楓香樹林揮發(fā)物和空氣負(fù)離子季節(jié)變化及對(duì)微生物數(shù)量的影響

馬玲，張靜，趙亞紅，王彬，韋賽君，呂嘉欣，高巖

（浙江農(nóng)林大學(xué)，亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300）

植物揮發(fā)性有機(jī)物（Plant volatile organic compounds，PVOCs）是通過植物體內(nèi)次生代謝途徑合成的低沸點(diǎn)、易揮發(fā)的小分子化合物，主要分為萜烯類、苯基/苯丙烷類和脂肪酸衍生物[1-2]，具有抑菌、殺菌、凈化空氣、消除疲勞等功效[3-4]。林富平等發(fā)現(xiàn)木犀Osmanthus fragra ns葉片釋放的VOCs（揮發(fā)性有機(jī)物）能降低空氣中微生物的數(shù)量[5]。Gomez-Rodriguez等發(fā)現(xiàn)萬壽菊Tagetes erect a釋放的揮發(fā)物可降低番茄枯萎病病菌Fusarium oxysporumsp.的孢子萌發(fā)率[6]。南美蟛蜞菊Wedelia trilobata釋放VOCs對(duì)水稻稻瘟病病菌Magnaporthe grisea、水稻紋枯病病菌Rhizoctonia solani和玉米紋枯病病菌的抑菌效果顯著[7]。Fadil等發(fā)現(xiàn)百里香Thymus mongolicus、迷迭香Rosmarinus officinalis和香桃木Myrtus communis精油對(duì)鼠傷寒沙門氏菌Salmnella typhimurium具有協(xié)同抑菌作用[8]。檸檬Citrus limon精油和歐洲銀冷杉Abies alba精油混合后能凈化室內(nèi)空氣質(zhì)量[9]。

空氣負(fù)離子是由植物的尖端放電和光電效應(yīng)產(chǎn)生，具有殺菌、降塵、改善情緒的作用[10]。研究發(fā)現(xiàn)氣象因子、植被類型對(duì)空氣負(fù)離子濃度影響較大。潘輝等發(fā)現(xiàn)不同林分中空氣負(fù)、正離子濃度與空氣溫度、光照強(qiáng)度之間呈負(fù)相關(guān)，與空氣濕度呈正相關(guān)[11]。對(duì)四種植被類型的空氣負(fù)離子濃度調(diào)查發(fā)現(xiàn)自然林＞經(jīng)濟(jì)林＞綠地＞農(nóng)田[12]?？諝庳?fù)離子濃度在生態(tài)環(huán)境和空氣質(zhì)量評(píng)價(jià)體系中是不可或缺的重要指標(biāo)之一。

楓香樹Liquidambar formosana屬金縷梅科Hamamelidaceae楓香樹屬Liquidambar落葉喬木。目前，對(duì)楓香樹的研究主要集中在繁育[13]、生理生化[14]、光合[15]等方面，但對(duì)楓香樹VOCs抑菌作用的研究較少。因此，本文以楓香樹為對(duì)象，研究了楓香樹單株釋放的VOCs和楓香樹林空氣VOCs成分，測(cè)定了林內(nèi)空氣負(fù)離子濃度和微生物數(shù)量，分析了不同季節(jié)楓香樹林的抑菌特性和空氣負(fù)離子效應(yīng)，以期為森林康養(yǎng)建設(shè)中的樹種選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣地

試驗(yàn)樣地設(shè)在浙江省杭州市臨安區(qū)浙江農(nóng)林大學(xué)東湖校區(qū)楓香樹林教學(xué)實(shí)習(xí)基地，地理坐標(biāo)為119°43'39＂E，30°15'25"N，海拔約39 m，林下有人工栽植的菲白竹Pleioblastus fortunei和自然生長的馬蘭Aster indicus、爵床Justicia procumbens等草本植物，平均高度在30～50 cm，地被植物總蓋度約30%，周邊無其他樹木、機(jī)動(dòng)車及其他污染源影響。屬中亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，溫暖濕潤，四季分明，雨熱同期，有梅雨季節(jié)，空氣濕潤。全年平均氣溫為16.4°C，年日照時(shí)數(shù)為1 939.0 h，1月溫度最低，日平均氣溫為5°C，極端最低溫度為－12°C；7月溫度最高，日平均氣溫為30°C，極端最高溫度為41°C，全年降水量為1 628.6 mm，年平均相對(duì)濕度在70%以上。

