胃癌患者CyPJ、ERp29及CSN5的表達(dá)其與預(yù)后生存的關(guān)系研究

楊敬端 何明 吳品

胃癌是我國常見腫瘤之一，近年來發(fā)病率日益增高。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國每年新發(fā)胃癌患者達(dá)40 萬人，死亡人數(shù)達(dá)30 萬人，嚴(yán)重威脅患者生命安危［1］。盡管近年來胃癌的診療取得了顯著進(jìn)步，但在多數(shù)發(fā)展中國家胃癌的發(fā)病率及致死率仍在不斷升高［2］。故及時(shí)明確胃癌病情進(jìn)展采取治療措施具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)29（Endoplasmic reticulum protein 29，ERp29）在新生蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的正確折疊及恢復(fù)中起著重要作用，與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)［3］。而COP9 信號(hào)轉(zhuǎn)移體（COP9 signalosome complex，CSN）是一種多亞基蛋白復(fù)合體，通過調(diào)控泛素蛋白酶體的降解過程而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，在CSN 亞單位中CSN5是CSN 第5 個(gè)亞單位，也是其活化中心，與多種腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān)［4］。此外，親環(huán)素J（Cyclophilins J，CyPJ）是一類低分子量多功能蛋白，可參與蛋白質(zhì)合成、修復(fù)、免疫抑制、誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡及調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖等作用，是目前臨床研究惡性腫瘤的新靶點(diǎn)［5］。因此，本研究將分析胃癌患者CyPJ、ERp29 及CSN5 的表達(dá)及臨床意義?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院2015年6月至2017年6月收治的115 例胃癌患者作為研究對(duì)象。男性患者59 例，女性患者56 例，平均年齡（59.31±6.65）歲。收集腫瘤組織及腫瘤旁的正常胃粘膜組織，分別作為癌組織組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均經(jīng)病理檢查證實(shí)且符合日本胃癌學(xué)會(huì)第72 屆會(huì)議胃癌的標(biāo)準(zhǔn)治療指導(dǎo)方案［6］；②術(shù)前未接受化療、放療等輔助治療；③本研究患者臨床資料均完整；④無其它惡性疾?。虎菔茉囌吆炇鹬橥鈺?。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并肝、腎、心臟臟器嚴(yán)重疾病者；②合并嚴(yán)重神經(jīng)功能、認(rèn)知功能障礙者；③依從性差者。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過。

1.2 CyPJ、ERp29 及CSN5 水平檢測(cè)方法

1.2.1 儀器與試劑

SP 試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）、免疫組織化學(xué)二抗試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）、磷酸鹽緩沖液（PBS）（北京賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司）、兔抗人CyPJ 抗體（英國Abcam 公司）、兔抗人ERp29 抗體（美國Abcam公司）、兔抗人CSN5 抗體（美國Santa Cruz 公司）。

1.2.2 檢測(cè)方法

采集所有研究對(duì)象胃癌組織及癌旁組織，使用生理鹽水清洗表面后保存在10%甲醛溶液中并置于-80℃恒溫箱，分為三份。

CyPJ、ERp29 及CSN5 水平的檢測(cè)采用免疫組織化學(xué)方法進(jìn)行：鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法（Streptomyces avidin peroxidase conjugation，SP）［7］，石蠟切片標(biāo)本厚2 μm，烘烤60℃，二甲苯脫蠟，浸泡3 次。3 次離子水中浸泡抗原修復(fù)切片，磷酸鹽緩沖液（PBST）洗3 次。內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑滴加，室溫孵育15 min，沖洗。一抗滴加，室溫孵育1 h，沖洗。辣根酶標(biāo)羊抗小鼠/兔IgG 聚合物滴加，室溫孵育30 min。對(duì)照組采用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）代替一抗；滴加山羊抗兔二抗（eBioscience）室溫孵育30 min。二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木精復(fù)染，梯度酒精脫水，樹膠封片。

