肌酸激酶在杜氏肌營養(yǎng)不良癥新生兒篩查中的應(yīng)用研究

許佳 牟凱 李雨雨 李洪俞 宋海波

摘要：目的 將肌酸激酶MM同工酶（ CK-MM）用于新生兒杜氏肌營養(yǎng)不良癥（DMD）篩查，為該病在魯中地區(qū)防治提供及時可靠的診斷依據(jù)。方法 收集男性新生兒濾紙干血片樣本10 376份，采用時間分辨熒光法檢測CK-MM，統(tǒng)計分析CK-MM值并設(shè)定需要進(jìn)行基因檢測的臨界值，對篩查陽性的樣本進(jìn)行DMD基因檢測。結(jié)果 時間分辨熒光法檢測CK-MM的批內(nèi)CV、批間CV和平均偏移均<10%，DMD患兒CK-MM濃度臨界值可設(shè)為700ng/mL。結(jié)論 以濾紙干血片為樣本檢測CK-MM篩查DMD患兒有區(qū)域差異，但檢測方法簡便，值得臨床推廣。

關(guān)鍵詞：杜氏肌營養(yǎng)不良癥;肌酸激酶同工酶;新生兒篩查;濾紙干血片

【中圖分類號】R272.1 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】1673-9026（2021）03-049-02

假性肥大型進(jìn)行性肌營養(yǎng)不良癥包括杜氏肌營養(yǎng)不良和貝克氏肌營養(yǎng)不良兩種臨床類型，二者是等位基因異質(zhì)性疾病，發(fā)病率分別為活產(chǎn)男嬰的1/3，500和1/30，000[1]，其中杜氏肌營養(yǎng)不良癥是肌

營養(yǎng)不良中最常見和最嚴(yán)重的類型，由于基因突變影響dystrophin蛋白在橫紋肌組織的表達(dá)，導(dǎo)致肢體近端骨骼肌進(jìn)行性萎縮，無力和腓腸肌假性肥大，典型表現(xiàn)為運(yùn)動發(fā)育遲緩，甚至倒退、特殊的“鴨步”步態(tài)，血清肌酸磷酸激酶（CK）活性升高，心肌細(xì)胞損傷。在DMD的情況下，早期使用皮質(zhì)類固醇進(jìn)行干預(yù)，在許多國家，包括中國，經(jīng)常延遲和不經(jīng)常使用皮質(zhì)類固醇，延長了行走時間，提高了生活質(zhì)量[1，2]。此外，對7歲以上的男孩進(jìn)行的研究性遺傳治療（例如，外顯子跳過）正在進(jìn)行第3階段臨床試驗(yàn)，該階段的臨床試驗(yàn)中使用了outcom。因此，新生兒篩查（NBS）對那些在生命早期就有資格接受這些治療的患者進(jìn)行鑒別是非常重要的。2012年，Mendell等人[3]報告了DMD-NBS的一種新的兩步方法，在新生兒干燥血斑上檢測肌酸磷酸激酶（CK），然后在CK升高的樣本上直接檢測DMD基因。這種方法為中國等國家提供了一個利用CK標(biāo)記物診斷DMD患者的機(jī)會。2019年7月，淄博市婦幼保健院在山東范圍內(nèi)率先啟用美國PE公司的全自動免疫熒光分析儀（GSP）和全自動打孔儀Panthera-Puncher 9系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)DMD項(xiàng)目打孔檢測自動化，在山東省范圍內(nèi)率先使用GSP開展新生兒男嬰的CK-MM的科研檢測項(xiàng)目。截止到2020年2月，我院共完成CK-MM檢測10376人次。

本文通過對在GSP上完成CK-MM篩查的10376人次數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，使用百分位數(shù)法和應(yīng)試者操作特征曲線（ROC）研究在GSP上DMD篩查的最佳CK-MM切值點(diǎn)。

1材料與方法

1.1研究材料

2019年7月-2020年1月全市范圍內(nèi)出生的活產(chǎn)男性新生兒10376例。新生兒在出生72小時后且7天內(nèi)，并經(jīng)充分哺乳6次以上，采集新生兒足跟血滴于S&S903濾紙上，自然干燥后于2-8℃冷藏，7天內(nèi)送達(dá)淄博市婦幼保健院新生兒疾病篩查中心實(shí)驗(yàn)室，標(biāo)本送達(dá)后5天內(nèi)完成檢測。

1.2檢測儀器與方法

采用全自動打孔儀Panthera-Puncher 9打血班，在PE公司的GSP上上機(jī)檢測;試劑為PE公司GSP配套CK-MM項(xiàng)目檢測試劑盒，采用時間分辨免疫熒光法（DELFIA）。

1.3實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制

檢測板為標(biāo)準(zhǔn) 96 孔微孔板，每板均設(shè)三個濃度的質(zhì)控品做為質(zhì)控物，每個質(zhì)控品測定一次。本新生兒疾病篩查中心實(shí)驗(yàn)室接受國家衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心新生兒疾病篩查實(shí)驗(yàn)室室間質(zhì)量評價，DMD項(xiàng)目作為調(diào)查項(xiàng)目，結(jié)果合格，室內(nèi)質(zhì)控結(jié)果統(tǒng)計如下：

1.4切值建立方法

使用IBM SPSS Statistics 21.0軟件運(yùn)用百分位數(shù)法和ROC曲線法進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2結(jié)果

2.1自2019年 7月至 2020 年2月，10376例男性新生兒CK-MM濃度呈偏態(tài)分布，其中有 5例CK-MM≥650ng/mL，占0.048%。經(jīng)重采血復(fù)查后，仍有1例CK-MM≥700ng/mL。