1.2 試驗(yàn)材料和試驗(yàn)林

楓香樹樹齡均在20 a左右，平均高約為15 m，平均胸徑約為25 cm，植株長勢(shì)良好，無病蟲害和機(jī)械損傷。楓香樹林為人工純林，土壤為紅壤，造林面積約900 m2，種植密度約為1 650株·hm-2，郁閉度0.8左右，平均枝下高約2 m，并以距林緣15 m處的無林地作對(duì)照。

1.3 VOCs采集與分析

楓香樹單株VOCs測(cè)定：于2019年5月多次選擇雨后晴朗無風(fēng)天氣的9∶00－11∶00，采用QC-2型大氣采樣儀（北京市勞動(dòng)保護(hù)科學(xué)研究所），采用動(dòng)態(tài)頂空氣體循環(huán)采集法[16]采集活體楓香樹單株的VOCs，根據(jù)樹木平均高度采用五點(diǎn)采樣法選擇5株楓香樹單株，每株作為1個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，共5次重復(fù)，采樣位置位于樹冠向陽背風(fēng)中部健康無病蟲害枝葉，采集VOCs后采摘葉片稱量。氣體循環(huán)流量為100 mL·min-1，采氣時(shí)間為1 h。

楓香樹林分VOCs測(cè)定：于2019年春季（5月）、夏季（8月）和秋季（11月）多次選擇雨后晴朗無風(fēng)天氣的9∶00－11∶00，采用開放式采樣法采集楓香樹林空氣VOCs。在距地面1.5 m處對(duì)楓香樹林空氣VOCs進(jìn)行采集，均勻的選擇5個(gè)點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)作為1次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，共5次重復(fù)。氣體循環(huán)流量為100 mL·min-1，采氣時(shí)間為1 h。

采用熱脫附-氣相色譜-質(zhì)譜（TDS-GC-MS）聯(lián)用技術(shù)分析VOCs，儀器及參數(shù)設(shè)置條件參照高群英等的方法[16]。采用NIST2008譜庫檢索，并根據(jù)已報(bào)道的植物VOCs保留時(shí)間對(duì)VOCs各組分進(jìn)行定性，然后選取特征離子進(jìn)行進(jìn)一步定量分析。楓香樹單株VOCs定量方法采用單位采樣時(shí)間內(nèi)每克植物葉片釋放出的VOCs特征離子峰峰面積進(jìn)行定量。

1.4 空氣負(fù)離子的測(cè)定

采用YZQ-308A森林康養(yǎng)檢測(cè)系統(tǒng)（翼鬃麒科技有限公司）于春季、夏季和秋季于楓香樹VOCs測(cè)定同時(shí)檢測(cè)楓香樹林和對(duì)照空氣負(fù)離子濃度，采樣高度為1.5 m，時(shí)間25 min，每5 min記錄一次數(shù)據(jù)，共5次重復(fù)（五點(diǎn)取樣法選5個(gè)點(diǎn)）。

1.5 培養(yǎng)基的配制

參照周德慶[17]的方法配置細(xì)菌培養(yǎng)基（牛肉蛋白胨培養(yǎng)基）、真菌培養(yǎng)基（馬丁氏培養(yǎng)基）、放線菌培養(yǎng)基（高氏1號(hào)培養(yǎng)基）。植物揮發(fā)性有機(jī)物單體培養(yǎng)基參照GAO Y等[18]的方法，無菌條件下，分別在檸檬烯、月桂烯、β-蒎烯、γ-萜品烯（Sigma公司生產(chǎn)）中加入兩滴吐溫，用無菌水將原液稀釋為100、200、1 000倍，分別取稀釋液1 mL加入培養(yǎng)皿中，再加入9 mL培養(yǎng)基，充分搖勻凝固后待用。