1.2.3 結(jié)果判斷

判斷CyPJ、ERp29 及CSN5 蛋白范圍的標(biāo)準(zhǔn)［8］：每張切片在鏡下分別以低倍鏡及高倍鏡進(jìn)行觀察，對(duì)每張切片上中下及里外中9 個(gè)位置進(jìn)行觀察，最后對(duì)2 位專家判斷結(jié)果進(jìn)行比對(duì)（差異較大時(shí)，需重新同時(shí)共同讀片確定）。

采用Volm 雙評(píng)分法［8］進(jìn)行判定，在染色均勻的腫瘤區(qū)，選取5 個(gè)高倍鏡視野（×400）：按陽性細(xì)胞百分率（A 值）評(píng)分［7］：＜25%為1 分，25%～50%為2 分，＞50%為3 分；按染色強(qiáng)度（B 值）評(píng)分：不著色為0 分，淺棕黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分。綜合染色陽性細(xì)胞數(shù)與染色強(qiáng)度判斷結(jié)果：陰性（-）：0 分，弱陽性（+）：1～2 分，中度陽性（++）：3～4 分，強(qiáng)陽性（+++）：5～6 分；兩種計(jì)分的乘積為每例的加權(quán)分?jǐn)?shù)，加權(quán)分?jǐn)?shù)為0 為陰性，其余均為陽性。

1.2.4 隨訪

所有患者治療結(jié)束后通過電話、微信、到院復(fù)診等方式進(jìn)行隨訪3年，隨訪截止日期為2020年6月30日。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件分析，計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，行χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料采用（±s）描述，行t檢驗(yàn)；予以Kaplan-Meier 生存分析CyPJ、ERp29 及CSN5 表達(dá)對(duì)胃癌患者預(yù)后生存的影響；采用Logistic 回歸分析影響胃癌患者預(yù)后生存的危險(xiǎn)因素，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組CyPJ、ERp29 及CSN5 的表達(dá)情況比較

胃癌組織組CyPJ、CSN5 陽性表達(dá)率顯著高于癌旁正常組織組，ERp29 陽性表達(dá)率顯著低于癌旁正常組織組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1、圖1。

表1 兩組CyPJ、ERp29 及CSN5 的表達(dá)情況比較［n（%）］Table 1 Comparison of the expression of CYPJ，ERp29 and CSN5 between 2 groups［n（%）］

圖1 胃癌組織CyPJ、ERp29、CSN5 免疫組化染色圖（SP，×500）Figure 1 immunohistochemical staining of CYPJ，ERp29 and CSN5 in gastric cancer tissue（SP，×500）

2.2 CyPJ、ERp29 及CSN5 與胃癌患者不同病理參數(shù)的關(guān)系

年齡、性別、漿膜浸潤與胃癌患者CyPJ、ERp29及CSN5 表達(dá)無相關(guān)（P＞0.05）。臨床分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與患者CyPJ、CSN5 表達(dá)呈正相關(guān)，組織分化程度與CyPJ、CSN5 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。ERp29 與組織分化程度呈正相關(guān)，與臨床分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。見表2。

2.3 115 例胃癌患者預(yù)后情況

截至隨訪結(jié)束，115 例胃癌患者生存79 例，死亡36 例，死亡率為31.30%。

CyPJ 表達(dá)陰性及表達(dá)陽性中位生存時(shí)間分別為（42.75±1.82）個(gè)月、（30.35±1.01）個(gè)月；ERp29 表達(dá)陰性及表達(dá)陽性中位生存時(shí)間分別為（30.79±1.08）個(gè)月、（39.76±2.15）個(gè)月；CSN5 表達(dá)陰性及表達(dá)陽性中位生存時(shí)間分別為（43.01±2.08）個(gè)月、（33.04±1.04）個(gè)月。生存分析顯示CyPJ 及CSN5（表達(dá)陰性）、ERp29（表達(dá)陽性）者生存期較長(zhǎng)，Keplan-meier 生存曲線明顯不同（P＜0.05）。見圖2。

表2 CyPJ、ERp29、CSN5 與胃癌患者不同病理參數(shù)的關(guān)系［n（%）］Table 2 Relationship between CYPJ，ERp29 and different pathological parameters in patients with gastric cancer［n（%）］

