BRAFV600E突變對甲狀腺乳頭狀癌HMGB1及MMP-9表達的影響

張沖 古虎霞 劉定榮 衛(wèi)惠杰 周丹 方靜 楊艷 代曉璐

盡管甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）疾病進展較慢，但因當(dāng)前對PTC 發(fā)生機制尚未完全了解，仍有部分患者治療后病灶復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，這也是PTC 患者死亡的主要原因。研究證實［1-2］，高遷移率族蛋白1（high mobility group protein 1，HMGB1）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）均在PTC 患者中異常表達，且可輔助PTC 的診斷和預(yù)后，但其作用機制尚未清晰。HMGB1 已被證實可通過絲裂素活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路影響腫瘤發(fā)生、發(fā)展。MMP-9 也被認(rèn)為與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)，既往研究報道［3］，MAPK 可上調(diào)MMP-9 的表達。BRAFV600E是MAPK 通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。結(jié)合分析，筆者認(rèn)為BRAFV600E突變可能與HMGB1、MMP-9 具有關(guān)聯(lián)性，并選取PTC 患者臨床資料，進一步闡述其中關(guān)聯(lián)?，F(xiàn)將報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月至2019年11月在本院行甲狀腺全切除術(shù)或次全切除術(shù)的116 例PTC 患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均經(jīng)病理學(xué)檢查證實為PTC［3］；②術(shù)前未進行化療、放療等抗腫瘤治療；③臨床資料完整，且具有癌組織標(biāo)本、血清標(biāo)本；④首次治療者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他腫瘤；②既往頸部手術(shù)史、放射性物質(zhì)接觸史；③合并橋本氏甲狀腺炎、甲狀腺功能亢進等甲狀腺疾病。男52 例、女64 例，平均年齡（53.67±4.80）歲。另擇同時期體檢正常的30例健康人作為對照組，男13 例、女17 例，平均年齡（54.03±4.85）歲。本研究嚴(yán)格遵守赫爾辛基宣言［4］。

1.2 方法

BRAFV600E基因檢測：取連續(xù)切片，采用Takara組織/細(xì)胞DNA 快速提取試劑盒提取總DNA，采用紫外分光光度計檢測DNA 純度（OD260/OD280為1.6～1.8）；構(gòu)建PCR 反應(yīng)體系，進行PCR 擴增，95℃變性15 s、55℃退火15 s、72℃延伸30 s、35 個循環(huán)，72℃延伸7 min；產(chǎn)物跑電泳檢查純度后，對PCR 產(chǎn)物進行測序。

組織HMGB1、MMP-9 檢測用免疫組化法：取切片，60℃烤片30 min，脫蠟、至水、修復(fù)，PBS 沖洗，加3%H2O2溶液，沖洗，滴加一抗（兔抗人HMGB1 抗體、兔抗人MMP9 抗體均購于ABCOM公司）、二抗（羊抗兔IgG 購于北京中杉金橋有限公司），沖洗，滴加DAB 顯色劑（中杉金橋有限公司），復(fù)染、脫水，透明，中性樹膠封片，以PBS 代替一抗作為陰性對照組；由病理科醫(yī)師盲法閱片［5］，高倍鏡下隨機5 個視野依照陽性細(xì)胞占比分別記“0 分”、“1 分”、“2 分”、“3 分”，低倍鏡下觀察陽性細(xì)胞著色強度分別記“0 分”、“1 分”、“2 分”、“3 分”，以陽性細(xì)胞占比及著色乘積判定陽性等級，以積分≤3 分為陰性。Western blot 法：取切片，超聲裂解提取上清液，檢測蛋白濃度后跑電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育、顯影，以管家基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶作為內(nèi)參。

