侵襲性纖維瘤病中CTNNB1基因突變與復(fù)發(fā)的相關(guān)性

陳修文，羅森源，湯顯斌，王鐵延，王 莉，黃育剛

侵襲性纖維瘤病又名韌帶樣型纖維瘤病或韌帶樣瘤，是一種發(fā)生于筋膜、肌腱膜或深部軟組織的纖維性腫瘤，由纖維母細(xì)胞和肌纖維母細(xì)胞過度增生形成。目前認(rèn)為該病為中間性腫瘤，由于腫瘤周圍界限不清，常向周圍鄰近組織浸潤性生長，不易切除干凈，極易復(fù)發(fā)[1]。已有文獻(xiàn)報(bào)道[2]，β-catenin蛋白核陽性和CTNNB1基因突變可用于侵襲性纖維瘤病與其它梭形細(xì)胞病變的輔助鑒別診斷，而兩者與侵襲性纖維瘤病局部復(fù)發(fā)的關(guān)系在國內(nèi)少見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)收集32例CTNNB1突變陽性侵襲性纖維瘤病，分析β-catenin蛋白表達(dá)和CTNNB1分子病理改變情況，探討其與侵襲性纖維瘤病局部復(fù)發(fā)的聯(lián)系，為臨床評估該疾病復(fù)發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料收集2010年～2019年十堰市太和醫(yī)院病理科確診的侵襲性纖維瘤病32例，其中復(fù)發(fā)病例只納入第1次術(shù)后樣本。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)病灶組織病理學(xué)證實(shí)為相應(yīng)的病理類型；(2)所有病例均進(jìn)行CTNNB1基因突變檢測證實(shí)為突變陽性；(3)無其他惡性腫瘤病史。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)只有細(xì)胞病理學(xué)(如穿刺細(xì)胞學(xué))診斷依據(jù)；(2)臨床資料不全。所用樣本均有至少1名高年資病理醫(yī)師復(fù)片，同時記錄臨床相關(guān)信息，包括發(fā)病年齡、性別、腫瘤大小、原發(fā)腫瘤部位等，并對所有病例進(jìn)行隨訪，記錄復(fù)發(fā)情況。

1.2 免疫組化及結(jié)果判讀所有樣本均經(jīng)10%中性緩沖福爾馬林固定、常規(guī)脫水、石蠟包埋、3 μm厚切片，HE染色，顯微鏡下觀察。免疫組化染色采用EnVision兩步法。抗原修復(fù)方法為Ttrs-EDTA (pH 9.0)高壓蒸汽修復(fù)。所用一抗為鼠抗人β-catenin單克隆抗體(UMA4B5，北京中杉金橋公司)，以PBS代替一抗作為陰性對照。結(jié)果判讀參照文獻(xiàn)[3]，β-catenin以細(xì)胞核著色判為陽性，同時陽性細(xì)胞數(shù)比例>10%判讀為陽性。

