HPLC-MS/MS法同時測定煙草中22種Amadori化合物

王曉瑜，王昇*，劉鴻，陳志燕，潘立寧，秦亞瓊，劉惠民，范忠*，周蕓

1.中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2號450001

2.廣西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，南寧市北湖南路28號530001

煙草加工過程中會伴隨美拉德反應(yīng)發(fā)生，對煙草的顏色和品質(zhì)產(chǎn)生重要影響。美拉德反應(yīng)初始階段，還原糖和氨基酸發(fā)生加成反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)Amadori重排生成相對穩(wěn)定的Amadori化合物［1］。Amadori化合物是重要的香味前體物質(zhì)，快速、準(zhǔn)確地對其測定對識別和監(jiān)測食品和煙草加工過程中的美拉德反應(yīng)具有重要意義［2-4］。早期關(guān)于Amadori化合物測定的研究對象均是煙葉樣品，主要是基于液相色譜-光譜檢測技術(shù)［5-8］。例如，1971年Noguchi等［5］研究了自然陳化4年內(nèi)烤煙煙葉中Amadori化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化，采用強(qiáng)酸性陽離子交換色譜與茚三酮柱后衍生并用紫外-可見檢測器（UV-Vis）分析了6種Amadori化合物（Fru-Pro、Fru-Ala、Fru-Val、Fru-Thr、Fru-Phe、

Fru-Tyr）質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化，但該方法存在氨基酸干擾，且靈敏度較低。1982年，Gary等［6］用硝基苯甲醛肟（PNBO）對烤煙中選定的3種Amadori化合物進(jìn)行衍生后，用液相色譜（氨基反向柱）進(jìn)行分離，示差折光檢測器（RI）檢測，但該法前處理較為繁瑣，且不同Amadori化合物的保留時間相似，檢測靈敏度及選擇性也較差。1989年，Hennighan等［7］利用液相色譜（陰離子交換柱）分離Amadori化合物，采用2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）對Amadori化合物進(jìn)行柱后衍生和UV-Vis檢測，實現(xiàn)了煙草中6種主要Amadori化合物的分離，但靈敏度仍較低。

隨著MS技術(shù)的快速發(fā)展，在2000年后文獻(xiàn)報道的關(guān)于煙葉及食品、模擬反應(yīng)體系中Amadori化合物的檢測方法主要以HPLC-MS/MS為主［9-12］，也有毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜檢測法［13］，這些方法均有效克服了傳統(tǒng)液相色譜-光譜檢測技術(shù)靈敏度低、選擇性差的問題。例如，2004年Hau等［13］首次采用未涂層的熔融石英毛細(xì)管電泳-串聯(lián)質(zhì)譜分析Amadori化合物，能實現(xiàn)對含有葡萄糖和6種氨基酸的混合反應(yīng)產(chǎn)生的Amadori化合物的快速分離與定性，色譜分辨率很高，但由于毛細(xì)管電泳色譜使用普及率低且重復(fù)性較差，該法較難推廣。2005年，Davidek等［9］采用高效陽離子交換色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析Amadori化合物，能實現(xiàn)對含有葡萄糖或木糖與8種氨基酸混合反應(yīng)產(chǎn)生的Amadori化合物的快速分離和定性，同時還分析了干番茄和杏子等中的Amadori化合物。2013年，王紅瑞等［10］建立了HPLC-MS/MS同時測定煙草中5種Amadori化合物的方法，樣品經(jīng)含5%（體積分?jǐn)?shù)）甲醇的水提取后，采用Waters XBridgeTMAmide色譜柱以甲醇-水為流動相進(jìn)行分離，采用多反應(yīng)監(jiān)測（Multireaction monitor，MRM）模式檢測。HPLCMS/MS技術(shù)的引入極大提高了Amadori化合物定性及定量的準(zhǔn)確度。由于Amadori化合物純品難以獲得，截止到2016年底，文獻(xiàn)報道的同時定量測定煙草中Amadori化合物方法的指標(biāo)均少于6種。本研究組在2017年針對可獲得標(biāo)樣的10種葡萄糖型Amadori化合物，系統(tǒng)優(yōu)化了色譜分離條件及質(zhì)譜檢測參數(shù)，建立了同時測定煙葉中這10種Amadori化合物的HPLC-MS/MS方法［12］。然而實際上，煙草以及其他植物體內(nèi)存在的氨基酸種類大于20種，理論上也應(yīng)存在20余種Amadori化合物，但受限于標(biāo)樣種類，目前仍未掌握煙草中葡萄糖型Amadori化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的總貌。