2.2 10376例新生兒樣本，其CK-MM初篩樣本基本情況見表2，其樣本濃度頻率分布見表3。CK-MM分布在9.1-1807.2 ng/mL，其中CK-MM濃度在新生兒中數(shù)的分布呈對數(shù)正態(tài)分布，具有較高的置信度（P<0.005）。觀察到中位數(shù)測量的CK-MM濃度隨著年齡的增長而逐漸降低，如表4。

2.3 兩次篩查結(jié)果CK-MM≥700ng/mL的患兒經(jīng)MLPA方法排除DMD基因突變，家屬拒絕進(jìn)一步的神經(jīng)肌肉疾病的診斷檢查。

3討論：

DMD是X連鎖隱性遺傳病，主要表現(xiàn)為進(jìn)行性對稱性骨骼肌無力和萎縮，至今無治愈手段，通常男性發(fā)病?；純撼錾鷷r常無癥狀，發(fā)病隱匿，大部分患兒坐、立時間發(fā)育正常。DMD患兒首先出現(xiàn)的癥狀多為行走緩慢，隨后出現(xiàn)四肢近端、軀干和骨盆帶肌肉無力、肌張力低，蹲起和上樓困難，因盆帶肌無力走路時腰椎前突并呈典型鴨步步態(tài)。DMD突變基因女性攜帶者90%以上為表型正常，僅表現(xiàn)為血清肌酶輕到中度升高，少數(shù)可有DMD癥狀。發(fā)病年齡也由幼年到成年后的40或50歲，臨床表現(xiàn)可輕重不等，從一般的肌痛、痙攣到嚴(yán)重的肌無力均可出現(xiàn)，一小部分合并擴(kuò)張型心肌病。淄博市2019年7月-2020年1月期間出生的男性嬰兒中未發(fā)現(xiàn)DMD患兒，這與王燕敏等[4]、楊小二等[5]報道有差異，新生兒DMD的發(fā)生存在地區(qū)差異。本研究由于局限于短期數(shù)據(jù)，尚不足以代表淄博地區(qū)整體的新生兒DMD發(fā)病情況，研究結(jié)論還有待于進(jìn)一步收集驗(yàn)證。

CK一直是DMD診斷的重要指標(biāo)，但CK濃度易受年齡、性別、 種族、地域、運(yùn)動狀態(tài)、疾病等多種因素的影響，且如何界定CK檢測值與DMD之間的關(guān)系尚無明確標(biāo)準(zhǔn)[6]。CK-MM是CK在骨骼肌中存在的主要同工酶形式，CK-MM作為骨骼肌損傷的指標(biāo)比CK更具特異性。而切值是篩查工作中診斷和治療的重要依據(jù)，篩查切值是否準(zhǔn)確直接影響篩查實(shí)驗(yàn)室的工作質(zhì)量，太高會引起漏診，太低會引起人力、物力的浪費(fèi)。國內(nèi)暫未形成新生兒DMD篩查標(biāo)準(zhǔn)，DMD陽性切值的合理設(shè)定是DMD篩查的關(guān)鍵同時也是難點(diǎn)，尤其是早產(chǎn)兒或低體重兒對切值是否像CAH篩查一樣存在顯著影響，使DMD篩查面臨極大的挑戰(zhàn)[7]。

Dystrophin蛋白有多種亞型，表達(dá)的部位不盡相同，且各自擁有不同的啟動子，不同類型DMD基因突變可以決定患者的表型特征。Dystrophin蛋白在多個組織和器官中行使重要功能，所以DMD可累及多個系統(tǒng)。隨著患兒年齡的增長，肌無力、呼吸功能不全、肌肉骨骼畸形以及心肌受累的程度均會逐漸加重。此外，DMD患者多合并認(rèn)知功能障礙、自閉癥譜系障礙和行為問題，但這些合并癥在疾病病程發(fā)展過程中進(jìn)展不明顯。

參考文獻(xiàn)

[1]Mendell JR，Shilling C，Leslie ND，et al.Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy [J]，2012，71：304-313

[2]Bushby K，F(xiàn)inkel R，Birnkrant DJ，et al.Diagnosis and management of Duchenne muscular dystrophy，part 2：implementation of multidisciplinary care[J].Lancet Neurol，2010，9：177-189.

[3]Mendell JR，Shilling C，Leslie ND，F(xiàn)lanigan KM，al-Dahhak R，Gastier-Foster J，et al.Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy.Ann Neurol 2012;71：304-313.

[4]王燕敏，田國力，紀(jì)偉，張瀟分.肌酸激酶MM同工酶在新生兒杜氏肌營養(yǎng)不良癥篩查中的應(yīng)用[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2020，35（11）：1115-1119.

[5]楊小二，俞菁，胡荷宇，章莉，孫黎，龔波.肌酸磷酸激酶檢測聯(lián)合分子診斷技術(shù)篩查新生兒杜氏肌營養(yǎng)不良癥[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2015，38（01）：32-34.

[6]柯青，張利.Duchenne型肌營養(yǎng)不良癥自然病程演變規(guī)律 [J].中國現(xiàn)代神經(jīng)疾病雜志，2015，15（5）：355-359.

[7]楊茹萊.杜氏肌營養(yǎng)不良臨床特點(diǎn)及診治進(jìn)展[J].中國兒童保健雜志，2018，26（03）：233-235.

本課題受1、山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計劃資助，項(xiàng)目編號為2016WS0740、2017WS044;2、受國家重點(diǎn)研發(fā)計劃資助，項(xiàng)目編號2018YFC0114703。

淄博市婦幼保健院 255000