1.3 CTNNB1基因突變檢測采用FFPE組織DNA提取試劑盒(天根生化北京公司，DP331-02)提取組織樣本DNA。選取腫瘤組織>30%，腫瘤細(xì)胞含量>200個的蠟塊，5 μm厚連續(xù)切片10張，放入滅菌EP管中，二甲苯脫蠟后嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。使用VeritiTM DX PCR儀擴(kuò)增CTNNB1基因3號外顯子目的片段，引物由生工生物上海公司合成，上游引物序列5′-TCCAATCTACTAATGCTAATACT GTTTCGTA-3′，下游引物5′-GCAAAAAGTTTTCCTGTTATC CA-3′，長度為308 bp。PCR反應(yīng)體系為2×Reaction Mix 12.5 μL，上下游引物(10 μM)各1 μL，Golden DNA Polymerase 0.2 μL，DNA模板2 μL，RNase-free Water 8.3 μL，總體系25 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共40個循環(huán)；最終72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物交由生工生物(上海)公司武漢測序部進(jìn)行測序，測序結(jié)果與基因組DNA序列進(jìn)行比對，參考序列為NM_001904.3。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對分類資料比較采用χ2檢驗(yàn)或精確Fisher概率法；采用局部無復(fù)發(fā)生存率(local recurrence free survival, LRFS)評估復(fù)發(fā)狀態(tài)，其中生存資料起點(diǎn)為手術(shù)日期，終點(diǎn)為術(shù)后腫瘤第1次復(fù)發(fā)時間，生存分析描述采用Kaplan-Meier法，組間比較采用Log-rank檢驗(yàn)，生存曲線繪制采用Graphpad prism。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征32例侵襲性纖維瘤病中男性6例，女性26例，男女比為1 ∶4.3。年齡4～65歲，平均34歲，中位年齡32歲。腫瘤發(fā)生部位：腹壁者12例，皆為女性，其中4例有明確剖宮產(chǎn)史，1例有闌尾炎手術(shù)史；腹腔內(nèi)及腸系膜者5例，其中男性3例，女性2例，1例有多發(fā)子宮肌瘤病史；腹壁外者15例，其中男性3例，女性12例。腫瘤最大徑1.5～15 cm，平均7.5 cm，中位數(shù)7.5 cm。隨訪截至2020年4月20日，隨訪時間6～93個月，中位隨訪時間29個月，平均42個月，其中6例失訪，未失訪病例中未出現(xiàn)患者死亡，其中復(fù)發(fā)10例，復(fù)發(fā)時間在術(shù)后6～44個月。

2.2 病理檢查眼觀：腫瘤切面多為灰白色，實(shí)性質(zhì)韌，與周圍界限不清(圖1)。鏡檢：可見梭形細(xì)胞條束狀增生，由纖維母細(xì)胞和肌纖維母細(xì)胞組成(圖2)，部分細(xì)胞排列也可呈波浪狀(圖3)，病灶周圍可見梭形肌纖維母細(xì)胞向周圍肌肉組織穿插，可見多核肌巨細(xì)胞(圖4)。免疫表型：32例侵襲性纖維瘤病中β-catenin核陽性病例占84.4%，多伴有胞質(zhì)陽性(圖5)，部分病例未出現(xiàn)核表達(dá)(圖6)。

2.3 分子檢測結(jié)果32例CTNNB1突變陽性侵襲性纖維瘤病中，T41A 21例(圖7)，S45F 4例(圖8)，S45P 4例(圖9)，S33P 1例(圖10)，S33T合并G34R 1例(圖11)，A39_G48del 1例(圖12)。不同CTNNB1突變位點(diǎn)與β-catenin蛋白表達(dá)無明顯相關(guān)性(P>0.05，表1)。同時發(fā)現(xiàn)5例β-catenin陰性但CTNNB1基因突變陽性病例，其中3例T41A、1例S45P、1例S45F皆存在不同程度胞質(zhì)陽性，1例出現(xiàn)胞核陽性，但比例<10%。

2.5 預(yù)后分析Kaplan-Meier結(jié)果顯示，不同CTNNB1突變類型之間LRFS差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖13)，而不同年齡、腫瘤最大徑、腫瘤原發(fā)部位、β-catenin蛋白表達(dá)水平中LRFS差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 侵襲性纖維瘤病中β-catenin蛋白表達(dá)與CTNNB1基因突變情況

2.4 CTNNB1基因突變與侵襲性纖維瘤病臨床病理特征的關(guān)系在侵襲性纖維瘤病中，不同CTNNB1基因突變類型中患者年齡、性別、發(fā)病部位、腫瘤大小差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05，表2)。

表2 CTNNB1基因突變與侵襲性纖維瘤病臨床病理特征的關(guān)系

臨床病理參數(shù)nCTNNB1基因突變T41S45其它突變類型P值性別 男63210.477 女261862年齡(歲) ≤352011720.198 >35121011部位 腹壁12651 腹壁外1510320.416 腹腔內(nèi)及腸系膜5500腫瘤直徑(cm) ≤583410.110 >5241842