1.6 空氣微生物的采集

2019年春季（5月）、夏季（8月）和秋季（11月），多次選擇雨后晴朗無風(fēng)天氣的10:00，采用自然沉降法采集空氣微生物（細(xì)菌、真菌和放線菌），分別在楓香樹林與對(duì)照地隨機(jī)各設(shè)5個(gè)采樣點(diǎn)，每次5個(gè)重復(fù)，將帶有不同培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿分別放在距樹冠水平距離0.3 m左右，高約1.5 m的平板支架上，打開培養(yǎng)皿蓋，采集空氣中微生物，將培養(yǎng)基在空氣中暴露10 min后，蓋上培養(yǎng)皿蓋并用封口膜封好，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～96 h，細(xì)菌培養(yǎng)48 h，真菌培養(yǎng)72 h，放線菌培養(yǎng)96 h后，檢查菌落。

1.7 數(shù)據(jù)處理

按照1991年頒布的公共場(chǎng)所每立方米空氣微生物的計(jì)算公式，計(jì)算出各處理的微生物濃度[19]。

式中，N為培養(yǎng)皿中菌落的平均數(shù)（個(gè)）；A為培養(yǎng)皿的面積（cm2）；T為培養(yǎng)皿蓋打開的時(shí)間（min）。

式中，所有數(shù)據(jù)均為5次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。

利用Origin 9.0軟件（OriginLab公司，美國）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖。采用One-Way ANOVA對(duì)楓香樹林和對(duì)照分別進(jìn)行檢驗(yàn)，并進(jìn)行Tukey多重比較（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 楓香樹揮發(fā)物成分分析

楓香樹單株VOCs共鑒定出3類26種化合物（見圖1，表1）。由圖1和表1可知，VOCs以萜烯類物質(zhì)為主要成分，共23種，主要有檸檬烯（22.4%）、月桂烯（12.3%）、β-蒎烯（13.7%）、γ-萜品烯（5.7%）、石竹烯（1.2%）、花柏烯（2.0%）等，占VOCs總量的96.6%；烴類物質(zhì)僅1種為對(duì)傘花烴，占VOCs總量的1.4%；酯類物質(zhì)有2種，分別為順-3-己烯乙酸酯（1.4%）和酞酸二乙酯（0.6%），占VOCs總量的2.0%。

圖1 單株楓香樹VOCs總離子流圖Figure 1 Total ion flow diagram of VOCs from single L.formosana

表1 楓香樹葉片釋放VOCs的主要成分Table1 Main component of VOCs from single L.formosana

2.2 不同季節(jié)楓香樹林空氣VOCs成分分析

由圖2和表2知，春、夏、秋季楓香樹林空氣VOCs共有7類28種化合物，主要以萜烯類、苯類物質(zhì)為主，不同季節(jié)VOCs的種類與含量存在差異，夏季總釋放量分別是春、秋季的1.2倍、69.5倍。

圖2 不同季節(jié)楓香樹林空氣VOCs總離子流圖Figure 2 Total ion flow diagram of VOCs from L.formosana stand at different seasons

春季，共檢測(cè)出5類21種化合物，其中，萜烯類物質(zhì)有5種，主要為檸檬烯（13.3%）、β-蒎烯（9.7%）等，占VOCs總量的28.4%；苯類物質(zhì)有8種，主要為甲苯（16.5%）、乙苯（12.4%）等，占VOCs總量的44.1%；烴類物質(zhì)有5種，主要為1,3,5-環(huán)庚三烯（10.1%）、庚烷（5.7%）、1,2-二氯乙烷（3.0%）等，占VOCs總量的20.1%；酯類物質(zhì)有2種，分別為乙酸丁酯（1.0%）和鄰苯二甲酸二異丁酯（0.2%），占VOCs總量的1.2%；醇類物質(zhì)有1種，為異植物醇，占VOCs總量的6.1%。

表2 不同季節(jié)楓香樹林空氣VOCs成分Table 2 Components of VOCs from L.formosana stand at different seasons

