幾種煙葉致香成分對(duì)煙草甲的引誘活性分析

鐘尚上，茍春苗，馬建勛，孫倩，黃蘭，程新勝*

1.中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)煙草與健康研究中心，合肥市徽州大道1129號(hào)230051

2.四川省煙葉復(fù)烤有限責(zé)任公司，成都市高新區(qū)世紀(jì)城路936號(hào)610041

3.華環(huán)國(guó)際煙草有限公司，安徽省鳳陽(yáng)縣門(mén)臺(tái)工業(yè)園區(qū)233121

4.安徽中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，合肥市高新區(qū)天達(dá)路9號(hào)230088

煙草甲［Lasioderma serricorne（Fabricius）］屬鞘翅目竊蠹科，是重要的倉(cāng)儲(chǔ)害蟲(chóng)之一［1-2］。可為害豆類(lèi)、茶葉、谷物、中草藥、書(shū)籍、皮革及家具等［3-5］，有報(bào)道在不同類(lèi)型超市、牙科診所已監(jiān)測(cè)到煙草甲［6-7］，甚至在幼兒腸道排泄物中也發(fā)現(xiàn)煙草甲［8］。煙草甲宿主廣泛，可為害多種倉(cāng)儲(chǔ)物，嚴(yán)重為害煙草及其制品［9］。目前有關(guān)煙草甲化學(xué)生態(tài)學(xué)方面的研究多集中在驅(qū)避劑選擇上［10-14］。呂建華等［15］采用Y型嗅覺(jué)儀就臭椿樹(shù)皮、蛇床子、高良姜根莖、木香薷、蒼耳子、桂皮、艾葉、煙葉和全麥粉等植物材料對(duì)煙草甲成蟲(chóng)選擇行為進(jìn)行了試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)煙葉、全麥粉、蒼耳子、蛇床子對(duì)煙草甲成蟲(chóng)有較強(qiáng)的引誘作用。趙艷珍等［16］研究提出，辣椒、花椒、陳皮、香葉、白豆蔻、甘草、當(dāng)歸、白芷、羅漢果和綠茶等10種具有不同氣味特征的植物樣品對(duì)煙草甲成蟲(chóng)誘集能力不同，辣椒、羅漢果、白芷、綠茶粉末對(duì)煙草甲成蟲(chóng)的引誘活性較高，引誘指數(shù)均在45%以上。孟國(guó)玲等［17］試驗(yàn)表明，煙草甲傾向于選擇可溶性總糖和石油醚提取物含量較高且纖維素含量較低的煙葉，在這種類(lèi)型的煙葉上產(chǎn)卵、取食，導(dǎo)致可溶性總糖和石油醚提取物含量較高的中高檔煙葉在倉(cāng)庫(kù)中更容易受到煙草甲的為害。前人研究表明，煙葉對(duì)煙草甲有較強(qiáng)的誘集作用且與煙葉中化學(xué)成分有關(guān)，但與何種化學(xué)成分相關(guān)并不明確。為此，選取二氫獼猴桃內(nèi)酯、β-大馬酮、異戊二烯、麥芽酚、2,3,5,6-四甲基吡嗪、5-甲基糠醛、異戊酸、3-甲基戊酸、新植二烯、煙堿等10種具有代表性［18-20］的煙葉致香物質(zhì)進(jìn)行了煙草甲選擇行為比較試驗(yàn)，旨在明確煙葉誘集煙草甲的具體化學(xué)物質(zhì)，為煙草甲的綜合控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