高效液相色譜-四極桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜（HPLC-Q-TOF-MS）技術(shù)基于高分辨率精確質(zhì)量數(shù)匹配，能極大提高未知化合物定性的準(zhǔn)確性［14-15］。因此，在前期研究［12］的基礎(chǔ)上，針對其他12種無標(biāo)樣的葡萄糖型Amadori化合物，采用文獻(xiàn)［9,14］的方法進(jìn)行合成，通過HPLC-Q-TOF-MS對模型體系中12種Amadori化合物進(jìn)行一級精確質(zhì)量數(shù)及二級碎片離子掃描，確定定性及定量離子對；繼而基于HPLC-MS/MS對10種具有標(biāo)樣的Amadori化合物進(jìn)行外標(biāo)定量測定，對12種無標(biāo)樣的采用保留時間及結(jié)構(gòu)較為近似的Amadori標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線近似定量，實現(xiàn)了22種Amadori化合物的同時快速測定，旨在為測定不同類型煙葉Amadori化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)提供方法參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

葡 萄 糖 胺（Glucosamine，98.0%，美 國Alfa Aesar公司）；1-脫 氧-1-L-丙氨酸-D-果糖（Fru-Ala,98.0%）、1-脫氧-1-L-纈氨酸-D-果糖（Fru-Val,98.0%）、1-脫氧-1-L-脯氨酸-D-果糖（Fru-Pro,98.0%）、1-脫氧-1-L-苯丙氨酸-D-果糖（Fru-Phe,98.0%）、l-脫氧-1-L-色氨酸-D-果糖（Fru-Trp,98.0%）、1-脫氧-1-L-異亮氨酸-D-果糖（Fru-Ile,95.0%）、1-脫氧-1-L-亮氨酸-D-果糖（Fru-Leu,95.0%）、1-脫氧-1-L-天冬酰胺-D-果糖（Fru-Asn,97.0%）、1-脫氧-1-L-谷氨酸-D-果糖（Fru-Glu,98.0%）（加拿大TRC公司）；葡萄糖（99.5%）、γ-氨基丁酸（GABA，99.0%）、L-精氨酸（98.0%）、天冬氨酸（98.0%）、半胱氨酸（99.0%）、谷氨酰胺（99.0%）、甘氨酸（99.0%）、L-組氨酸（99.0%）、賴氨酸（98.0%）、蛋氨酸（99.0%）、L-絲氨酸（99.0%）、L-蘇氨酸（99.0%）和L-酪氨酸（99.0 %）（北京百靈威科技有限公司）；甲醇和乙腈（色譜純）、甲酸（≥96.0%）（美國Sigma公司）。

3種白肋煙樣品產(chǎn)自湖北恩施、重慶；2種香料煙樣品產(chǎn)自云南保山、湖北十堰；18種C3F等級烤煙樣品，分別產(chǎn)自云南宜良、云南師宗、云南寧洱、福建永定、貴州興仁、四川會理、河南寶豐、廣東南雄、安徽宣州、湖南桂陽、湖南江華、江西信豐、貴州黔西、貴州貴定、貴州德江、湖北利川、湖北彭水和山東蒙陰。所有煙葉樣品均為2016年產(chǎn)，涵蓋濃、中、清香型。

