彌漫大B細胞淋巴瘤中Prdx6的表達及其預后意義

劉 謙，袁 晟，劉 勇

彌漫大B細胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL)是淋巴瘤中最常見的類型之一。據國內一項大型多中心研究顯示，DLBCL是我國人群中最常見的淋巴瘤類型，占所有淋巴瘤的33.27%[1]。氧化應激在腫瘤、炎癥、創(chuàng)傷、缺血再灌注等很多疾病狀態(tài)或病理狀態(tài)下出現(xiàn)。有研究者應用一系列氧化應激標志物和抗氧化物酶首先證實了侵襲性霍奇金淋巴瘤中存在氧化應激現(xiàn)象[2]。而過氧化物酶(peroxiredoxin, Prdx)作為一類新發(fā)現(xiàn)的抗氧化酶蛋白家族，廣泛存在于原核和真核生物中，對生物體內的活性氧具有重要清除作用[3]。Prdx6是Prdx家族中唯一屬于1-半胱氨酸(1-cysteine, 1-Cys)亞類的成員，盡管其在蛋白構成上與家族其它成員具有同源性，但在功能特點上表現(xiàn)出明顯的不同[4]。隨著研究的深入，Prdx6在腫瘤尤其是淋巴瘤的發(fā)生、發(fā)展，以及在腫瘤侵襲過程中的作用也被不斷發(fā)現(xiàn)[5-7]。因此，本實驗采用免疫組化法檢測Prdx6在DLBCL中的表達，探討其與臨床病理特征及患者預后之間的關系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集江西省人民醫(yī)院2015～2017年診斷的286例DLBCL作為研究對象，根據病史、臨床表現(xiàn)、影像學檢查、實驗室檢查等進行臨床資料分組。按照Hans分型將DLBCL分為生發(fā)中心(germinal center B-cell like, GCB)組和非生發(fā)中心(non-germinal center B-cell like, non-GCB)組。根據免疫組化BCL-2(≥50%)和C-MYC(≥40%)的表達情況，篩選出病例中的雙表達。根據DLBCL類型分為特指型和非特指型，其中特指包括原發(fā)中樞神經系統(tǒng)彌漫大B細胞淋巴瘤(primary diffuse large B-cell lymphoma of CNS, PCNSL)、原發(fā)縱隔(胸腺)大B細胞淋巴瘤[primary mediastinal (thymic) large B-cell lymphoma, PMBL]、EB病毒陽性彌漫大B細胞淋巴瘤(EBV-positive diffuse large B-cell lymphoma, EBV+DLBCL)，富于T細胞/組織細胞大B細胞淋巴瘤(T-cell/histiocyte-rich large B-cell lymphoma, THRLBCL)；以及彌漫大B細胞淋巴瘤，非特指型。同時，收集30例正常淋巴結作為對照。在有隨訪資料的124例患者中，死亡28例，隨訪時間1～57個月。

1.2 方法Prdx6兔抗人單克隆抗體(ab133348，Abcam公司，稀釋度1 ∶300)。所有組織均使用10%中性緩沖福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm厚切片，行常規(guī)HE染色和免疫組化染色。免疫組化染色采用EnVision兩步法。

1.3 判定標準Prdx6陽性定位于細胞核和細胞質。陽性結果針對腫瘤細胞染色強度進行評估：(1)弱陽性(僅在40倍物鏡下可見)；(2)中等強度陽性(在20倍物鏡下可見)；(3)強陽性(在10倍物鏡下可見)，且只有100%細胞顯示強陽性才納入強陽性組[7]。在臨床和病理資料雙盲條件下由兩名病理學專家進行閱片評分。

