表明肺結(jié)核最常見。骨組織在標(biāo)本處理過程中常需要進(jìn)行脫鈣使組織軟化，以方便常規(guī)HE切片及進(jìn)行后續(xù)的分子檢測。臨床病理中常用的脫鈣液為10%硝酸，可以迅速脫鈣、作用效果強，但同時對骨組織也會產(chǎn)生較大的破壞作用，導(dǎo)致標(biāo)本DNA降解，直接影響qRT-PCR檢測結(jié)核分枝桿菌的陽性率。研究表明通過優(yōu)化脫鈣骨組織DNA的提取方法，能夠增加qRT-PCR檢測結(jié)核分枝桿菌檢測的陽性率。此外，在實際工作中研究者發(fā)現(xiàn)，根據(jù)骨組織大小，嚴(yán)格控制脫鈣時間或更換脫鈣效果較溫和的脫鈣液，也能有效降低骨組織脫鈣導(dǎo)致DNA降解。

本實驗中抗酸染色和qRT-PCR檢測結(jié)核分枝桿菌一致性為74.7%，其中手術(shù)標(biāo)本一致性為74.5%，活檢標(biāo)本一致性為75.0%，表明兩種方法有較高的吻合性。為進(jìn)一步明確兩種方法的一致性，本實驗分析了376例抗酸染色和qRT-PCR檢測均為陽性病例和248例抗酸染色陰性而qRT-PCR檢測為陽性病例的Ct值分布情況，結(jié)果表明376例抗酸染色陽性病例，qRT-PCR檢測Ct值80%分布在24～36之間；248例抗酸染色陰性病例，qRT-PCR檢測Ct值80%分布在30～40之間，與前者相比，Ct值顯著趨近于臨界值39。

在實際臨床工作中，為保證qRT-PCR檢測結(jié)核分枝桿菌結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，應(yīng)注意的是：(1)由于qRT-PCR靈敏度高，為防止污染的發(fā)生應(yīng)盡量在標(biāo)準(zhǔn)的臨床基因擴增檢驗室中進(jìn)行檢測；(2)檢測人員應(yīng)該進(jìn)行規(guī)范化培訓(xùn)，并持有臨檢中心頒發(fā)的PCR上崗證；(3)檢測儀器設(shè)備和試劑應(yīng)符合要求；(4)應(yīng)避免樣品間產(chǎn)生交叉污染，在樣本制備過程中使用完全清潔的刀片、手套，選用結(jié)核分枝桿菌明確陰性的樣本與待檢測樣本同時制備和檢測；(5)為避免假陽性的發(fā)生，檢測結(jié)果應(yīng)結(jié)合患者臨床癥狀及其他實驗室檢查結(jié)果進(jìn)行綜合判斷。

綜上所述，在石蠟包埋組織結(jié)核分枝桿菌檢測方法中，與傳統(tǒng)的抗酸染色相比，qRT-PCR檢測方法具有敏感性高、特異性強等特點，對結(jié)核病的組織學(xué)病理診斷，尤其是活檢標(biāo)本的病理診斷具有重要的應(yīng)用價值，可顯著提高結(jié)核病的檢出率。由于qRT-PCR檢測可能出現(xiàn)假陽性或假陰性，為提高結(jié)核病的病理診斷準(zhǔn)確性，應(yīng)根據(jù)病理形態(tài)學(xué)改變并結(jié)合抗酸染色結(jié)果進(jìn)行診斷。