夏季，同樣檢測(cè)到5類21種化合物，其中，萜烯類物質(zhì)有8種，主要成分為檸檬烯（16.6%）、β-蒎烯（10.6%）、月桂烯（4.6%）等，占總量的40.5%；苯類物質(zhì)有7種，以甲苯（22.6%）、乙苯（4.6%）為主要成分，占VOCs總量的35.7%；酯類有2種，分別為乙酸丁酯（2.7%）和鄰苯二甲酸二異丁酯（9.1%），占VOCs總量的11.8%；烴類物質(zhì)有3種，主要為庚烷（4.3%），占VOCs總量的6.8%；醇類物質(zhì)僅1種，為異植物醇，占VOCs總量的5.1%。

秋季，共檢測(cè)到4類6種化合物，其中，苯類物質(zhì)有3種，主要成分為甲苯（23.6%）、乙苯（6.3%）、鄰二甲苯（15.4%）等，占VOCs總量的45.2%；酸類物質(zhì)有1種，為十六烷酸，占VOCs總量的35.4%；萜烯類物質(zhì)有1種，為α-蒎烯，占VOCs總量的13.8%；酮類物質(zhì)有1種，為2-十二烷酮，占VOCs總量的5.6%。

夏季，在對(duì)照空氣中共檢測(cè)到3類12種化合物，其中苯類物質(zhì)有8種，占VOCs總量的87.4%；烴類物質(zhì)有2種，占VOCs總量的4.6%；酯類物質(zhì)有2種，占VOCs總量的8.0%。不同季節(jié)楓香樹林釋放的VOCs與對(duì)照對(duì)比，春、夏季楓香樹林內(nèi)的VOCs總釋放量分別是對(duì)照的5.1和6.1倍，秋季楓香林內(nèi)的VOCs總釋放量低于對(duì)照。

2.3 不同季節(jié)楓香樹林空氣負(fù)離子濃度變化

由圖3知，不同季節(jié)楓香樹林與對(duì)照空氣負(fù)離子濃度變化趨勢(shì)均為夏季最高，春季次之，秋季最低。夏季對(duì)照的空氣負(fù)離子濃度分別比春季和秋季增加了39.3%和55.6%，3個(gè)季節(jié)之間均差異顯著（P＜0.05）；夏季楓香樹林空氣負(fù)離子濃度分別比春季和秋季增加了41.9%和65.9%，與對(duì)照間均差異顯著（P＜0.05）；春、夏、秋季楓香樹林空氣負(fù)離子濃度分別比對(duì)照增加了61.8%、68.7%和29.5%，與對(duì)照間均差異顯著（P＜0.05）。

2.4 不同季節(jié)楓香樹林空氣微生物含量變化

由圖4知，楓香樹林內(nèi)微生物數(shù)量在不同季節(jié)有一定的動(dòng)態(tài)變化。夏季楓香樹林內(nèi)的細(xì)菌含量比春季和秋季分別降低了112.0%和166.0%，與這二個(gè)季節(jié)之間均差異顯著（P＜0.05）；春、夏、秋季林內(nèi)細(xì)菌含量與對(duì)照相比分別降低了27.9%、49.5%和18.9%，與對(duì)照之間均差異顯著（P＜0.05）。

圖3 不同季節(jié)楓香樹林空氣負(fù)離子濃度變化Figure 3 Variation of negative ion concentration in L.formo sana stand at different seasons.

圖4 不同季節(jié)楓香林空氣微生物含量Figure 4 Air microbe content in L.formosana stand at different seasons

夏季楓香樹林內(nèi)的真菌含量比春季和秋季分別降低了48.6%和132.4%，與這二個(gè)季節(jié)之間均差異顯著（P＜0.05）；春、夏季與對(duì)照相比分別降低了21.4%和38.3%，與對(duì)照之間均差異顯著（P＜0.05）。放線菌數(shù)量變化趨勢(shì)與真菌一致，春、夏季與對(duì)照相比分別降低了12.6%和16.7%，與對(duì)照間均差異顯著（P＜0.05）。

