子宮內(nèi)膜透明細(xì)胞癌分子分型臨床應(yīng)用及其與PD-L1表達(dá)的關(guān)系

湯永峰，張 珦，周鶴鳴，鄭燕影，李 惠

子宮內(nèi)膜癌是女性高發(fā)的惡性腫瘤，發(fā)病率逐年增高[1-2]。子宮內(nèi)膜癌根據(jù)有無(wú)激素依賴分為兩型：Ⅰ型包括子宮內(nèi)膜樣癌和黏液癌，約占子宮內(nèi)膜癌的85%；Ⅱ型包括高級(jí)別漿液性癌(占3%～10%)和透明細(xì)胞癌(<2%)等。組織學(xué)分型并不能很好地反應(yīng)子宮內(nèi)膜癌的生物學(xué)行為和預(yù)后，需要新的分型分層標(biāo)準(zhǔn)。2013年美國(guó)癌癥基因組圖譜(TCGA)項(xiàng)目將子宮內(nèi)膜癌分為四種分子亞型：POLE超突變型、微衛(wèi)星不穩(wěn)定高突變型(microsatellite instability hypermutated, MSI-H)、高拷貝數(shù)型(copy number-high, CN-H)和低拷貝數(shù)型(copy number-low, CN-L)。目前關(guān)于子宮內(nèi)膜癌分子分型在臨床應(yīng)用的研究越來(lái)越多[3-6]，由于子宮內(nèi)膜透明細(xì)胞癌(endometrial clear cell carcinoma, ECCC)病例數(shù)較少[7]，其分子分型在臨床上的應(yīng)用國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)報(bào)道。腫瘤免疫治療是近年研究熱點(diǎn)，以抗PD-1/PD-L1為代表的免疫治療在MSI-H/錯(cuò)配修復(fù)缺陷(mismatch repair-deficiency, MMR-D)及高濃度腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(tumor infiltrating lymphocyte, TIL)的腫瘤中顯示較好的療效。研究顯示：高達(dá)29%的ECCC患者為MSI，使免疫治療成為ECCC潛在的治療選擇[8]。本文旨在探討ECCC分子分型的臨床應(yīng)用及其與PD-L1表達(dá)的關(guān)系，為ECCC的免疫治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料收集2012年1月～2019年12月南京市婦幼保健院病理科存檔的15例ECCC手術(shù)標(biāo)本，所有病例均經(jīng)2位高年資?？撇±磲t(yī)師確診?；颊吣挲g37～78歲，中位年齡60歲。其中5例有子宮頸浸潤(rùn)，4例淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移。

1.2 方法

1.2.1免疫組化 所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)包埋、3 μm厚切片，采用免疫組化EnVision兩步法檢測(cè)p53、MLH1、MSH2、MSH6、PMS2和PD-L1(22C3)蛋白表達(dá)，PD-L1(22C3)抗體購(gòu)自丹麥DAKO公司，其余抗體均購(gòu)自福州邁新公司。用PBS作為陰性對(duì)照。MLH1、MSH2、MSH6和PMS2陽(yáng)性染色定位于細(xì)胞核，在陽(yáng)性內(nèi)對(duì)照(如腫瘤間質(zhì)淋巴細(xì)胞)表達(dá)正常的情況下所有腫瘤細(xì)胞染色陰性判讀為MMR-D，否則為錯(cuò)配修復(fù)完整(mismatch repair-proficiency, MMR-P)。p53判讀標(biāo)準(zhǔn)：大于70%的腫瘤細(xì)胞中有強(qiáng)的細(xì)胞核染色或腫瘤細(xì)胞染色完全陰性為p53突變型，否則為野生型。PD-L1染色結(jié)果采用CPS評(píng)分：即PD-L1染色細(xì)胞(包括腫瘤細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞)數(shù)與樣本中所有活腫瘤細(xì)胞數(shù)的比值，乘以100。陽(yáng)性定義為CPS評(píng)分≥10。