1.4 統(tǒng)計學分析所有數據應用IBM SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學分析。采用χ2檢驗分析Prdx6蛋白表達與臨床病理特征的關系。生存率的統(tǒng)計采用Kaplan-Meier生存分析(組間比較采用Log-rank檢驗)和Cox多因素回歸分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 DLBCL與正常淋巴結中Prdx6的表達在286例DLBCL中，Prdx6陽性196例，在30例正常淋巴結中，Prdx6陽性9例。Prdx6在DLBCL中的表達高于正常淋巴結，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=17.69，P<0.001，表1)。

表1 DLBCL及正常淋巴結中Prdx6的表達

2.2 DLBCL中Prdx6表達與臨床病理特征的關系DLBCL中Prdx6表達與患者性別、年齡(<60歲和≥60歲)、有無B癥狀、LDH水平、Hans分型、有無雙表達、腫瘤分期及組織學類型進行比較，其中Prdx6在Hans分型中的表達差異有統(tǒng)計學意義(χ2=21.771，P<0.001)；而在性別、年齡、有無B癥狀、LDH水平、有無雙表達、腫瘤分期及組織學類型的表達差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表2)。

表2 Prdx6表達與DLBCL臨床病理特征的關系

2.3 DLBCL中Prdx6表達強度與臨床病理特征的關系在286例DLBCL中，Prdx6陰性90例(圖1)；不同程度陽性196例，其中弱～中等陽性89例(圖2)，占陽性病例的45.4%，強陽性107例(圖3)，占陽性病例的54.6%。其中，Prdx6在具有B癥狀組和LDH升高組中的陽性程度差異有統(tǒng)計學意義(χ2=4.872，P=0.027；χ2=5.965，P=0.015)，而在患者性別、年齡、Hans分型、有無雙表達、腫瘤分期及組織學類型的表達差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表3)。

①②③圖1 DLBCL中Prdx6陰性,EnVision兩步法圖2 DLBCL中Prdx6弱～中等陽性,EnVision兩步法圖3 DLBCL中Prdx6強陽性,EnVision兩步法

圖4 Prdx6表達與DLBCL患者生存的關系

表4 Cox多因素回歸分析

2.4 生存分析124例有隨訪資料的DLBCL患者平均生存時間為46.3個月。按照Prdx6免疫組化表達強度劃分，陰性、弱～中等陽性和強陽性病例分別為37、43、44例。在37例Prdx6陰性病例中，PCNSL.原發(fā)中樞神經系統(tǒng)彌漫大B細胞淋巴瘤；PMBL.原發(fā)縱隔(胸腺)大B細胞淋巴瘤；EBV+DLBCL.EB病毒陽性彌漫大B細胞淋巴瘤；THRLBCL.富于T細胞/組織細胞大B細胞淋巴瘤5例因疾病死亡，32例生存；43例Prdx6弱～中等陽性病例中，8例因疾病死亡，35例生存；44例Prdx6強陽性病例中，15例因疾病死亡，29例生存。Prdx6表達與預后分析顯示，Prdx6陰性、弱～中等陽性和強陽性患者的生存差異有統(tǒng)計學意義(χ2=9.308，P=0.01)。進一步統(tǒng)計分析顯示，Prdx6強陽性組患者預后比陰性組患者的預后差(χ2=6.998，P=0.008，圖4)。Cox多因素回歸模型分析顯示，只有腫瘤分期(RR=3.412，95%CI=1.245～9.348，P=0.017，表4)是影響患者生存的危險因素。

3 討論

DLBCL作為最常見的淋巴瘤，由于其具有侵襲性生物學行為，患者預后常常較差。雖然有研究針對免疫化學治療和預后標志物篩選[8-9]，且在一定程度上能夠延長部分DLBCL患者的生存期，并為后續(xù)治療帶來新希望，但仍會出現(xiàn)部分復發(fā)難治和耐藥患者。