2.5 VOCs單體對(duì)空氣微生物的抑制

由圖5知，隨著單體濃度的升高，β-蒎烯、檸檬烯、月桂烯和γ-萜品烯與對(duì)照相比對(duì)細(xì)菌的抑制作用增強(qiáng)，0.1%濃度β-蒎烯和檸檬烯處理與對(duì)照相比對(duì)細(xì)菌的抑制率分別為30.0%和34.6%（P＜0.05），1%濃度月桂烯和γ-萜品烯處理與對(duì)照相比對(duì)細(xì)菌的抑制率分別為31.4%和21.2%（P＜0.05）；1%濃度月桂烯、檸檬烯、γ-萜品烯處理與對(duì)照相比對(duì)真菌抑制率分別為28.7%、35.3%和32.1%（P＜0.05），隨著濃度的升高三種萜烯類處理與對(duì)照相比對(duì)真菌的抑制作用加強(qiáng)；0.1%濃度檸檬烯、β-蒎烯、月桂烯、γ-萜品烯處理與對(duì)照相比對(duì)放線菌的生長影響不大，1%濃度時(shí)檸檬烯處理與對(duì)照相比對(duì)放線菌抑制率為27.8%（P＜0.05）。

圖5 單體對(duì)空氣微生物的抑制Figure 5 Inhibition of monomers on air microorganisms

3 討論

植物釋放VOCs的種類及含量與植物生長發(fā)育階段、體內(nèi)合成相關(guān)酶的活性和環(huán)境因子密切相關(guān)。辣薄荷Mentha pi perita幼葉期釋放的VOCs以檸檬烯為主，隨著葉片的生長發(fā)育，釋放的VOCs以薄荷酮為主[20]。光照使黃花蒿Artemisia annuaβ-蒎烯合酶的表達(dá)水平增高[21]。木犀在盛花期釋放的萜烯類種類和含量高于衰敗期[22]。高溫能促進(jìn)桉Eucalyptus camaldulensis和香蕉Musa nana葉片的單萜釋放[23-24]。迷迭香在干旱處理后其萜烯類的釋放量增加[25]。本研究中，楓香樹林空氣中的萜烯類含量主要由楓香樹的葉片釋放，春季、夏季和秋季隨著葉片生長發(fā)育階段的不同，萜烯類的種類和含量也不同，夏季成熟葉片釋放的萜烯類含量最高，秋季葉片衰老，VOCs大量減少。其原因一方面可能是受環(huán)境因素（光照、溫度、濕度）的影響，夏季光照時(shí)間變長，溫度逐漸升高，植物進(jìn)入生長旺盛期，體內(nèi)有機(jī)物合成、代謝加快，釋放VOCs的種類和含量增多[26-27]；同時(shí)，植物旺盛的光合作用為萜烯類合成提供充足的碳源和還原力，促進(jìn)萜烯類合成[28]。秋季氣溫降低、葉片衰老，葉綠素降解，花青素含量增多，葉片變紅，花青素吸收的光不能用于光合作用，合成萜烯類的碳源和能量大量減少。另一方面可能是受相關(guān)生物合成酶的影響所致[29]，異戊烯二磷酸為底物，在萜類合酶的催化下合成單萜、倍半萜和二萜等，萜類合酶的活性和數(shù)量決定了萜類化合物種類和結(jié)構(gòu)的多樣性[30]。這可能導(dǎo)致VOCs種類和釋放量多樣化。