1.2.2POLE基因突變檢測(cè) 常規(guī)提取、純化DNA后，將提取的DNA送至北京擎科生物公司進(jìn)行Sanger測(cè)序：設(shè)計(jì)合成引物，PCR擴(kuò)增后用ABI-3730xl測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序，Data collection軟件自動(dòng)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。DNA sequencing analysis 5.1軟件分析獲取測(cè)序電泳圖和序列。將樣本序列與Genebank標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)，觀察序列有無(wú)突變。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；應(yīng)用Fisher確切概率法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ECCC中POLE突變情況按照分子篩查流程(圖1)，首先進(jìn)行POLE基因測(cè)序。本組15例ECCC標(biāo)本均行POLE基因突變熱點(diǎn)第9外顯子P286R和第13外顯子V411L點(diǎn)突變測(cè)序分析，均未發(fā)現(xiàn)病理性突變。

圖1 ECCC分子分型篩查流程

2.2 ECCC中MMR、p53蛋白表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系15例ECCC中有5例(33.3%)MMR蛋白表達(dá)缺失，其中3例MLH1和PMS2表達(dá)共同缺失，缺失率為20.0%(3/15)(圖2～7)；1例MSH2和MSH6表達(dá)共同缺失，缺失率為6.7%(1/15)；1例發(fā)生4種蛋白共同缺失。15例ECCC中p53突變8例(圖8)，p53野生7例。8例p53突變中有3例MMR-D，7例p53野生中有2例MMR-D(表1)。MLH1、PMS2、MSH2、MSH6、p53蛋白表達(dá)與患者腫瘤大小、年齡、浸潤(rùn)深度、子宮頸浸潤(rùn)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)(P>0.05，表2)。

表1 MMR蛋白表達(dá)缺失和p53蛋白突變狀態(tài)

表2 ECCC中MMR蛋白表達(dá)缺失、p53突變與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 不同分子分型ECCC中PD-L1的表達(dá)15例ECCC中，10例PD-L1 CPS評(píng)分≥10(圖9)，陽(yáng)性率為66.7%(10/15)。與PD-L1陽(yáng)性組相比，陰性組具有更深的肌層浸潤(rùn)(P=0.046)、更高的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率(P=0.004)，與患者年齡、腫瘤大小、有無(wú)子宮頸浸潤(rùn)無(wú)關(guān)(P>0.05)。5例PD-L1陰性者均為MMR-P，10例MMR-P中PD-L1陽(yáng)性率為50.0%(5/10)，而5例MMR-D中PD-L1陽(yáng)性率為100.0%(5/5)。結(jié)果顯示MMR-D者PD-L1陽(yáng)性比例更高，但由于病例數(shù)太少，PD-L1表達(dá)在MMR-D、MMR-P之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.084)。PD-L1表達(dá)在p53突變和野生之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.427，表3)。

表3 MMR-D、p53突變與PD-L1表達(dá)的關(guān)系

3 討論

ECCC發(fā)病率低，臨床罕見(jiàn)，侵襲力強(qiáng)，目前尚無(wú)針對(duì)性的治療指南，預(yù)后生存數(shù)據(jù)差異較大，多數(shù)報(bào)道5年生存率不足50%。鏡下腫瘤細(xì)胞可呈立方、扁平或鞋釘樣，胞質(zhì)透明或嗜酸性，乳頭狀、管囊狀或?qū)嵭陨L(zhǎng)方式是透明細(xì)胞癌的組織學(xué)特點(diǎn)。免疫組化標(biāo)記ER、PR通常陰性或弱陽(yáng)性，HNF-1β和Napsin A常陽(yáng)性；以往將其歸類為Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌。近年研究發(fā)現(xiàn)，ECCC也有與Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌相似的免疫表型及基因特征，如PTEN基因突變、MMR基因表達(dá)缺陷、ARID1A表達(dá)缺失、PIK3CA變異等[9]。DeLair等[10]對(duì)32例ECCC進(jìn)行免疫組化檢測(cè)及300個(gè)癌癥相關(guān)的基因測(cè)序，結(jié)果顯示11例p53異常表達(dá)、7例ARID1A表達(dá)缺失和6例MMR蛋白表達(dá)缺失。因此，尋找新的分型分層標(biāo)準(zhǔn)，更好的反應(yīng)ECCC的生物學(xué)行為和預(yù)后，以及尋找新的治療方法，成為近年的研究熱點(diǎn)。