1.1.1 試驗(yàn)材料

供試煙草甲為中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)煙草與健康研究中心實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的試驗(yàn)種群，飼養(yǎng)于人工氣候箱內(nèi)。飼養(yǎng)條件：光周期為16 L∶8 D（暗期在24：00至次日08：00）；光期溫度為（30±2）℃，暗期溫度為（28±2）℃；相對(duì)濕度為50%～70%；煙草甲蟲(chóng)以含有5%酵母粉的小麥粗全粉為飼料［21］。試驗(yàn)前將煙草甲的蛹從食料中挑出后，選取羽化5～8 d的成蟲(chóng)，試驗(yàn)前煙草甲成蟲(chóng)放入空瓶中饑餓處理12 h，備用，供試后的煙草甲均使用1次。

白肋煙、雪茄煙葉、香料煙、曬紅煙、烤煙（安徽）、烤煙（福建）、烤煙（四川）、烤煙（云南），均由安徽中煙有限責(zé)任公司提供。煙葉相關(guān)信息見(jiàn)表1。雪茄煙葉為茄衣葉，其余類(lèi)型煙葉均為打葉后的片煙，等級(jí)為復(fù)烤后企業(yè)標(biāo)注的等級(jí)。

表1 供試煙葉信息Tab.1 Information on tested tobacco leaves

1.1.2 試劑與儀器

二氫獼猴桃內(nèi)酯、β-大馬酮、異戊二烯、麥芽酚、2,3,5,6-四甲基吡嗪、5-甲基糠醛、異戊酸、3-甲基戊酸、新植二烯、異丙醇均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥商城；煙堿由安徽中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心提供。

方形煙草甲選擇儀、改進(jìn)型Y型嗅覺(jué)儀（均由本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)，中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)玻璃廠吹制）；FA1004電子分析天平（感量0.000 1 g，上海精密科學(xué)儀器有限公司）；可調(diào)式移液槍?zhuān)砍?0～100μL，國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司）；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州市長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；SZ-93A自動(dòng)雙重純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠）；微型玻璃轉(zhuǎn)子流量計(jì)（上海儀川儀表廠）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 煙葉化學(xué)物質(zhì)的選擇

根據(jù)致香物和香氣前體物的關(guān)系［22］，煙葉致香成分主要源于：①質(zhì)體色素、西柏三烯類(lèi)等大分子化合物降解；②類(lèi)酯的代謝產(chǎn)物；③美拉德反應(yīng)產(chǎn)物；④生物堿及其轉(zhuǎn)化物。以物質(zhì)類(lèi)型、煙葉中含量為考量，選取10種（表2）具有代表性的致香物質(zhì)，均使用異丙醇稀釋至體積分?jǐn)?shù)0.5%。

表2 致香物質(zhì)及來(lái)源Tab.2 Aroma components and their sources

1.2.2 煙葉致香成分對(duì)煙草甲的引誘效果

根據(jù)煙草甲有進(jìn)入狹窄空間的傾向等行為學(xué)特點(diǎn)［23］，同時(shí)為便于煙草甲試蟲(chóng)的投放與觀察，試驗(yàn)中自行設(shè)計(jì)了Y型嗅覺(jué)儀（圖1D），整個(gè)測(cè)試裝置構(gòu)成見(jiàn)圖1。在溫度（28±2）℃，相對(duì)濕度50%～70%的潔凈房間中進(jìn)行試驗(yàn)。為防止光線的干擾，窗簾緊閉，且在Y型嗅覺(jué)儀上方放置1盞白色熒光燈（40 W）以保證光照強(qiáng)度一致。裝置連接完成后，將15 mm×20 mm濾紙條放入氣味源瓶（圖1C）中，將20μL稀釋后的致香物質(zhì)試劑及對(duì)照異丙醇分別滴加到不同氣味源瓶的濾紙片上。將濾紙對(duì)折后從Y型嗅覺(jué)儀（圖1D）瓶口處探入，使用毛筆將已經(jīng)饑餓處理的煙草甲成蟲(chóng)順著濾紙折痕輕輕掃入Y型嗅覺(jué)儀中。打開(kāi)真空泵（圖1E），調(diào)節(jié)氣體流速為500 mL/min，空氣經(jīng)活性炭及帶蒸餾水的脫脂棉過(guò)濾并加濕（圖1B），兩股氣流分別流經(jīng)氣味源瓶后進(jìn)入Y型嗅覺(jué)儀。

