改良亞甲基藍堿性品紅染色法顯示新型冠狀病毒肺炎肺組織中病毒包涵體

吳 昊，閻紅琳，袁靜萍

嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒-2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)感染引起的新型冠狀病毒肺炎(coronavirus disease 2019, COVID-19)在全球范圍內(nèi)持續(xù)蔓延。根據(jù)血清型和基因組特點，冠狀病毒亞科被分為α、β、γ和δ四個屬，SARS-CoV-2是一種屬于β屬的新型冠狀病毒[1]。在某些病毒感染的細胞內(nèi)，用普通光鏡可看到大小和數(shù)量都不同的圓形或不規(guī)則小體，稱為病毒包涵體，可用特殊的病毒包涵體染色法明確有無病毒感染。筆者通過查閱資料使用改良亞甲基藍堿性品紅染色法顯示COVID-19肺組織中病毒包涵體，并經(jīng)多次實驗發(fā)現(xiàn)染色過程中對分化程度的掌握至關(guān)重要，現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 臨床資料在未充分認識SARS-CoV-2病毒感染的疫情早期，有2例患者在武漢大學人民醫(yī)院接受了肺葉切除術(shù)，2例患者均在術(shù)后第1天顯示淋巴細胞降低，其中1例患者有輕微咳嗽。2例患者流感病毒及其他病毒(乙肝梅丙艾)檢測均呈陰性，分別于術(shù)后第4天和第6天經(jīng)核酸檢測確診為COVID-19?；仡櫺苑治龌颊咝g(shù)前CT示磨玻璃影的病毒性肺炎改變，推測2例患者在術(shù)前已感染SARS-CoV-2。因此收集2例患者剩余手術(shù)標本，全部取材，經(jīng)10%中性緩沖福爾馬林固定，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、3 μm厚切片。石蠟組織切片SARS-CoV-2原位雜交檢測為陽性，進一步證實患者術(shù)前已感染SARS-CoV-2[2]。本實驗經(jīng)武漢大學人民醫(yī)院倫理委員會批準(WDRY2020-K005)。

1.2 方法采用改良亞甲基藍堿性品紅染色法標記病毒包涵體：(1)選取同一組織蠟塊切片3張脫蠟至水；(2)在0.25%堿性品紅中染色25 min；(3)水洗；(4)根據(jù)檸檬酸分化時間長短分為A、B、C三組。A組切片經(jīng)0.5%檸檬酸分化4～6 min至切片無紅色殘留，B組切片經(jīng)0.5%檸檬酸分化1.5～2.5 min至切片呈淺粉紅色，C組切片經(jīng)0.5%檸檬酸分化20～30 s至切片呈淺紅色；(5)水洗；(6)分別用0.5%亞甲基藍復(fù)染10 s；(7)水洗；(8)風干切片；(9)中性樹膠封固。

2 結(jié)果

A組切片全片皆為藍色背景，無紅色或紫紅色陽性信號，不利于觀察病毒包涵體(圖1)；B組切片可見病毒包涵體位于細胞質(zhì)里，呈紫紅色，嗜酸性，周圍有空暈，其他背景為藍色，紅細胞或黏液的非特異性染色較少(圖2)；C組切片藍色背景下見大片紅細胞及纖維蛋白滲出物呈紅色非特異性染色，偶見細胞中類似于病毒性包涵體的染色，但與周圍紅細胞染色類似，不能區(qū)分是病毒包涵體還是紅細胞(圖3)。

①②③圖1 切片經(jīng)0.5%檸檬酸分化4～6min 圖2 切片經(jīng)0.5%檸檬酸分化1.5～2.5min(紅箭頭示病毒包涵體) 圖3 切片經(jīng)0.5%檸檬酸分化20～30s(黑箭頭示紅細胞,紅箭頭示類似于紅細胞也類似于病毒包涵體)