②③④⑤⑥⑦⑧⑨

通過(guò)TCGA對(duì)373例子宮內(nèi)膜癌(307例子宮內(nèi)膜樣癌和66例漿液性癌)的全基因組及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，結(jié)合MSI檢測(cè)結(jié)果和拷貝數(shù)分析，將子宮內(nèi)膜癌分為POLE超突變、MSI-H、CN-H和CN-L四種亞型。POLE超突變是參與核DNA復(fù)制和修復(fù)的DNA聚合酶epsilon催化亞基的熱點(diǎn)突變，發(fā)生在約10%的子宮內(nèi)膜樣癌中；MSI-H型與子宮內(nèi)膜癌MMR基因改變有關(guān)；CN-H型主要包括漿液性癌，其特征是拷貝數(shù)變異大、TP53基因頻繁突變及ER、PR表達(dá)低，該亞型具有與乳腺基底樣癌和卵巢漿液性癌相同的特征；CN-L型突變率低，其中包括大多數(shù)子宮內(nèi)膜樣癌，并經(jīng)常與PTEN、CTNNB1、PIK3CA、ARID1A和KRAS突變相關(guān)。TCGA分子分型已應(yīng)用于子宮內(nèi)膜樣癌、漿液性癌和混合性癌。研究顯示：不同分子分型的子宮內(nèi)膜癌患者生存差異顯著[3]，POLE超突變型預(yù)后最好，與POLE超突變型和MSI-H型相比，CN-H型和CN-L型的患者顯示出更高的轉(zhuǎn)移率和更低的5年無(wú)復(fù)發(fā)生存率。因此，有POLE突變的患者可能不需要術(shù)后輔助化療，而CN-H型患者幾乎均需要輔助化療。

子宮內(nèi)膜癌TCGA分子分型程序復(fù)雜、費(fèi)用貴，目前在日常工作中未得到廣泛應(yīng)用。TCGA數(shù)據(jù)表明，TP53基因突變分析是區(qū)分CN-H型和CN-L型腫瘤的靈敏且特異的方法。研究者將p53免疫組化與TP53基因突變分析和熒光原位雜交進(jìn)行拷貝數(shù)分析比較，發(fā)現(xiàn)在鑒定拷貝數(shù)方面是等效的。因此，有兩項(xiàng)研究[3,11]對(duì)TCGA分子分型方法進(jìn)行改進(jìn)，使用了更簡(jiǎn)化、更適合臨床的替代方法，并驗(yàn)證了此方法在臨床應(yīng)用上的可行性。其中，Parra-Herran等[11]提出的替代方案是先用POLE基因測(cè)序篩選出POLE超突變型，再用MMR蛋白免疫組化篩選出MMR-D，最后用p53免疫組化區(qū)分p53突變型和p53野生型。Talhouk等[3]則提出ProMisE方案：先用MMR蛋白免疫組化篩選出MMR-D，MMR蛋白表達(dá)正常者再進(jìn)行POLE基因測(cè)序，最后POLE野生型用p53免疫組化區(qū)分p53突變型和p53野生型。由于ProMisE方案容易將同時(shí)伴有MMR-D或p53突變型的POLE超突變型錯(cuò)誤歸類為MMR-D或p53突變型，故本實(shí)驗(yàn)采用先檢測(cè)POLE基因突變的方案。