圖1 Y型嗅覺(jué)儀測(cè)試裝置Fig.1 Y-tube olfactometer testing device

試驗(yàn)過(guò)程中，若試蟲(chóng)爬至管臂的泡漲處（圖1D）且活動(dòng)時(shí)間持續(xù)超過(guò)30 s，則記為該蟲(chóng)選擇該臂所連接的氣味源；若試蟲(chóng)釋放后，在30 min觀察時(shí)間內(nèi)沒(méi)有進(jìn)入與氣味源連接管臂或在泡漲處持續(xù)活動(dòng)時(shí)間未超過(guò)30 s，則視該試蟲(chóng)為對(duì)氣味源無(wú)選擇。每次試蟲(chóng)15頭、3次重復(fù)。每次測(cè)定后更換Y型嗅覺(jué)儀及氣味源瓶，Y型嗅覺(jué)儀及氣味源瓶清洗后，210℃條件下烘干備用。

參照Z(yǔ)hang等［11］行為反應(yīng)指數(shù)的計(jì)算方法，判斷不同味源間的差異。平均引誘活性指數(shù)RI的計(jì)算公式：

式中：Nt為處理支臂的煙草甲頭數(shù)；Nc為對(duì)照組支臂煙草甲頭數(shù)。

1.2.3 煙草甲對(duì)味源物質(zhì)的反應(yīng)

選取對(duì)煙草甲最具引誘活性的味源物質(zhì)，分別配制成1.0×10-2、1.0×10-3、1.0×10-4、1.0×10-5和1.0×10-6mol/L濃度的試劑，以測(cè)試不同濃度味源物質(zhì)對(duì)煙草甲的影響。參照文獻(xiàn)［24］中的方法，將直徑為120 mm的培養(yǎng)皿由中間均分為兩部分，對(duì)稱(chēng)放入直徑為15 mm的濾紙圓片，兩側(cè)圓片上分別加入20μL的待測(cè)味源物質(zhì)及對(duì)照異丙醇，放入10頭煙草甲于培養(yǎng)皿中間線上，封閉30 min后觀察煙草甲的分布狀況。每組重復(fù)3次。以選擇百分率表示煙草甲的選擇性，計(jì)算公式［25］：

式中：CI為選擇百分率，%；Lt為選擇味源的煙草甲頭數(shù)；La為投入的煙草甲總頭數(shù)。

1.2.4 煙草甲對(duì)不同類(lèi)型煙葉的選擇性

當(dāng)不同倉(cāng)儲(chǔ)物品進(jìn)入1個(gè)倉(cāng)庫(kù)時(shí)，煙草甲會(huì)發(fā)生遷移，在不同的倉(cāng)儲(chǔ)商品上重新分布［26］，這可能是因?yàn)椴煌唐穼?duì)煙草甲誘集能力不同所致。為測(cè)定煙草甲對(duì)不同倉(cāng)儲(chǔ)物的自主選擇行為，設(shè)計(jì)了方形模擬環(huán)境裝置。裝置設(shè)計(jì)主要依據(jù)煙草甲的個(gè)體大小，為減少氣流擾動(dòng)對(duì)試驗(yàn)帶來(lái)的誤差，其上有一磨砂玻璃蓋片，見(jiàn)圖2。同時(shí)，考慮煙草甲晝伏夜出的特點(diǎn)，測(cè)試時(shí)間選在夜間進(jìn)行。選擇試驗(yàn)分為5組，見(jiàn)表3。

圖2 方形煙草甲選擇儀平面圖Fig.2 Square plan of selection behavior testing instrument for L.serricorne

表3 煙葉類(lèi)型選擇試驗(yàn)分組Tab.3 Grouping of tobacco leaves for tobacco type selection test