1200液相色譜儀（美國Agilent公司）和AB Sciex Triple TOF TM 4600質(zhì)譜系統(tǒng)（美國Applied Biosystems公司）；API5500三重四極桿串接質(zhì)譜系統(tǒng)（美國Applied Biosystems公司）；Atlantis T3液相色譜柱（2.1 mm×250 mm，5μm，美國Waters公司）；0.45μm有機(jī)濾膜（上海安譜實驗科技股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)樣Amadori化合物模型反應(yīng)體系

按照葡萄糖和氨基酸摩爾比2:1的比例，在12個250 mL圓底燒瓶中分別稱取100 mmol葡萄糖和50 mmol的1種氨基酸（12個圓底瓶中加入氨基酸均不相同），加入100 mL甲醇，64℃加熱回流80 min，然后將反應(yīng)體系置于冷水浴中以終止反應(yīng)。取約30 mL混合液于離心管中，10 000 r/min離心10 min，取約20 mL上清液，過有機(jī)濾膜，得到12種含有對應(yīng)Amadori化合物的濾液，即：1-脫氧-1-L-γ-氨基丁酸-D-果糖（Fru-GABA）、1-脫氧-1-L-精氨酸-D-果糖（Fru-Arg）、1-脫氧-1-L-天冬氨酸-D-果糖（Fru-Asp）、1-脫氧-1-L-半胱氨酸-D-果糖（Fru-Cys）、1-脫氧-1-L-谷氨酰胺-D-果糖（Fru-Gln）、1-脫氧-1-L-甘氨酸-D-果糖（Fru-Gly）、1-脫 氧-1-L-組 氨 酸-D-果 糖（Fru-His）、1-脫 氧-1-L-賴 氨 酸-D-果 糖（Fru-Lys）、1-脫 氧-1-L-蛋 氨 酸-D-果 糖（Fru-Met）、1-脫 氧-1-L-絲 氨 酸-D-果 糖（Fru-Ser）、1-脫 氧-1-L-蘇 氨 酸-D-果 糖（Fru-Thr）、1-脫 氧-1-L-酪 氨 酸-D-果 糖（Fru-Tyr）。將得到的濾液按1:1 000的比例用30%（體積分?jǐn)?shù)）的甲醇-水溶液稀釋后，采用HPLC-Q-TOF-MS法進(jìn)行定性分析。

1.2.2 煙葉樣品前處理

將實驗所用煙葉樣品在室溫下晾干后，采用YC/T 31—1996［18］的方法測定其含水率。將煙葉樣品研磨成粉，過孔徑380μm（40目）標(biāo)準(zhǔn)篩。稱取1 g（精確至0.01 g）煙末，加入30 mL 30%的甲醇-水溶液，超聲萃取25 min后，10 000 r/min離心5 min。上清液過有機(jī)濾膜，取50μL于10 mL容量瓶中，以甲醇定容，取1 mL進(jìn)行HPLC-MS/MS分析；取500μL萃取液濾液用甲醇定容至10 mL，然后取1 mL于色譜瓶中，用于Fru-Arg、Fru-Lys等低質(zhì)量分?jǐn)?shù)Amadori化合物（＜100μg/g）的定量分析。

（1）HPLC-Q-TOF-MS條件。色譜柱：Atlantis T3液相柱；進(jìn)樣量：5μL；流動相：0.2%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）甲酸水溶液（A相）和乙腈（B相）；梯度洗脫程序：0～0.1 min 89.5% A～78.0% A，0.1～10.0 min 78.0%A。每兩個樣品之間用初始流動相平衡8 min。離子噴霧電壓：5 500 V；去簇電壓（DP）：80 V；碰撞電壓（CE）：10 V；離子源溫度：450℃；氣簾氣（CUR）壓力：206.8 kPa；霧化氣（GS1）壓力：241.3 kPa；輔助氣（GS2）壓力：206.8 kPa；離子化方式：正離子；掃描方式：TOF/Production。

