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    大黃對腦出血大鼠的腦保護(hù)作用

    2021-04-23 01:07:10吳冬梅楊艷華崔應(yīng)麟
    關(guān)鍵詞:血清模型

    吳冬梅,趙 旭,汪 坤,楊艷華,崔應(yīng)麟

    1)河南省中醫(yī)院門診部 鄭州 450002 2)河南省中醫(yī)院藥學(xué)部 鄭州 450002 3)河南省中醫(yī)院腦病科 鄭州 450002

    腦出血(intracerebral hemorrhage,ICH)是指非外傷性腦實(shí)質(zhì)內(nèi)的自發(fā)性出血,具有高發(fā)病率、高致死率和高致殘率的特點(diǎn);ICH會引起腦血腫、腦水腫、顱內(nèi)壓升高、腦損傷等一系列病理生理過程,其中腦損傷是引起ICH患者致死和致殘的關(guān)鍵因素[1],而且腦損傷后會引起行為學(xué)的改變。目前,ICH后腦損傷的治療措施有低溫保護(hù)、人工冬眠療法,其目的在于降低腦的基礎(chǔ)代謝而延緩病情發(fā)展;常用的治療藥物有腦細(xì)胞營養(yǎng)修復(fù)藥物,包括神經(jīng)節(jié)苷脂、腦蛋白水解物(腦活素)和清除自由基藥物(依達(dá)拉奉),但以上藥物治療都屬于對癥治療[2]。中醫(yī)對ICH的病機(jī)、治法治則、用藥已經(jīng)形成了成熟的體系[3]。有臨床研究[4]提示,中藥治療ICH具有整體治療、副作用小等優(yōu)勢。因此尋求中醫(yī)藥治療ICH后繼發(fā)性腦損傷,對降低ICH致殘率、致死率具有重要意義。

    有文獻(xiàn)[5-6]報(bào)道,含大黃的方劑大承氣湯和大黃素對腦出血大鼠均具有一定的腦保護(hù)作用。課題組的前期研究[7]也發(fā)現(xiàn)以大黃為君藥的醒腦灌腸液對ICH模型大鼠具有顯著的腦保護(hù)作用,說明大黃在ICH治療中具有重要的應(yīng)用價(jià)值,但其作用機(jī)制尚不清楚。為此,課題組開展了如下研究,探討大黃對ICH模型大鼠的腦保護(hù)作用及機(jī)制,為大黃在ICH的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1實(shí)驗(yàn)動物和主要儀器雄性Wistar大鼠,共200只,體重250~300 g,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供,合格證號SCXK(京)2016-0011。ZH-藍(lán)星D型動物腦立體定位儀(安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司),CPA324S型電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司),生物顯微鏡(日本奧林巴斯公司),全自動酶標(biāo)儀[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]。DYCZ-24DN垂直電泳槽、DYY-7C電泳儀電源、DYCZ-40電轉(zhuǎn)儀(北京六一儀器廠),磁力攪拌器(江蘇金壇市中大儀器廠),HI650離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)。

    1.2主要試劑和藥物Ⅶ型膠原酶(美國Sigma公司),水合氯醛、多聚甲醛(北京索萊寶科技有限公司)、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na,天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司),依文思藍(lán)(Evans blue,EB;北京鼎國生物技術(shù)有限公司),RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司),谷胱甘肽(GSH)測試試劑盒(南京建成生物工程研究所)。兔抗人Nrf2抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司公司),TNF-α、IL-6、IL-4、IL-10和IFN-γ ELISA檢測試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技有限公司)。

    大黃購自安徽普仁中藥飲片有限公司(批號1808043),經(jīng)河南省中醫(yī)院黃小敏副主任藥師鑒定為蓼科植物藥用大黃的干燥根及根莖。大黃提取液的制備:體積分?jǐn)?shù)75%乙醇回流提取2次(100 mL,80 mL),每次1 h,合并提取液,過濾,濃縮至質(zhì)量濃度為0.9 g/mL。陽性對照藥安宮牛黃丸(北京同仁堂科技發(fā)展有限公司制藥廠,批號16011928),去除球殼,用5 g/L CMC-Na配制成含藥0.18 g/mL的混懸液。

    1.3ICH大鼠模型的制備參考文獻(xiàn)[5]方法采用膠原酶注射尾狀核法復(fù)制大鼠腦出血模型,Longa5級評分法評價(jià)模型是否成功。

    1.4分組及給藥實(shí)驗(yàn)分組為空白組、假手術(shù)組、ICH模型組、安宮牛黃丸組、大黃組,每組20只(200只大鼠分兩批進(jìn)行實(shí)驗(yàn),每批100只)。大鼠禁食24 h(避免大鼠頻繁排便,影響灌腸給藥),不禁水,清醒狀態(tài)下不固定(毛巾蓋住頭部使其保持安靜)進(jìn)行灌腸給藥;將導(dǎo)尿管插入大鼠直腸,深度不超過4 cm,后端連接注射器吸取藥物并1 mL/min推注水浴加溫至30 ℃的藥液。