煙葉樣品均取葉片中部，剪成1 cm長(zhǎng)條狀，每份供試煙葉均為10 g。用指形管選取羽化后成蟲(chóng)12只，12 h饑餓處理后放入方形嗅覺(jué)儀投放區(qū)。8 h后（1個(gè)晚上）統(tǒng)計(jì)煙草甲分布狀況，煙草甲進(jìn)入A、B、C和D區(qū)域內(nèi)視為煙草甲選擇了該區(qū)域的煙葉，未進(jìn)入A、B、C和D區(qū)域視為未作出選擇。每組試驗(yàn)重復(fù)5次，每次試驗(yàn)前將方形選擇儀打開(kāi)，用毛刷清除煙葉殘余粉塵并使用抹布徹底清潔方形嗅覺(jué)儀各區(qū)域，并用電吹風(fēng)機(jī)吹掃后在通風(fēng)環(huán)境下放置4 h使氣味散盡。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 25進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。利用Origin 2016軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙葉致香成分對(duì)煙草甲的引誘活性

煙草甲對(duì)于不同煙葉致香成分的行為響應(yīng)見(jiàn)表4，不同致香物質(zhì)對(duì)煙草甲平均引誘指數(shù)見(jiàn)圖3?？梢钥闯?，二氫獼猴桃內(nèi)酯、β-大馬酮、2,3,5,6-四甲基吡嗪、煙堿均對(duì)煙草甲表現(xiàn)出較強(qiáng)的引誘活性，其中以2,3,5,6-四甲基吡嗪引誘煙草甲數(shù)量最多，與對(duì)照間差異達(dá)到顯著水平。從圖3可見(jiàn)，2,3,5,6-四甲基吡嗪對(duì)煙草甲的引誘指數(shù)達(dá)86.67%；煙堿次之，二氫獼猴桃內(nèi)酯、β-大馬酮再次之，引誘指數(shù)分別為69.23%、50%和50%。10種煙葉致香物質(zhì)中，麥芽酚的引誘活性最小，引誘指數(shù)為0。

表4 煙草甲成蟲(chóng)對(duì)不同煙葉致香成分的行為響應(yīng)①Tab.4 Behavioral response of L.serricorne adults to different aroma components in tobacco leaves

圖3 不同煙葉致香成分對(duì)煙草甲的平均引誘指數(shù)Fig.3 Average attractive indexes of different aroma components to L.serricorne

2.2 煙草甲對(duì)不同濃度氣味源物質(zhì)的反應(yīng)

通過(guò)氣味源物質(zhì)Y型嗅覺(jué)儀測(cè)定可知，2,3,5,6-四甲基吡嗪對(duì)煙草甲的誘集能力最強(qiáng)，故用培養(yǎng)皿法進(jìn)行了不同濃度2,3,5,6-四甲基吡嗪對(duì)煙草甲的影響試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可見(jiàn)，濃度為1.0×10-3mol/L時(shí)，煙草甲對(duì)2,3,5,6-四甲基吡嗪的選擇百分率最高，達(dá)80%。在最高濃度為1.0×10-2mol/L時(shí)，選擇百分率僅為66.67%。

表5 煙草甲對(duì)不同濃度味源的選擇性Tab.5 Select percentage of L.serricorne to odor sources with different concentrations

2.3 煙草甲對(duì)不同類(lèi)型煙葉的選擇性

煙草甲對(duì)不同類(lèi)型及不同產(chǎn)地?zé)熑~的選擇性見(jiàn)圖4。圖4 A中香料煙與烤煙對(duì)煙草甲的吸引力明顯大于白肋煙與雪茄煙葉；而圖4B中顯示，烤煙與曬紅煙對(duì)煙草甲的吸引力較高；圖4C表明，烤煙與香料煙吸引力較高；圖4D表明，烤煙與曬紅煙的吸引力大于白肋煙與雪茄煙葉。總體來(lái)看，與白肋煙和雪茄煙葉相比，煙草甲更喜歡選擇烤煙、香料煙和曬紅煙，且對(duì)于烤煙的選擇性最強(qiáng)。圖4E表明，煙草甲對(duì)不同產(chǎn)地等級(jí)的烤煙選擇性差異不大，相對(duì)而言?xún)H對(duì)福建產(chǎn)區(qū)烤煙的選擇性略低。