（2）HPLC-MS/MS條件。色譜條件同HPLCQ-TOF-MS。離子源：電噴霧（ESI）；質(zhì)譜信號采集模式：多反應(yīng)監(jiān)測正離子模式；噴霧電壓：5 500 V；離子源溫度：550℃；氣簾氣壓力：137.9 kPa；霧化氣壓力：513.6 kPa；干燥氣壓力：517.1 kPa；碰撞氣壓力：962.1 kPa。

1.2.3 22種Amadori化合物的定量分析

采用外標(biāo)法對10種有標(biāo)樣的Amadori化合物 進(jìn) 行HPLC-MS/MS定 量 分 析［12］，除Fru-Pro和Fru-Asn外的標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍為5.00×10-3～1.00μg/mL，F(xiàn)ru-Pro和Fru-Asn均 為5.00×10-2～10.0μg/mL。

對12種無標(biāo)樣的Amadori化合物，在Q-TOF準(zhǔn)確定性的基礎(chǔ)上，設(shè)定HPLC-MS/MS二級質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行測定，并依據(jù)有標(biāo)準(zhǔn)品的Amadori化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。而12種無標(biāo)樣的Amadori化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線的選取，原則上采用與其保留時間相近、峰面積近似的Amadori化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線。由于烤煙、白肋煙和香料煙3種不同煙草基質(zhì)中Amadori化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)相差較大，因此對12種Amadori化合物定量所選取的標(biāo)準(zhǔn)曲線也存在一些差異，具體選擇方案見表1。煙葉中Amadori化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)是以煙葉干質(zhì)量（扣除水分）為基礎(chǔ)表示的。

表1 無標(biāo)樣Amadori化合物定量曲線的選擇Tab.1 Selection of calibration curves for Amadori compounds without standard reagents

1.2.4 葡萄糖、果糖、氨基酸的檢測

參考YC/T 251—2008［16］的方法檢測葡萄糖和果糖；參考YC/T 282—2009［17］的方法檢測氨基酸。

2 結(jié)果與討論

2.1 無標(biāo)樣Amadori化合物的定性分析

在前期研究［12］中，針對10種Amadori化合物，系統(tǒng)比較了4種液相色譜柱，確定使用Atlantis T3液相色譜柱并優(yōu)化了色譜及三重四極桿質(zhì)譜檢測參數(shù)。本研究中采用了相同色譜方法，優(yōu)化了Q-TOF質(zhì)譜參數(shù)。分別將12種模型體系合成的Amadori化合物進(jìn)行HPLC-Q-TOF-MS分析，數(shù)據(jù)處理使用Peak View 2.0軟件，采用目標(biāo)物和非目標(biāo)物數(shù)據(jù)處理模式，參數(shù)為提取離子流強(qiáng)度＞2 000或信噪比＞3；峰寬0.5 Da，保留時間寬度0.2 min。由于12種Amadori化合物的結(jié)構(gòu)及分子式已知，直接將其分別輸入數(shù)據(jù)處理軟件，得到對應(yīng)Amadori化合物的定性參數(shù)，包括色譜峰、保留時間、精確質(zhì)量數(shù)、質(zhì)量誤差及二級碎片離子。以Fru-GABA為例，其分子式為C10H19NO7，精確質(zhì)量數(shù)為265.116 2，［M+H］+為266.124 0，檢測到的Fru-GABA化合物的保留時間為3.96 min，［M+H］+為266.124 2，其質(zhì)量誤差為0.000 2 Da，準(zhǔn)確度較高。二級碎片離子斷裂方式與Fru-GABA結(jié)構(gòu)理論斷裂方式及具有相似化學(xué)結(jié)構(gòu)的其他標(biāo)準(zhǔn)品保持一致?？梢源_定葡萄糖與氨基丁酸模型反應(yīng)體系中含有Fru-GABA。與此同時，在上述數(shù)據(jù)處理參數(shù)下共有214種化合物被檢出，由此可見，僅美拉德模型體系所生成的產(chǎn)物就極其復(fù)雜。采用相同方式，最終得到了12種Amadori化合物的定性參數(shù)，見表2。可知，檢測到的12種Amadori化合物的精確質(zhì)量數(shù)與理論值誤差不大于0.000 8 Da，且其二級碎片即斷裂方式與以往文獻(xiàn)報道及其他10種Amadori標(biāo)準(zhǔn)品相似，證明模型反應(yīng)體系中含有對應(yīng)的Amadori化合物。