    空白組(不造模,生理鹽水灌腸)、假手術(shù)組(按照ICH造模方法操作但不注射膠原酶,生理鹽水灌腸)、ICH模型組(造模,生理鹽水灌腸)、安宮牛黃丸組(造模,灌腸給藥安宮牛黃丸混懸液0.27 g/kg)、大黃組(造模,灌腸給藥大黃提取液3.60 g/kg)5個實(shí)驗(yàn)組,每組設(shè)4個時間點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)或取樣(每組每個時間點(diǎn)均為5只大鼠),各組動物灌腸1次/d。第一次灌腸后于12 h、24 h進(jìn)行實(shí)驗(yàn)或取樣,為12 h、24 h兩個檢測時間點(diǎn);剩余大鼠繼續(xù)給藥2 d后、6 d后實(shí)驗(yàn)或取樣,為3 d、7 d兩個檢測時間點(diǎn)。

    1.5EB法檢測ICH大鼠血腦屏障的通透性參考文獻(xiàn)[7]方法,按照1.4項(xiàng)的操作方法,分別于給藥后12 h、24 h、3 d、7 d 4個時間點(diǎn)腹腔注射體積分?jǐn)?shù)10%的水合氯醛(3 mL/kg)麻醉大鼠(第一批大鼠)并固定,然后按照4 mL/kg的劑量左側(cè)頸靜脈注射20 g/L EB,大鼠全身變藍(lán)后剖開胸腔,用注射針頭從左心尖插入肺動脈,固定針頭后剪開右心耳,生理鹽水沖洗右心耳直至流出液清澈,在冰盤上迅速斷頭取腦并自正中線切開,用濾紙吸干出血側(cè)腦組織表面的水分,稱腦組織的重量。腦組織放置于5倍體積的甲酰胺中,60 ℃水浴放置24 h,3 000 r/min離心10 min,取上清液,用分光光度計(jì)在620 nm處測定吸光度(以甲酰胺標(biāo)準(zhǔn)液做空白對照并做標(biāo)準(zhǔn)曲線),計(jì)算腦組織中EB含量(腦組織EB含量=樣品EB濃度/腦濕重)。

    1.6大鼠腦功能損傷程度評分采用改良的神經(jīng)功能損傷程度評分(modified neurological severity score,mNSS)對各組大鼠(第二批大鼠)腦損傷程度進(jìn)行評價(jià)[6]。按照1.4項(xiàng)的操作方法,分別于給藥后12 h、24 h、3 d、7 d 4個時間點(diǎn)記錄每只大鼠的mNSS得分,分析每組大鼠神經(jīng)功能損傷及恢復(fù)情況。

    1.7大鼠血清中TNF-α、IL-6、IFN-γ、IL-4、IL-10、GSH含量的ELISA 法檢測按照1.4項(xiàng)的操作方法,分別于給藥后12 h、24 h、3 d、7 d后4個時間點(diǎn)每組各取5只大鼠(第二批大鼠),腹主動脈取血,離心后取上層血清,采用ELISA法檢測大鼠血清中GSH、TNF-α、IL-6、IL-4、IL-10和IFN-γ含量,具體步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行。

    1.8大鼠腦組織中Nrf2蛋白表達(dá)的Western blot檢測1.7項(xiàng)中的大鼠采血后迅速斷頭處死,開顱并剝離、保留出血側(cè)腦組織,PBS沖洗干凈后進(jìn)行總蛋白提取、濃度測定。取每個樣品的總蛋白40 μg加入電泳槽的上樣孔,進(jìn)行電泳分離;將樣品凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜(轉(zhuǎn)膜條件為GAPDH:200 mA 90 min;Nrf2:200 mA 120 min后300 mA 30 min);轉(zhuǎn)膜后室溫封閉2 h;加入一抗(GAPDH按1∶1 000稀釋;Nrf2按1∶600稀釋)4 ℃孵育過夜;封閉液洗滌PVDF膜6次,5 min/次;加入二抗(按1∶50 000稀釋)37 ℃搖床孵育2 h,封閉液洗滌PVDF膜6次,5 min/次。滴加ECL進(jìn)行顯色,反應(yīng)至熒光帶明顯后,吸去多余液體,覆上保鮮膜,X光膠片壓片后依次顯影、定影、沖洗膠片。晾干后掃描膠片,用BandScan 5.0軟件分析膠片灰度值。以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的比值表示Nrf2蛋白的表示相對表達(dá)量。