圖2 CyPJ、ERp29、CSN5 蛋白生存曲線圖Figure 2 protein survival curve of CYPJ，ERp29 and CSN5

2.4 影響胃癌患者預(yù)后生存的單因素和多因素分析

組織中低分化、TNM 分期：Ⅲ+Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、ERp29 陰性表達(dá)、CyPJ 及CSN5 陽性表達(dá)為影響胃癌患者預(yù)后生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。見表3。

表3 影響胃癌患者預(yù)后生存的單因素和多因素分析Table 3 univariate and multivariate analysis of prognostic factors in patients with gastric cancer

3 討論

近年來我國胃癌發(fā)病率逐年上升，盡管目前胃癌的外科手術(shù)已取得長(zhǎng)足的進(jìn)步，但術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及死亡的風(fēng)險(xiǎn)仍較高［9］。本研究顯示，115 例胃癌患者死亡率為31.30%，基本與既往研究相似，故尋求有效治療靶點(diǎn)對(duì)降低胃癌患者死亡率有重要意義。

CyPJ 是親環(huán)素家族成員之一，一方面可協(xié)助合成蛋白質(zhì)，保護(hù)蛋白質(zhì)正確合成；另一方面具有核酸酶活性，參與細(xì)胞凋亡進(jìn)程［10］。目前大量研究證實(shí)CyPJ 和乳腺癌、肝癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、甲狀腺癌等多種腫瘤發(fā)生密切相關(guān)［11］。ERp29 是新發(fā)現(xiàn)的分子量為29 KDa 的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)，其位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，定位于12q24.13 基因，協(xié)助新合成蛋白質(zhì)分泌、轉(zhuǎn)運(yùn)、折疊蛋白恢復(fù)正確空間構(gòu)象。相關(guān)研究表示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)會(huì)因?yàn)轶w內(nèi)未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)增多而發(fā)生未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)，這時(shí)未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)發(fā)出的信號(hào)調(diào)節(jié)會(huì)限制mRNA 的翻譯速度，使其表達(dá)水平下降，引發(fā)腫瘤［12］。Tang W 等學(xué)者［13］對(duì)乳腺癌研究發(fā)現(xiàn)，ERp29 通過對(duì)p38 的信號(hào)通路進(jìn)行負(fù)調(diào)控，抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和生存。CSN5 是一種金屬蛋白酶復(fù)合物，其參與多種細(xì)胞的凋亡及增殖。相關(guān)研究表示，腫瘤的進(jìn)展與泛素蛋白酶體密切相關(guān)，而CSN5 參與泛素蛋白酶體降解、催化，故認(rèn)為CSN5 腫瘤關(guān)系密切［14］。本研究結(jié)果說明CyPJ、CSN5、ERp29 在胃癌患者中惡變程度、侵襲轉(zhuǎn)移中占有重要作用。

同時(shí)，為明確影響胃癌患者預(yù)后影響的危險(xiǎn)因素，本研究對(duì)胃癌患者進(jìn)行為期3年隨訪發(fā)現(xiàn)，患者死亡率為31.30%。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，CyPJ 與胃癌細(xì)胞增殖和凋亡、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)蛋白相互作用，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程發(fā)揮作用，其水平與胃癌患者兩年生存率密切相關(guān)［14］。而相關(guān)國外研究也顯示，ERp29 表達(dá)水平可作為胃癌患者疾病程度與預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志［15］。本研究予以Logistic回歸分析中顯示，組織中低分化、TNM 分期：Ⅲ+Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、ERp29 陰性表達(dá)、CyPJ及CSN5 陽性表達(dá)為影響胃癌患者預(yù)后生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與上述研究一致，有力證明了CyPJ、CSN5、ERp29 與胃癌患者關(guān)系密切，進(jìn)一步提示CyPJ、CSN5、ERp29 通過參與腫瘤細(xì)胞的分化、浸潤和轉(zhuǎn)移影響胃癌患者臨床結(jié)局。但本研究由于納入的樣本量有限，研究結(jié)果有待于通過進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量或多中心合作研究予以進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，CyPJ、ERp29 及CSN5 在胃癌組織中呈異常表達(dá)狀態(tài)，其表達(dá)水平與患者的腫瘤臨床病理特征及預(yù)后有關(guān)。