2.2 22種Amadori化合物定量方法的建立

對表2中12種Amadori化合物進(jìn)行HPLC-QTOF-MS二級質(zhì)譜分析，確定了12種Amadori化合物的離子對，22種（包括有標(biāo)樣的10種）Amadori化合物的離子對信息見表3。將12種含有對應(yīng)Amadori化合物的模型反應(yīng)溶液與10種Amadori化合物標(biāo)樣混合，在HPLC-MS/MS的MRM模式下檢測22種Amdori化合物，同時測定煙草基質(zhì)樣品的22種Amdori化合物（圖1和圖2）?？芍瑹煵葜袡z測到的22種Amadori化合物，在保留時間、定性離子對及定量離子對比例方面與對應(yīng)模型反應(yīng)及標(biāo)準(zhǔn)品高度一致。

表2 12種模型反應(yīng)體系中Amadori化合物的定性參數(shù)Tab.2 Qualitative parameters of the Amadori compounds identified in the 12 model Maillard reaction mixtures

表3 22種Amadori化合物的二級質(zhì)譜參數(shù)Tab.3 MS/MS parameters for 22 Amadori compounds

圖1 基于HPLC-MS/MS的煙草樣品中10種有標(biāo)準(zhǔn)品的Amadori化合物的MRM譜圖Fig.1 MRM chromatograms of 10 Amadori compounds with available standard reagents in tobacco sample using HPLC-MS/MS

圖2 基于HPLC-MS/MS的煙草樣品中12種無標(biāo)準(zhǔn)品的Amadori化合物的MRM譜圖Fig.2 MRM chromatograms of 12 Amadori compounds without available standard reagents in tobacco sample using HPLC-MS/MS

本研究組在前期的研究［12］中，對10種具有標(biāo)樣的化合物建立了外標(biāo)定量方法，并進(jìn)行了方法學(xué)驗證：10種Amadori化合物線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)在0.997 7～0.999 9之間，檢測限和定量限分別為1.35～2.53和4.52～8.44 ng/mL，回收率為84.9%～120.3%，日內(nèi)精密度為1.33%～5.40%。本研究中重點(diǎn)考察了在大批量樣品分析（儀器連續(xù)進(jìn)行煙草樣品測試6 d，進(jìn)樣超過300針）時，22種Amadori化合物的日內(nèi)及日間精密度：在同一天內(nèi)，對同一烤煙煙葉樣品進(jìn)行6次平行測定以確定日內(nèi)精密度；在連續(xù)6 d內(nèi)，每日均對同一烤煙煙葉進(jìn)行單次測定，6 d測試結(jié)果的精密度即為日間精密度。由表4可知：①22個Amadori化合物中，18個化合物的日內(nèi)精密度＜10%，14個日間精密度＜10%，5個日間精密度在10%～15%之間；②Fru-Glu與Fru-Gln的精密度較差，這可能與其在醇溶液中易分解有關(guān)；③Fru-Lys、Fru-Met和Fru-Cys由于其質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低，接近定量限，造成精密度較差。

表4 22種Amadori化合物的日內(nèi)和日間精密度（n=6）Tab.4 Intra-and inter-day precisions for the 22 Amadori compounds（n=6） （%）