    1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 25.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,應(yīng)用單因素方差分析比較各組大鼠及其不同時間點(diǎn)腦組織中EB含量,mNSS評分,血清中TNF-α、IL-6、IFN-γ、IL-4、IL-10、GSH含量以及出血側(cè)腦組織中Nrf2蛋白相對表達(dá)量的差異,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

    2 結(jié)果

    2.1各組大鼠不同時間點(diǎn)血腦屏障的通透性的變化見表1。由表1可知,ICH模型組與假手術(shù)組比較,EB含量升高(P<0.05),說明ICH模型組大鼠血腦屏障通透性增加,3 d時達(dá)到峰值。與ICH組比較,安宮牛黃丸組大鼠腦組織EB含量降低(P<0.05),大黃組在12 h、3 d時大鼠腦組織EB含量降低(P<0.05)。

    表1 各組大鼠不同時間點(diǎn)腦組織中EB含量比較(n=5)

    2.2各組大鼠mNSS評分的比較空白組4個時間點(diǎn)mNSS評分均為0;假手術(shù)組12和24 h mNSS評分均為(2.24±0.39),3和7 d時mNSS評分均為0。其余3組mNSS評分見表2。由表2可知,ICH模型組mNSS評分升高,說明出血模型造模成功;且隨著出血的發(fā)展,mNSS評分升高,3 d時達(dá)到峰值。與ICH模型組比較,安宮牛黃丸組在4個時間點(diǎn)時大鼠的mNSS評分均降低(P<0.05),大黃組在3 d、7 d時大鼠的mNSS評分降低(P<0.05)。

    表2 各組大鼠不同時間點(diǎn)mNSS評分比較(n=5)

    2.3各組大鼠不同時間點(diǎn)血清中TNF-α含量的比較見表3。由表3可知,與假手術(shù)組比較,ICH模型組大鼠4個時間點(diǎn)血清中TNF-α的含量均增加(P<0.05)。與ICH模型組比較,安宮牛黃丸組大鼠4個時間點(diǎn)血清中TNF-α的含量降低(P<0.05);大黃組在24 h、3 d、7 d時TNF-α的含量降低(P<0.05)。

    2.4各組大鼠不同時間點(diǎn)血清中IL-6含量的比較見表4。由表4可知,與假手術(shù)組比較,ICH模型組大鼠4個時間點(diǎn)血清中IL-6的含量升高(P<0.05)。與ICH模型組比較,安宮牛黃丸組和大黃組大鼠4個時間點(diǎn)血清中IL-6的含量均降低(P<0.05)。

    表3 各組大鼠不同時間點(diǎn)血清中TNF-α含量的比較(n=5) ng/L

    表4 各組大鼠不同時間點(diǎn)血清中IL-6含量的比較(n=5) ng/L

    2.5各組大鼠不同時間點(diǎn)血清中IFN-γ含量的比較見表5。由表5可知,空白組與假手術(shù)組比較,ICH模型組大鼠4個時間點(diǎn)血清中IFN-γ的含量增加(P<0.05)。與ICH模型組比較,安宮牛黃丸組和大黃組大鼠4個時間點(diǎn)血清中IFN-γ的含量均降低(P<0.05)。

    表5 各組大鼠不同時間點(diǎn)血清中IFN-γ含量的比較(n=5) ng/L

    2.6各組大鼠不同時間點(diǎn)血清中IL-4含量的比較見表6。由表6可知,與假手術(shù)組比較,ICH模型組大鼠血清中IL-4的含量在出血后12 h升高(P<0.05),然后隨著出血的進(jìn)展,在24 h、3 d、7 d時IL-4的含量降低(P<0.05)。與ICH模型組比較,安宮牛黃丸組大鼠4個時間點(diǎn)血清中IL-4含量均升高(P<0.05);大黃組IL-4含量在3 d、7 d時升高(P<0.05)。

    表6 各組大鼠不同時間點(diǎn)血清中IL-4含量的比較(n=5) ng/L

    2.7各組大鼠不同時間點(diǎn)血清中IL-10含量的比較見表7。由表7可知,與假手術(shù)組比較,ICH模型組大鼠血清中IL-10的含量在出血后12 h是先升高,然后隨著出血的進(jìn)展,在24 h、3 d、7 d時IL-10的含量降低(P<0.05)。與ICH模型組比較,安宮牛黃丸組和大黃組大鼠血清中IL-10的含量在24 h、3 d和7 d時升高(P<0.05)。