活性氧(reactive oxygen species, ROS)作為生物體內正常有氧代謝的產物，能在生理和病理過程中調節(jié)細胞內氧化還原反應。隨著ROS大量產生，氧化應激也隨之產生，并在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起至關重要的作用[10-11]。Prdx是一類抗氧化酶蛋白家族，在生物體內對ROS的清除具有重要作用。在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)Prdx家族有6個成員(1～6)，其同工酶可以出現(xiàn)在細胞核、細胞質、線粒體、溶酶體、內質PCNSL.原發(fā)中樞神經系統(tǒng)彌漫大B細胞淋巴瘤；PMBL.原發(fā)縱隔(胸腺)大B細胞淋巴瘤；EBV+DLBCL.EB病毒陽性彌漫大B細胞淋巴瘤；THRLBCL.富于T細胞/組織細胞大B細胞淋巴瘤；*Fisher確切概率法網和過氧化物酶體中[11]。根據Cys殘基數目的不同，使得Prdx6的功能有別于家族其它5個成員[12]。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)Prdx6在部分腫瘤的轉移和侵襲上具有一定作用，與尿激酶和受體激活途徑、谷胱甘肽過氧化物酶的增加有一定關聯(lián)[13-15]。然而，Prdx6在淋巴瘤中的生物學行為還處于未知狀態(tài)[10]。

表3 Prdx6陽性強度與DLBCL臨床病理特征的關系

本組結果顯示，Prdx6在DLBCL中的表達顯著高于正常淋巴結。近期Kari等[16]發(fā)現(xiàn)：Prdx6在正常人血清中的表達高于DLBCL，其研究中并未涉及Prdx6在正常淋巴結中的表達情況。因此，Prdx6在正常人血清中高表達與淋巴結中的低表達是否存在關系，有待更多研究加以證實。通過Hans分型將DLBCL分為GCB組和non-GCB組，統(tǒng)計結果顯示Prdx6在non-GCB組中的表達明顯高于GCB組，說明Prdx6表達可能與生發(fā)中心后來源的腫瘤細胞有關。另外，在Prdx6陽性病例中，出現(xiàn)B癥狀病例的陽性強度明顯高于無B癥狀病例，提示Prdx6表達強度可能與DLBCL所引起的全身癥狀(如發(fā)熱、盜汗、體重減輕和皮疹等)有關。LDH作為評價淋巴瘤預后的主要指標之一，對淋巴瘤的監(jiān)測和評估具有重要作用，其同工酶LDH-5升高更是被認為與非霍奇金淋巴瘤的預后和轉歸有關[17]。本實驗結果提示，在LDH升高病例中的Prdx6陽性強度高于LDH正常病例，說明LDH升高與Prdx6陽性強度有一定關系。

本實驗主要目的是評估Prdx6異常表達與DLBCL預后的相關性，從生存分析結果中發(fā)現(xiàn)Prdx6陽性程度越高，患者預后越差。在具有隨訪資料的病例中，Prdx6陰性和弱～中等陽性組的病死率分別為13.5%和18.6%，而強陽性組的病死率為34.9%，差異有統(tǒng)計學意義。Prdx6陰性和弱～中等陽性組間的生存率雖然有一定差異，但差異無統(tǒng)計學意義。另外，Kuusisto等[7]研究發(fā)現(xiàn)Prdx6在DLBCL反應性T細胞胞質中強陽性，患者預后會更好，提示可能是一種自身保護作用所致。

有研究證實，F(xiàn)as/FasL凋亡途徑是B細胞淋巴瘤發(fā)生的重要機制[18-19]，一旦Fas/FasL凋亡途徑不能正常發(fā)生，就會導致B細胞大量增殖，最終形成B細胞淋巴瘤。一些拮抗Fas/FasL凋亡途徑的分子通過抑制Caspases活性來阻斷凋亡通路[20-21]，其中Caspase-8是凋亡信號通路的啟動型Caspase，有研究已證實Prdx6是Caspase-8活性的負性調節(jié)因子[22]。那么，在DLBCL的發(fā)生過程中，Prdx6表達是否通過拮抗Fas/FasL途徑而發(fā)揮作用，將有待我們進一步研究證實。