①②③④⑤⑥

圖7 侵襲性纖維瘤病中CTNNB1基因T41A突變

圖8 侵襲性纖維瘤病中CTNNB1基因S45F突變

圖9 侵襲性纖維瘤病中CTNNB1基因S45P突變

圖10 侵襲性纖維瘤病中CTNNB1基因S33P突變

圖11 侵襲性纖維瘤病中CTNNB1基因S33T合并G34R突變

圖12 侵襲性纖維瘤病中CTNNB1基因A39_G48del突變

3 討論

侵襲性纖維瘤病是一種發(fā)生于深部軟組織，以纖維母細(xì)胞和肌纖維母細(xì)胞增生為主的疾病，伴有Wnt信號通路異常激活[1]。β-catenin作為經(jīng)典Wnt信號通路的關(guān)鍵因子之一，已有文獻(xiàn)報(bào)道侵襲性纖維瘤病中存在β-catenin核高表達(dá)，同時該現(xiàn)象有助于侵襲性纖維瘤病的診斷和鑒別診斷[4]。但其它研究[5-6]發(fā)現(xiàn)β-catenin也可在其它腫瘤，如孤立性纖維性腫瘤、皮膚隆突性纖維肉瘤、子宮內(nèi)膜間質(zhì)肉瘤和滑膜肉瘤中出現(xiàn)一定程度核表達(dá)，尤其是需要鑒別診斷的梭形細(xì)胞腫瘤(如胃腸道間質(zhì)瘤，低級別肌纖維母細(xì)胞肉瘤等)。因此，β-catenin核表達(dá)對于侵襲性纖維瘤病輔助診斷缺乏特異性，僅作為支持性依據(jù)。目前針對β-catenin免疫組化判讀缺乏公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)，多數(shù)文獻(xiàn)以>10%的腫瘤細(xì)胞核著色判讀為陽性[3,7]，同時采用該標(biāo)準(zhǔn)判讀β-catenin的陽性率69.5%～91.7%。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)84.4%的侵襲性纖維瘤病中存在β-catenin核陽性，同時部分病例伴有胞質(zhì)著色，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

圖13 不同CTNNB1突變位點(diǎn)的LRFS曲線

針對β-catenin免疫組化在侵襲性纖維瘤病輔助診斷中的缺點(diǎn)，Le Guellec等[2]針對254例侵襲性纖維瘤病和175例形態(tài)學(xué)上易與侵襲性纖維瘤病相混淆的梭形細(xì)胞病變，進(jìn)行CTNNB1基因突變檢測，發(fā)現(xiàn)88%的侵襲性纖維瘤病中存在CTNNB1基因突變，而其它梭形細(xì)胞病變中未發(fā)現(xiàn)該基因exon3改變。相較于傳統(tǒng)的β-catenin免疫組化檢測，CTNNB1基因突變檢測具有更好的特異性，結(jié)果判讀更為準(zhǔn)確和客觀。侵襲性纖維瘤病中CTNNB1基因突變類型以T41A最常見，其次為S45F、S45P，同時存在少量罕見突變類型，如T41I、G34A、S37A、S33T+G34A、S45C、D32G等[3,7]。本實(shí)驗(yàn)選取CTNNB1突變陽性病例，發(fā)現(xiàn)其突變類型的分布與文獻(xiàn)報(bào)道一致，同時伴有S33P、S33T、A39_G48del等少見突變類型。近年有學(xué)者研究侵襲性纖維瘤病中β-catenin免疫組化檢測與CTNNB1基因突變的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)不同免疫組化評判標(biāo)準(zhǔn)對兩者的一致性影響較大，當(dāng)免疫組化以低強(qiáng)度染色(核陽性>1%或10%)為標(biāo)準(zhǔn)時，兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[7-8]。采用本實(shí)驗(yàn)判讀標(biāo)準(zhǔn)，不同基因突變類型中β-catenin免疫組化表達(dá)無明顯差異，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。同時本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，部分病例CTNNB1突變陽性，而β-catenin免疫組化陰性，該部分病例都出現(xiàn)不同程度胞質(zhì)陽性，考慮這部分病例雖然出現(xiàn)CTNNB1基因突變，致使β-catenin蛋白結(jié)構(gòu)異常，與降解復(fù)合物解離，在細(xì)胞質(zhì)中異常累積，但未累積到一定水平，導(dǎo)致并未出現(xiàn)明顯轉(zhuǎn)位入核的現(xiàn)象。