空氣負(fù)離子濃度是衡量空氣清潔度與生態(tài)環(huán)境的重要指標(biāo)之一，由植物尖端放電和光電效應(yīng)產(chǎn)生，具有降塵、殺菌、凈化空氣的作用，其濃度受氣象因素、植被自身特性的影響[11-12]。馮燕珠等研究發(fā)現(xiàn)福州閩江公園空氣負(fù)離子濃度在秋季最高[31]。吳際友對(duì)空氣負(fù)離子濃度研究發(fā)現(xiàn)夏、秋季大于春、冬季[32]。這可能與環(huán)境因子、林分及觀測(cè)地區(qū)春、秋季的差異性有關(guān)。本研究中，春、夏、秋季楓香樹林內(nèi)的空氣負(fù)離子濃度隨著VOCs的變化呈同步變化，以夏季林內(nèi)空氣負(fù)離子濃度最高。這一方面可能是植物VOCs對(duì)空氣負(fù)離子的促進(jìn)作用，植物VOCs中萜烯類是可以揮發(fā)的中性氣體分子，當(dāng)受到碰撞（噴筒效應(yīng)）、電場(chǎng)力（路德格效應(yīng)）、輻射（光電效應(yīng)）等外力作用影響時(shí)能產(chǎn)生較多的空氣負(fù)離子[33]；另一方面可能是夏季降水增多、植物生長旺盛、光合作用強(qiáng)，太陽紫外線強(qiáng)烈等因素產(chǎn)生了較多的空氣負(fù)離子，秋季溫度降低，葉片衰老，光合作用較弱，植物逐漸進(jìn)入休眠狀態(tài)，林內(nèi)的空氣負(fù)離子濃度減少。

植物釋放的VOCs具有抵抗病原微生物入侵、生長和繁衍，減少或殺死空氣微生物的作用[6,34]。Wang Y等研究發(fā)現(xiàn)肉桂醛可以顯著減少中華獼猴桃Actinidia Chinensis在貯藏期間微生物的數(shù)量[35]。本研究中，夏季楓香樹林釋放的VOCs以萜烯類為主，林內(nèi)細(xì)菌、真菌、放線菌含量低于春季和秋季，不同季節(jié)楓香樹林內(nèi)的細(xì)菌、真菌含量均顯著低于對(duì)照。魏琦等研究發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯能抑制細(xì)菌生長[36]。高群英等研究發(fā)現(xiàn)壬醛、檸檬烯、β-蒎烯能抑制微生物生長[16]。植物釋放的VOCs對(duì)空氣中的微生物生長有抑制作用[6-7]。為了進(jìn)一步探索楓香樹釋放的VOCs中具體抑菌物質(zhì)，選擇萜烯類中含量較高的檸檬烯、β-蒎烯、月桂烯、γ-萜品烯進(jìn)行單體抑菌試驗(yàn)，結(jié)果表明4種萜烯類均對(duì)細(xì)菌生長抑制作用顯著，檸檬烯、月桂烯、γ-萜品烯對(duì)真菌生長抑制作用顯著。檸檬烯、β-蒎烯、月桂烯、γ-萜品烯可能是主要的微生物抑制劑。

4 結(jié)論

上述研究結(jié)果表明，單株楓香樹釋放的VOCs共鑒定出3類26種化合物，以萜烯類為主，春、夏、秋季楓香樹林中的空氣VOCs共有7類28種化合物，主要以萜烯類、苯類物質(zhì)為主，其中，春季共有5類21種化合物，主要有檸檬烯、β-蒎烯、甲苯等；夏季共有5類21種化合物，主要有檸檬烯、β-蒎烯、甲苯等；秋季共有4類6種化合物，主要有甲苯、鄰二甲苯、十六烷酸等。不同季節(jié)VOCs的種類與含量存在差異，夏季總釋放量是春、秋季的1.2倍、69.5倍，夏季楓香樹林內(nèi)萜烯類含量高于春季和秋季；不同季節(jié)楓香樹林中空氣負(fù)離子濃度變化趨勢(shì)為夏季最高，春季次之，秋季最低；楓香樹林內(nèi)微生物數(shù)量在不同季節(jié)有一定的動(dòng)態(tài)變化，夏季楓香樹林內(nèi)萜烯類含量最高，細(xì)菌和真菌含量顯著降低，檸檬烯、β-蒎烯、月桂烯、γ-萜品烯可能是微生物主要抑制物質(zhì)。

基于目前植物VOCs排放的物種變化和不同植物VOCs對(duì)空氣負(fù)離子及微生物抑制作用的差異來看，建議在為城市環(huán)境選擇樹種時(shí)，除了考慮樹木的適應(yīng)性、抗污染性和觀賞價(jià)值標(biāo)準(zhǔn)外，還應(yīng)考慮植物的VOCs和空氣負(fù)離子濃度。