斑馬魚血管性認知障礙模型的建立研究

劉 琳，王偉佳，楊寓迪，康靖飛，王冬雪

(哈爾濱商業(yè)大學 藥學院，哈爾濱 150076)

血管性認知障礙主要由腦缺血缺氧損害所引起，是致老年性癡呆的重大原因，且分類較多，按病因可分成：神經(jīng)病變性急性、腦血管病、代謝障礙疾病等，其發(fā)病率僅次于阿爾茨海默病，是腦血管病后產(chǎn)生的進行性智能障礙綜合征[1].現(xiàn)今相關(guān)研究愈來愈熱，其中大鼠模型是最為常見的，但其存在模型建立周期長費用昂貴等缺點[2].斑馬魚作為一種新型模式生物，以其胚胎和幼魚透明易觀察、個體小易于飼養(yǎng)、繁殖周期短、產(chǎn)卵量大、卵子體外受精和發(fā)育、對藥物敏感、適合高通量藥物的篩選等優(yōu)點，目前廣泛用于人類疾病的研究中，已成為疾病研究的最佳模式生物之一[3].目前建立血管性認知障礙模型方法主要有2-VO法、3-VO法、低壓缺氧法、化學試劑法、急性重復(fù)缺氧法等[4].而現(xiàn)今對斑馬魚的缺氧癡呆模型探究較少，鑒于實驗室前期成功建立阿爾茨海默癥模型基礎(chǔ)，本實驗采用鼓泡法的方式摸索斑馬魚在不同條件下造成癡呆的程度，通過氮氣鼓泡法建立缺氧模型，并檢測其T迷宮、社交行為、神經(jīng)生化指標來探究其發(fā)病過程，這樣可以更加有效的了解人發(fā)病的情況，為實驗室后續(xù)研究提供依據(jù).

1 實驗部分

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物及分組

野生型 AB 系成年斑馬魚 120條，購自武漢國家斑馬魚資源中心，野生健康紅色斑馬魚 20 條，購自 ×× 花鳥魚市場.所有斑馬魚均 6～8 月齡，體長 2.5～3.5 cm，飼養(yǎng)于獨立的循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)，水溫恒定在 (28±0.5)℃，pH 值為 6.8～7.5，電導率為 450～550 μS/cm，光照/黑暗周期為 14h∶10h，每日定時喂食 2 次冰凍豐年蝦.將120條野生型 AB 系成年斑馬魚隨機分為對照組(n=60)、氮氣模型組(n=60).

1.1.2 實驗儀器及設(shè)備

酶標分析儀(RAYTO公司)，紫外可見分光光度計(尤尼柯儀器有限公司)，斑馬魚 T 迷宮(View Point 公司)，斑馬魚社交箱(View Point 公司)，紅外線照明系統(tǒng) 50 cm(View Point 公司)，斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)(上海海圣生物實驗設(shè)備有限公司)，凈化供水單元(RO 純水機)(上海海圣生物實驗設(shè)備有限公司)，筆試溶氧儀(上海亞榮生化儀器廠).

1.1.3 實驗試劑

零氧試劑，總蛋白(TP)測定試劑盒，總超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒，微量丙二醛(MDA)測定試劑盒，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)，過氧化氫酶(CAT)測定試劑盒.

1.2 實驗方法

1.2.1 氮氣模型

1)氮氣模型建立

在實驗開始前，將高純氮氣以大流速充入裝有 500 mL純凈水的廣口瓶中，實時用溶氧儀檢測水中的溶氧量直至降到 0.5 mg/L 以下，達到斑馬魚缺氧環(huán)境.將模型組放入廣口瓶中，并繼續(xù)以200 mL/min 的流速向裝有模型組的廣口瓶中充入高純氮氣5 min，計時結(jié)束后將氣管拿出并用保鮮膜密封放置，8 h 后再一次進行氮氣缺氧，每天相同時間點，每天 2 次，連續(xù)充 60 d.

2)氮氣模型溶氧量

溶氧含量是指水中氧氣的溶解量，斑馬魚是通過溶解在水中的氧氣呼吸生存的，溶氧量在水中生存的重要指標之一.溶氧儀可以用來檢測現(xiàn)場或?qū)嶒炇覂?nèi)被測樣品水溶液內(nèi)的溶氧含量，通過溶氧電極將產(chǎn)生氧化反應(yīng)，由此生成的擴散電流和溶液中的氧呈一定關(guān)系的原理制作，用于測量水中氧氣含量，根據(jù)測量數(shù)據(jù)指標可以更直觀有效的看到斑馬魚是否達到低氧、缺氧指標.因此本實驗通過使用溶氧儀檢測每次氮氣鼓泡實驗前后水中的溶氧含量，從而更直觀有效的觀察斑馬魚所處的環(huán)境是否達到低氧，缺氧的指標.