3 討論

病毒顆粒較小，直徑10～30 nm，在電鏡下才能觀察，若想從病理技術(shù)角度較準確的鑒定它，可在其侵入宿主細胞形成病毒包涵體后，應(yīng)用多種特殊染色方法顯示和確定。常用的病毒包涵體特殊染色方法：Mann亞甲藍伊紅染色法、改良亞甲基藍堿性品紅染色法、Lendrum玫瑰紅酒石酸染色法。比較三種特殊染色方法，改良亞甲基藍堿性品紅染色法比其他兩種染色方法耗時短(<1 h)，分化過程易掌握，包涵體清晰可見，層次分明，應(yīng)用較廣泛[3]。

傳統(tǒng)亞甲基藍堿性品紅染色法主要步驟：在梯度乙醇和蒸餾水中脫蠟和水化；0.25%堿性品紅染色30 min；0.5%檸檬酸分化3 s；自來水沖洗2 min；用1%甲基藍復(fù)染15～30 s；自來水沖洗；脫水，透明，封固。但在實際過程中由于標本不同，各實驗室條件存在差異，本實驗對以上步驟各環(huán)節(jié)均進行了摸索，探索出一種適合本科室的實驗步驟。

首先，用改良亞甲基藍堿性品紅染色法顯示COVID-19肺組織中病毒包涵體，嚴格控制分化程度。分化時間過久，細胞核、細胞質(zhì)及纖維結(jié)締組織等均呈無色，病毒包涵體的著色也被分化掉，亞甲基藍復(fù)染后全部顯示為藍色，不利于病毒包涵體的顯色；分化時間過短，細胞核、細胞質(zhì)及纖維蛋白滲出物等均呈紅色，亞甲基藍復(fù)染后紅細胞及纖維蛋白滲出物仍顯示紅色，造成染色層次不分明，同樣不利于病毒包涵體的顯色。筆者經(jīng)反復(fù)實驗總結(jié)，將在光鏡下對分化的微觀控制轉(zhuǎn)化為宏觀的切片在白色襯底下的顏色控制(紅→淺紅→淺粉→無色)，并考慮了組織大小等因素，從而記錄了各種分化程度所需要的時間：切片從紅色到淺紅色分化時間為20～30 s；切片從淺紅到淺粉的分化時間為1.5～2.5 min；切片從淺粉到無色的分化時間為4～6 min，因此本文根據(jù)以上經(jīng)驗將檸檬酸分化時間長短分為A、B、C三組：A組分化4～6 min，切片無紅色殘留；B組分化1.5～2.5 min，切片呈淺粉紅色；C組分化20～30 s，切片呈淺紅色，并觀測到分化1.5～2.5 min的效果更好，既有陽性結(jié)果，又減少了紅細胞及黏液的非特異性染色。

其次，實驗初查閱文獻發(fā)現(xiàn)該特殊染色方法顯示病毒包涵體多用甲基藍復(fù)染，但由于當時武漢市緊張的抗疫大環(huán)境，本科室暫時無法購買甲基藍試劑，決定使用亞甲基藍復(fù)染，經(jīng)多次實驗觀察，也可得到較好的對比效果，不影響實驗結(jié)果。

再次，染色結(jié)束后考慮到后續(xù)脫水透明步驟可能有脫色作用，因此省去了切片后續(xù)的脫水透明步驟。通過此次實驗，筆者發(fā)現(xiàn)完全依據(jù)參考文獻的操作步驟，并不能得到較理想的實驗結(jié)果，應(yīng)結(jié)合本實驗室條件(如組織標本的固定脫水等流程、實驗室擁有的試劑藥品、實驗室溫度、濕度等)，在已查閱的染色理論指導(dǎo)下，應(yīng)用控制變量等實驗方法，反復(fù)摸索出適合本實驗室的標準染色流程。本科室總結(jié)得出，用改良亞甲基藍堿性品紅染色法顯示病毒包涵體的實驗步驟：3 μm厚切片脫蠟至水，0.25%堿性品紅染色25 min，水洗，切片經(jīng)0.5%檸檬酸分化1.5～2.5 min，切片呈淺粉紅色，水洗，1%亞甲基藍復(fù)染10 s，水洗，風干中性樹膠封固。

綜上所述，本實驗使用改良亞甲基藍堿性品紅染色法可以較好地顯示病毒包涵體，有利于病理工作者從病理技術(shù)的角度證實COVID-19肺組織中病毒的存在，為臨床治療和診斷提供有力支持。