TCGA中關(guān)于子宮內(nèi)膜癌的數(shù)據(jù)顯示POLE超突變型占7%、MSI-H型占28%、CN-H型占26%、CN-L型占39%，但其中不包括ECCC。那么ECCC是否適用于TCGA分子分型呢？目前國(guó)外關(guān)于ECCC的TCGA分子分型研究主要有6項(xiàng)。2015年Hoang等[12]對(duì)14例純ECCC行基因組和免疫組化分析，結(jié)果顯示0例POLE突變、0例MSI-H、4例CN-H。Stelloo等[13]對(duì)18例ECCC行p53免疫組化、MSI和POLE突變檢測(cè)，結(jié)果顯示1例POLE突變、2例MSI-H和8例CN-H。2017年Le Gallo等[14]對(duì)16例ECCC進(jìn)行腫瘤組織及對(duì)應(yīng)正常組織的全外顯子組測(cè)序，對(duì)另外47例ECCC進(jìn)行了22個(gè)基因測(cè)序及MSI檢測(cè)，結(jié)果顯示0例POLE突變、6例MSI-H和23例CN-H。DeLair等[10]對(duì)32例ECCC行免疫組化及300個(gè)癌癥相關(guān)的基因測(cè)序，結(jié)果顯示2例POLE突變、4例MSI-H、11例CN-H。2019年Baniak等[15]對(duì)37例ECCC通過(guò)組織芯片評(píng)估MMR蛋白、p53表達(dá)，通過(guò)二代測(cè)序評(píng)估POLE、TP53基因突變狀態(tài)，結(jié)果顯示22例CN-H，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)POLE熱點(diǎn)突變和MMR-D病例。Travaglino等[16]將上述5項(xiàng)研究進(jìn)行綜合分析，162例ECCC中CN-H型(42.5%)和CN-L型(40.9%)較多見(jiàn)，而MSI-H型(9.8%)和POLE超突變型(3.8%)較少見(jiàn)。由于ECCC病例數(shù)較少，本組15例標(biāo)本POLE超突變型0、MMR-D/MSI-H型33.3%、p53野生型/CN-L型33.3%、p53突變型/CN-H型33.3%。在53.3%(8/15)的病例中p53蛋白異常表達(dá)，提示其突變譜似乎更像漿液性癌。但是有3例同時(shí)表現(xiàn)為MMR-D，所以p53突變型為33.3%(5/15)；本實(shí)驗(yàn)未檢出POLE突變，可能是由于本實(shí)驗(yàn)僅進(jìn)行了P286R和V411L最常見(jiàn)的2個(gè)熱點(diǎn)突變檢測(cè)，而未進(jìn)行全外顯子測(cè)序。

晚期ECCC治療難度大、病死率高，需尋找有效的標(biāo)志物和治療方法，抗PD-1/PD-L1免疫治療成為新的希望。ECCC中PD-L1陽(yáng)性率26.5%～76%[17-18]。關(guān)于PD-L1與子宮內(nèi)膜癌預(yù)后關(guān)系的報(bào)道尚不統(tǒng)一。Jin等[19]應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)23例ECCC中PD-1和PD-L1(SP142)的表達(dá)，結(jié)果顯示PD-1/PD-L1陽(yáng)性組具有更高的FIGO分級(jí)、更深的肌層浸潤(rùn)，提示患者預(yù)后不佳，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Yamashita等[20]對(duì)149例子宮內(nèi)膜癌行PD-1/PD-L1檢測(cè)，結(jié)果顯示PD-L1陽(yáng)性患者的無(wú)進(jìn)展生存期顯著延長(zhǎng)。本組結(jié)果顯示PD-L1(22C3)陰性組具有更深的肌層浸潤(rùn)、更高的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率，與Jin等報(bào)道的不一致，是否和人群異質(zhì)性或使用不同的抗體有關(guān)需要進(jìn)一步分析。目前認(rèn)為MSI-H/MMR-D病例PD-1和PD-L1的表達(dá)更高，提示免疫檢查點(diǎn)抑制劑在MSI-H/MMR-D病例中可能更有效。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在ECCC中MMR-D組與MMR-P相比，PD-L1的表達(dá)呈更高趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，需要收集更多標(biāo)本進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)初步展示了ECCC的分子異質(zhì)性，顯示ECCC部分與子宮內(nèi)膜樣癌相似，部分與漿液性癌相似，總體突變譜似乎比子宮內(nèi)膜樣癌更像漿液性癌。由于病例數(shù)較少，需擴(kuò)大樣本對(duì)ECCC的分子機(jī)制進(jìn)行單獨(dú)的研究，以明確ECCC是否可以根據(jù)TCGA分子標(biāo)記細(xì)分為不同的子類別，以及這些類別是否具有不同的形態(tài)特征和治療選擇。