1.2.2 T迷宮行為學檢測

以實驗室前期建立的T迷宮實驗方法為標準[5]，于建立模型后的 30、45、60 d 進行學習記憶能力檢測.1)適應(yīng)性訓練：將整組斑馬魚放入 T 迷宮中自由活動，不設(shè)置 EC 區(qū)，每組適應(yīng)1 h .2)實驗前期準備：實驗前向迷宮中注入斑馬魚養(yǎng)殖水直到短臂相比于其他位置水位高6 cm ，短臂的兩端分別用紅色、綠色卡紙包住，左臂用綠色卡紙包住后設(shè)置為目標臂并在底部鋪滿白色砂石，臂中加入人工綠植.3)訓練及測試期：每天早上 8∶00 在相同時間點進行實驗，將 1 條斑馬魚放到通道起點處，觀察并記錄魚在6 min 內(nèi)從起點到第 1 次進入 EC 區(qū)的潛伏期(當魚找到并停留30 s 后才算進入了 EC 區(qū))，并在 EC 區(qū)內(nèi)給予食物獎賞.未找到 EC 區(qū)的魚，6 min 后引導其進入 EC 區(qū)并停留30 s，同樣給予食物獎勵.每天魚都有一個對應(yīng)編號的獨立小魚缸，測試完后放回原組中.每天1次，每天訓練 6 min ，連續(xù)訓練 4 次，第 5 次為測試期.實驗期間在夏天進行，并保證T迷宮未受室內(nèi)光源光照的影響，周圍外部環(huán)境安靜.

1.2.3 社交實驗檢測

于建立模型后 30、45、60 d 測試斑馬魚社交行為[6]，全程在社交箱中進行.實驗開始前1 h將整組斑馬魚分別在獨立小魚缸進行被測魚單獨隔離，避免實驗時激發(fā)出更多社交行為.社交行為箱中注入養(yǎng)殖水直至水位在8 cm，隔離完畢后開始正式實驗，將社交魚(野生紅色斑馬魚)放入社交箱后，再取模型組中1條被測魚放入，讓2條魚適應(yīng)并進行社交，實驗時間為7 min ，前5 min 適應(yīng)熟悉并記錄后2 min 的接觸時間及次數(shù)，被測魚追逐社交魚時接觸記為追逐、社交魚追逐被測魚時接觸記為被追逐、2條魚互相交流接觸時記為互相，為避免社交魚出現(xiàn)社交疲乏狀態(tài)，同1條社交魚跟3條被測魚進行社交行為測試，也可保證其實驗的隨機性，測試后放回原組中，每天1次，連續(xù)4次.實驗期間確保實驗室內(nèi)燈光、物品等空間參照物位置擺放不變，其他實驗人員不得發(fā)出噪聲及進行走動.

1.2.4 神經(jīng)生化指標檢測

1)樣品采集處理

模型建立后 60 d ，將對照組氮氣組進行樣品采集.將魚置于冰上，待魚麻醉后快速取腦，準確稱重，按照質(zhì)量(g)：體積(mL)=1∶9的比例制備10%勻漿，采用低溫高速離心機在2 500 r/min 離心10 min，取上清液用于生化指標的檢測.

2)檢測指標

按照總蛋白(TP)測定試劑盒、總超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒、微量丙二醛(MDA)測定試劑盒并按照說明說同比例稀釋后測定.

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

2 實驗結(jié)果

2.1 氮氣模型溶氧量檢測

采用溶氧儀分別在氮氣鼓泡實驗前、實驗后進行連續(xù)60 d 監(jiān)測.在氮氣鼓泡后的溶氧量有一定波動，數(shù)據(jù)顯示明顯比實驗前低，并且較穩(wěn)定的保持在低氧狀態(tài)下，見圖1.

圖1 60 d 內(nèi)溶氧量變化

2.2 氮氣模型T迷宮實驗結(jié)果

T迷宮實驗結(jié)果如圖2所示，與對照組相比，氮氣組 45、60 d 均出現(xiàn)顯著性差異(P<0.01)；與30 d相比，對照組在60 d出現(xiàn)非常顯著性差異(P<0.01)，氮氣組在45 d為時間轉(zhuǎn)折點出現(xiàn)非常顯著性差異直至60 d(P<0.01).