采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清中HMGB1、MMP-9 水平，HMGB1 試劑盒購自于上海振譽生物科技有限公司（規(guī)格96T），MMP-9 試劑盒購自于武漢楚銳科藥業(yè)科技有限公司（規(guī)格48T/96T），均由同一組檢驗人員嚴(yán)格按照說明書檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用統(tǒng)計軟件SPSS 22.0 和Graphpad Prism 軟件處理數(shù)據(jù)；符合正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示，采用單因素方差分析、獨立樣本t檢驗，不符合正態(tài)分布采用非參數(shù)檢驗的Wilcoxon 秩和檢驗；計數(shù)資料用n（%）表示，行χ2檢驗；影響因素采用二元Logistic 分析；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同患者BRAFV600E基因表達情況

116例PTC 患者檢出59 例BRAFV600E突變型、57 例為BRAFV600E野生型，PTC 患者BRAFV600E突 變型為50.86%（59/116）。見圖1。

圖1 PTC 患者組織BRAFV600E基因測序圖Figure 1 Tissue BRAFV600E of PTC patients

2.2 組織HMGB1、MMP-9 表達

BRAFV600E突變型HMGB1、MMP-9陽性表達率均顯著高于BRAFV600E野生型，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；Western blot法檢測結(jié)果顯示，BRAFV600E突變型HMGB1表達量、MMP-9表達量顯著高于BRAFV600E野生型，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2、表1。

圖2 組織中HMGB1、MMP-9 表達Figure 2 Expression of HMGB1 and MMP-9 in tissues

表1 PTC 患者組織HMGB1、MMP-9 蛋白表達［n（%）］Table 1 Expression of HMGB1 and MMP-9 in tissues of PTC patients［n（%）］

2.3 血清HMGB1、MMP-9 表達

3 組受試者血清HMGB1、MMP-9 比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。PTC 組BRAFV600E突變型及BRAFV600E野生型血清HMGB1、MMP-9 水平均顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），PTC 組BRAFV600E突變型與BRAFV600E野生型在血清HMGB1、MMP-9 水平上比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 3 組受試者血清HMGB1、MMP-9 比較（±s）Table 2 Comparison of serum HMGB1 and MMP-9 in the 3 groups（±s）

表2 3 組受試者血清HMGB1、MMP-9 比較（±s）Table 2 Comparison of serum HMGB1 and MMP-9 in the 3 groups（±s）

分組PTC 組n突變型野生型對照組F 值P 值59 57 30 HMGB1（pg/mL）8.78±1.66 8.62±1.49 4.56±1.15 90.798＜0.001 MMP-9（ng/L）2.56±0.60 2.39±0.54 1.21±0.26 71.315＜0.001

2.4 PTC 患者臨床特征

BRAFV600E突變型TNM 分期Ⅲ～Ⅳ期、有包膜浸潤、病灶多發(fā)、合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移占比顯著高于BRAFV600E野生型，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 PTC 患者臨床特征［n（%），（±s）］Table 3 Clinical characteristics of PTC patients［n（%），（±s）］

表3 PTC 患者臨床特征［n（%），（±s）］Table 3 Clinical characteristics of PTC patients［n（%），（±s）］

分組性別t/χ2值P 值男女年齡（歲）腫瘤直徑（cm）TNM 分期Ⅰ～Ⅱ期Ⅲ～Ⅳ期0.336 1.802 1.194 7.767 0.562 0.074 0.235＜0.001包膜浸潤25.147＜0.001病灶類型是否單發(fā)多發(fā)4.806 0.028淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是否突變型（n=59）28（47.46）31（52.54）52.71±6.20 1.71±0.33 18（30.51）41（69.49）32（54.24）27（45.76）11（18.64）48（81.36）13（22.03）46（77.97）野生型（n=57）24（42.11）33（57.89）54.60±5.01 1.64±0.30 32（56.14）25（43.86）6（10.53）51（89.47）21（36.84）36（63.16）4（7.02）53（92.98）5.227 0.022