2.3 不同類型煙葉Amadori化合物分析

采用不同類型煙葉樣品中22種Amadori化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，其得分圖如圖3所示。可知，3種類型煙葉可以按照Amadori化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著區(qū)分為3個區(qū)域。說明不同類型煙葉的Amadori化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平、比例分布上存在顯著差異。分別對實驗所測3種白肋煙、2種香料煙及18種烤煙煙葉中各Amadori化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)求平均值。由表5可知，不同類型煙草Amadori化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)相差很大，其中烤煙最多，約占煙葉干質(zhì)量的2.47%；香料煙次之，約占煙葉干質(zhì)量的1.70%；白肋煙僅占0.14%。另外，不同類型煙草中不同Amadori化合物質(zhì)量百分比大小排序不同，白肋煙中質(zhì)量百分比較高的前8位按從大到小排序為葡萄糖胺、Fru-Asn、Fru-Asp、Fru-Gln、Fru-Pro、Fru-GABA、Fru-Ala、Fru-Glu，質(zhì)量百分比分別為18.2%、16.9%、13.8%、13.4%、9.3%、6.9%、4.9%、4.6%，共計88.0%；香料煙中質(zhì)量百分比較高的前8位按從大到小的排序為Fru-Pro、Fru-Asn、Fru-Gln、Fru-Ala、Fru-GABA、葡萄糖胺、Fru-Asp、Fru-Phe，質(zhì)量百分比分別為18.7%、16.2%、15.2%、11.4%、9.4%、9.1%、5.5%、3.0%，共計88.5%；烤煙中較高的前8位從大到小的排序為Fru-Pro、Fru-Asn、Fru-Ala、Fru-GABA、Fru-Gln、Fru-Asp、Fru-Glu、Fru-Phe，質(zhì)量百分比分別為34.8%、18.1%、12.0%、8.1%、6.8%、4.7%、2.7%、2.2%，共 計89.4%。不 同 類 型 煙 葉 中Amadori化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的差異可能由煙葉中反應(yīng)物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、工藝加工方式等因素共同決定。

圖3 不同類型煙葉樣品Amadori化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)主成分分析得分圖Fig.3 Mass fraction PCA score plot for Amadori compounds in tobacco leaves of different types

表5 不同類型煙葉Amadori化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Tab.5 Contents of Amadori compounds in tobacco leaves of different types （μg·g-1）

煙草中氨基酸、果糖和葡萄糖的測定結(jié)果表明，烤煙中氨基酸的量與香料煙相近，但烤煙中葡萄糖和果糖的量（約18%）高于香料煙（約10%）；白肋煙中氨基酸的量遠(yuǎn)大于烤煙和香料煙，但幾乎不含葡萄糖和果糖［19］。為了便于討論，分別對烤煙、香料煙和白肋煙中各Amadori化合物的量（μg/g）與對應(yīng)的氨基酸的量（μg/g）做商，結(jié)果如表6所示?？梢?，不同類型煙草中，各Amadori化合物的量與氨基酸的量的比值差異較大，表明美拉德反應(yīng)在不同類型煙草中進(jìn)行程度差異較大。其中，烤煙中各氨基酸轉(zhuǎn)化成對應(yīng)Amadori化合物的比例最高，其次是香料煙，白肋煙最低。例如，對于Fru-Ala/Ala，烤煙約為香料煙的6倍，約為白肋煙的160倍。這樣大的差異是由美拉德反應(yīng)動力學(xué)決定的，與不同類型煙草中反應(yīng)物（即葡萄糖、果糖和氨基酸的量）緊密相關(guān)，也與影響反應(yīng)動力學(xué)的因素相關(guān)，例如，不同類型煙葉的調(diào)制、陳化及工藝加工方式。

表6 不同類型煙草中Amadori化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)與氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的比值Tab.6 Ratios between contents of Amadori compounds and contents of the related amino acids in tobacco leaves of different types

3 結(jié)論

①建立了10種有標(biāo)準(zhǔn)品的Amadori化合物與12種無標(biāo)樣的Amadori化合物的HPLC-MS/MS同時測定方法；②連續(xù)6 d測試中，14個Amadori化合物的日間精密度＜10%，5個Amadori化合物的日間精密度在10%～15%之間；③烤煙、香料煙、白肋煙樣品中Amadori化合物總量的質(zhì)量百分比分別為2.47%、1.70%和0.14%。