圖4 煙草甲對(duì)不同類(lèi)型煙葉的選擇性比較Fig.4 Comparison of selectivity of L.serricorne to different types of tobacco leaves

3 討論

本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，2,3,5,6-四甲基吡嗪對(duì)煙草甲的引誘活性最強(qiáng)，說(shuō)明吡嗪類(lèi)物質(zhì)對(duì)煙草甲成蟲(chóng)的選擇性影響較大。吡嗪類(lèi)物質(zhì)主要來(lái)源于Mailard反應(yīng)，是該類(lèi)反應(yīng)中最具香味價(jià)值的成分之一［27］。Wahlberg等［19］提出烤煙在烘烤與陳化過(guò)程中發(fā)生一系列化學(xué)變化，在此期間吡嗪類(lèi)、吡咯類(lèi)及吡啶類(lèi)成分含量顯著增加，而石倩倩等［28］研究認(rèn)為2,3,5,6-四甲基吡嗪在烤煙中含量明顯高于白肋煙等類(lèi)型的煙葉，本試驗(yàn)中也證明不同類(lèi)型煙葉中烤煙對(duì)煙草甲的吸引力最強(qiáng)。說(shuō)明煙草中的2,3,5,6-四甲基吡嗪等香味成分在煙草甲侵入烤煙煙葉過(guò)程中起著重要作用，2,3,5,6-四甲基吡嗪等煙草香味成分在不同類(lèi)型煙葉中含量差異可能會(huì)影響到煙草甲的趨性［29-30］。

通過(guò)對(duì)不同濃度2,3,5,6-四甲基吡嗪對(duì)煙草甲引誘活性測(cè)定表明，煙草甲對(duì)不同濃度的2,3,5,6-四甲基吡嗪均表現(xiàn)出一定的選擇性，但濃度為1.0×10-3mol/L時(shí)，煙草甲對(duì)味源物選擇性最高，達(dá)到80.0%。濃度降低時(shí)，選擇性也降低。2,3,5,6-四甲基吡嗪為1.0×10-2mol/L時(shí)，煙草甲的選擇百分率僅為66.67%，表明香味物質(zhì)對(duì)煙草甲趨性影響有適宜的濃度范圍，這種情況也存在于煙草甲的驅(qū)避習(xí)性中。與Zhou等［31］報(bào)道的適宜濃度1,8-桉葉素對(duì)煙草甲的驅(qū)避作用研究結(jié)果一致。而有關(guān)煙葉致香物質(zhì)對(duì)煙草甲引誘活性的實(shí)際倉(cāng)儲(chǔ)應(yīng)用還有待進(jìn)一步深入試驗(yàn)。

4 結(jié)論

煙葉中的10種致香成分中，2,3,5,6-四甲基吡嗪對(duì)煙草甲的引誘活性最高，引誘活性指數(shù)86.67%，且在濃度為1.0×10-3mol/L時(shí)，其引誘活性最強(qiáng)；煙堿、二氫獼猴桃內(nèi)酯、β-大馬酮也表現(xiàn)出較強(qiáng)的引誘活性，引誘活性指數(shù)分別為69.23%、50%和50%。在供試的5種類(lèi)型煙葉中，煙草甲對(duì)于烤煙、香料煙、曬紅煙的趨性明顯高于雪茄煙葉和白肋煙，其中對(duì)烤煙的選擇性最強(qiáng)。