侵襲性纖維瘤病中不同CTNNB1基因突變分型與臨床病理特征的關(guān)系尚存在爭議。部分文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)S45作為一種獨(dú)立的突變類型，更容易發(fā)生在患者腹壁外部位，尤其是四肢末端[2,9]。Colombo等[10]認(rèn)為S45突變類型更容易發(fā)生在腫瘤直徑較大的病例中。而van Broekhoven等[11]認(rèn)為S45與腫瘤大小和發(fā)病部位無明確相關(guān)性。近期Koike等[7]對104例侵襲性纖維瘤病研究發(fā)現(xiàn)，不同CTNNB1基因分型與患者年齡、性別、腫瘤大小、發(fā)病部位無明顯相關(guān)性。本組未發(fā)現(xiàn)不同CTNNB1基因突變類型與臨床病理特征存在相關(guān)性，與部分文獻(xiàn)報(bào)道一致，考慮可能是由于納入S45突變類型的樣本量較低所致。

侵襲性纖維瘤病通常與周圍組織界限不清，常浸潤至鄰近軟組織，臨床上切除不凈極易復(fù)發(fā)，因此針對侵襲性纖維瘤病腫瘤局部復(fù)發(fā)的研究具有重要臨床價值。有學(xué)者認(rèn)為CTNNB1基因突變型，尤其是S45F突變類型與侵襲性纖維瘤病患者復(fù)發(fā)密切相關(guān)[10-11]，同時仍有部分學(xué)者持相反觀點(diǎn)[12]。對于罕見突變類型位點(diǎn)如S33、G34等，與侵襲性纖維瘤病復(fù)發(fā)的關(guān)系卻少見報(bào)道。本組發(fā)現(xiàn)不同CTNNB1突變位點(diǎn)之間LRFS存在差異，可能是由于不同位點(diǎn)突變對β-catenin激活程度不一致所致，而β-catenin異常激活聚集又可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[13]。相關(guān)基礎(chǔ)研究也發(fā)現(xiàn)存在S45F突變類型的侵襲性纖維瘤病細(xì)胞系更容易出現(xiàn)β-catenin細(xì)胞核聚集現(xiàn)象[14]。Rebouissou等[15]針對肝細(xì)胞腺瘤(hepatocellular adenomas, HCA)和肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的研究發(fā)現(xiàn)，在HCA/HCC中exon3缺失突變和D32-S37點(diǎn)突變導(dǎo)致β-catenin高強(qiáng)度激活，T41位點(diǎn)突變導(dǎo)致β-catenin中等強(qiáng)度激活，雖然S45導(dǎo)致β-catenin較弱的激活，但由于其等位基因的復(fù)制，導(dǎo)致β-catenin強(qiáng)表達(dá)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示侵襲性纖維瘤病中存在β-catenin蛋白異常表達(dá)和CTNNB1基因突變等分子病理事件，同時CTNNB1基因突變位點(diǎn)可能是影響局部腫瘤復(fù)發(fā)的因素。但考慮本組納入CTNNB1基因突變的樣本量較少，計(jì)劃后續(xù)進(jìn)一步加大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證。