2.5 影響PTC 患者BRAFV600E突變型的因素

以BRAFV600E基因類型作為因變量，以病理特征作為自變量，結(jié)果顯示合并包膜浸潤、多發(fā)病灶、組織HMGB1 陽性、組織MMP-9 陽性均是BRAFV600E突變型的獨立危險因素（P＜0.05）。見表4。

表4 影響PTC 患者BRAFV600E突變型的因素Table 4 Factors Affecting BRAFV600E Mutant Type in PTC Patients

3 討論

Reagh 等人［6］的一項薈萃分析研究指出，結(jié)直腸癌患者BRAFV600E突變測試與免疫組織化學(xué)結(jié)果之間具有較高的一致性；余慧等人［7］對黑色素瘤進行分析，結(jié)果顯示BRAFV600E基因突變患者預(yù)后較差?？梢?，BRAFV600E基因類型對于腫瘤的診斷及預(yù)后均有一定的指導(dǎo)意義。BRAFV600E基因類型在甲狀腺癌患者中也有類似的效果。郭榮榮等人［8］對甲狀腺癌患者超聲特征與BRAFV600E基因之間進行分析，結(jié)果顯示，超聲圖像特征接觸被膜、微鈣化、血流豐富等都與BRAFV600E突變存在相關(guān)性；Qu 等人［9］指出，BRAFV600E突變是PTC 患者中央淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨立因素，后者是導(dǎo)致患者術(shù)后原位復(fù)發(fā)及二次手術(shù)的主要原因。可以說，BRAFV600E突變是PTC 惡性程度以及復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的重要相關(guān)因素。

當(dāng)前認(rèn)為，PI3K-Akt-mTOR、P53-PTEN、βcateinin 以及MAPK 信號通路與PTC 的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)［10-11］，而BRAFV600E基因會通過MAPK 信號通路而對細(xì)胞的生長、分化、增殖等進行調(diào)節(jié)作用參與到PTC 中來。HMGB1 可經(jīng)“主動”和“被動”釋放，這也是本組案例中觀察到PTC 患者血清HMGB1 水平顯著高于對照組的原因。本組案例結(jié)果HMGB1 陽性是BRAFV600E突變型的影響因素。然而，Western blot 法顯示BRAFV600E突變型HMGB1 表達量下調(diào)，結(jié)合BRAFV600E突變型是中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨立因素。這提示，在PTC 患者中，可能BRAFV600E突變下調(diào)HMGB1 而增加PTC惡性發(fā)展。部分學(xué)者認(rèn)為PTC 患者組織HMGB1表達量下調(diào)與自噬功能降低有關(guān)［12］。自噬是腫瘤發(fā)生初始階段的應(yīng)激方式，而在腫瘤進展后期由于腫瘤細(xì)胞線粒體功能障礙和代謝缺陷將導(dǎo)致自噬功能下降［13］。對于組織HMGB1 表達量下降的具體機制需要后續(xù)工作不斷探究。如前所述，BRAFV600E突變是CLNM 的獨立因素。Logistic 分析結(jié)果進一步證實，組織MMP-9 陽性是BRAFV600E突變型的影響因素。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清中HMGB1、MMP-9 與組織中HMGB1、MMP-9 不等量表達，但血清HMGB1、MMP-9 對于判定PTC 患者BRAFV600E基因類型是否具有臨床意義尚需要進一步觀察。盡管本研究顯示，組織HMGB1、MMP-9在BRAFV600E突變型、野生型中差異表達，但對于BRAFV600E基因通過哪種或哪幾種信號通路以調(diào)控HMGB1、MMP-9 的表達需深入研究。另外，本研究未能分析BRAFV600E基因類型對預(yù)后的影響，且未能收集甲狀腺腺瘤、合并橋本氏甲狀腺炎等患者臨床資料行更全面的對比研究，這些都有待后續(xù)的研究。

綜上所述，PTC 患者BRAFV600E突變型和野生型其組織HMGB1、MMP-9 不等量表達，且組織HMGB1 陽性、MMP-9 陽性是BRAFV600E突變型的影響因素。