圖2 30、45、60d氮氣組測試期結(jié)果

2.3 社交接觸時間

30 d社交接觸時間結(jié)果顯示，與對照組相比，氮氣組追逐時間有顯著性下降(P<0.01)、互相交流時間在第 2 次和第 4 次出現(xiàn)非常顯著性下降(P<0.01)；45 d社交接觸時間結(jié)果顯示，與對照組比較，氮氣組追逐時間非常顯著性下降(P<0.01)；60 d社交時間結(jié)果顯示，與對照組相比，氮氣組并無追逐接觸出現(xiàn)顯著性下降(P<0.01)、被追逐時間在第 3 次、第 4 次出現(xiàn)顯著性上升(P<0.01).見表1～3.

表1 30d 斑馬魚社交接觸時間

表2 45 d 斑馬魚社交接觸時間

表3 60 d 斑馬魚社交接觸時間

2.4 社交接觸次數(shù)結(jié)果

30d 社交接觸次數(shù)結(jié)果顯示，與對照組相比，氮氣組追逐次數(shù)顯著性下降(P<0.05)、互相交流時間在第 4 次出現(xiàn)非常顯著性下降(P<0.01)；45d 社交接觸次數(shù)結(jié)果顯示，與對照組相比，氮氣組追逐次數(shù)非常顯著性下降(P<0.01)；60d 社交接觸次數(shù)結(jié)果顯示，與對照組相比，氮氣組并無追逐接觸出現(xiàn)非常顯著性下降(P<0.01)，見表4～6.

表4 30 d 斑馬魚社交接觸次數(shù)次)

表5 45 d 斑馬魚社交接觸次數(shù)次)

表6 60 d斑馬魚社交接觸次數(shù)次)

2.5 含SOD、MDA量檢測結(jié)果

SOD活力是通過測定 SOD 抑制率得到，與對照組相比，氮氣組有顯著性下降(P<0.05)；含MDA 量測定通過與硫代巴比妥酸縮合，與對照組相比，氮氣組有顯著升高(P<0.05)，測定結(jié)果見圖3.

與對照組相比，*P<0.05 顯著性差異

3 討 論

斑馬魚是一種小型熱帶淡水硬骨魚，具有體型小、易于飼養(yǎng)、管理且實驗成本低、樣本小，可進行體外受精和培養(yǎng)，胚胎透明，易于觀察，繁殖周期短，且一次有較大的產(chǎn)卵數(shù)量等特點[7-8].斑馬魚作為新型模式動物，其篩選周期短，也是較其他生物、化學模型和體外細胞模型具有絕對的優(yōu)勢[9-10].近年來在各類研究領(lǐng)域發(fā)揮著越來越重要的作用[11].目前，斑馬魚已被廣泛地用于藥理學、發(fā)育生物學、分子生物學、細胞生物學、遺傳學、神經(jīng)生物學、腫瘤學、免疫學、海洋生物學、藥物學、毒理與環(huán)保等諸多方面的研究，一些重要的成果不斷涌現(xiàn)，為現(xiàn)代醫(yī)學生命科學的發(fā)展做出了重要貢獻[12].T迷宮實驗已經(jīng)成為現(xiàn)今實驗室最經(jīng)典、最常用評價斑馬魚學習記憶能力的檢測手段，可以檢測其斑馬魚學習及記憶能力，能提供較多的實驗指標和參考[13].

本研究采用氮氣鼓泡法建立氮氣缺氧模型，氮氣模型流速可以很好的模擬貼近人缺氧發(fā)病的過程，但是也有一定的缺點對于氮氣流速的控制較難把控，也是建立此模型的難點.通過T迷宮、社交實驗檢測學習記憶能力與社交實驗?zāi)芰υ?0 d時出現(xiàn)認知障礙并持續(xù)至60 d，隨時間加重也并未出現(xiàn)反復(fù).SOD能催化超氧化物陰離子發(fā)生歧化作用，活性的高低反映了機體抗氧化能力大小，是生物體內(nèi)一種重要的抗氧化酶[14]，MDA是生物脂質(zhì)氧化的天然產(chǎn)物之一，含MDA量反映了機體細胞脂質(zhì)過氧化程度的嚴重[15].本實驗結(jié)果顯示斑馬魚腦內(nèi)SOD活力降低，升高MDA活力引起腦內(nèi)脂質(zhì)過氧化.因此模型組斑馬魚SOD活力降低，MDA活力升高所引起的腦內(nèi)脂質(zhì)過氧化，有可能是造成斑馬魚血管認知障礙的原因之一.

綜上所述，氮氣鼓泡法可以作為一種行之有效的造模方法來建立斑馬魚的血管認知障礙模型.使用該方法，能夠為實驗室后續(xù)對相關(guān)疾病的研究提供全新的選擇，為后續(xù)實驗提供重要的理論參考，由于模型處于建立初期，模型的形成原因還有待發(fā)掘，因此該模型依然有著巨大的改良空間.