    表7 各組大鼠不同時間點(diǎn)血清中IL-10含量的比較(n=5) ng/L

    2.8各組大鼠不同時間點(diǎn)血清中GSH含量的比較見表8。由表8可知,與空白組相比,假手術(shù)組GSH含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與假手術(shù)組比較,ICH模型組大鼠4個時間點(diǎn)血清中GSH的含量降低(P<0.05),說明ICH過程中生成大量ROS,它能夠消耗GSH并使其水平降低。與ICH組比較,安宮牛黃丸組大鼠4個時間點(diǎn)血清中GSH的含量增加(P<0.05);大黃組大鼠血清中GSH的含量在24 h、3 d、7 d時增加(P<0.05)。

    表8 各組大鼠不同時間點(diǎn)血清中GSH含量的比較(n=5) μmol/L

    2.9各組大鼠不同時間點(diǎn)出血側(cè)腦組織中Nrf2蛋白相對表達(dá)量的比較見表9。由表9可知,與空白組相比,假手術(shù)組出血側(cè)腦組織中Nrf2蛋白的相對表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與假手術(shù)組比較,在12 h、24 h、3 d、7 d時ICH模型大鼠出血側(cè)腦組織中Nrf2蛋白的相對表達(dá)量升高(P<0.05)。與ICH組比較,安宮牛黃丸組出血側(cè)腦組織中Nrf2蛋白的相對表達(dá)量升高(P<0.05);大黃組大鼠出血側(cè)腦組織中Nrf2蛋白的相對表達(dá)量在3、7 d時升高(P<0.05)。

    表9 各組大鼠不同時間點(diǎn)出血側(cè)腦組織中Nrf2蛋白相對表達(dá)量的比較(n=5)

    3 討論

    現(xiàn)代藥理研究[8]表明,安宮牛黃丸可以通過抗氧化、抗炎等作用改善患者認(rèn)知功能和神經(jīng)功能,因此本研究中選擇安宮牛黃丸為陽性對照藥物。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示安宮牛黃丸在大鼠ICH中表現(xiàn)出明確的抗氧化、抗炎效應(yīng),指標(biāo)顯現(xiàn)相應(yīng)的改變。大黃是我國常用中藥之一,具有清熱攻積、瀉火涼血、逐瘀解毒之功效,其主要活性成分為蒽醌類化合物,主要為大黃酚、大黃素、大黃素甲醚、蘆薈大黃素、大黃酸等。近年來,大黃及其活性成分對腦損傷的抗炎和抗氧化的作用研究越來越多:彭紹鵬等[9]采用自體血注入大鼠紋狀體建立腦出血模型,以大黃素干預(yù),發(fā)現(xiàn)大黃素治療組能夠降低TNF-α的含量,抑制炎性因子的釋放,降低谷氨酸的表達(dá)水平,減輕腦出血后腦水;趙薇等[10]研究大黃酚對于腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)方面的保護(hù)作用時發(fā)現(xiàn),大黃酚可以上調(diào)SIRT3的表達(dá),增強(qiáng)SOD的抗氧化作用,增強(qiáng)抗細(xì)胞凋亡作用,下調(diào)AQP4的表達(dá),進(jìn)而減輕腦缺血后腦水腫的發(fā)生,發(fā)揮其對腦缺血再灌注的神經(jīng)保護(hù)作用;畢勇志等[11]研究表明,大黃素可通過抑制 NF-κB信號通路,降低大鼠海馬組織中促炎性細(xì)胞因子如 IL-6、IL-1β和 TNF-α的水平,抑制腦組織的炎癥反應(yīng),發(fā)揮對局灶性腦缺血的神經(jīng)保護(hù)作用。

    血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)是保持腦組織生理環(huán)境的重要屏障,可以有效避免腦組織被循環(huán)血液中的有害物質(zhì)損害,對保持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的有效生理功能具有重要意義[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),大黃提取液干預(yù)ICH模型大鼠后,在3 d作用時間點(diǎn)可以有效降低血腦屏障通透性、改善mNSS評分,發(fā)揮了腦保護(hù)作用。

    TNF-α、IL-6、IFN-γ均是腦出血后高表達(dá)的炎癥細(xì)胞因子,這些炎癥細(xì)胞因子在后續(xù)的繼發(fā)性腦損傷中發(fā)揮著重要角色,通過炎性浸潤激發(fā)基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá),破壞血腦屏障,進(jìn)而引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡[13-14];抗炎細(xì)胞因子IL-4可以抑制TNF-α、IL-6的表達(dá)[15];IL-10能降低炎癥應(yīng)激反應(yīng)[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),大黃提取液干預(yù)ICH模型大鼠后,可以顯著上調(diào)IL-4、IL-10表達(dá),下調(diào)TNF-α、IL-6、IFN-γ 表達(dá),發(fā)揮抗炎作用。

    ICH病理過程中發(fā)生的氧化應(yīng)激反應(yīng)是導(dǎo)致BBB破壞的重要機(jī)制[17]。氧化應(yīng)激損傷與體內(nèi)清除自由基的天然抗氧化物如GSH的消耗有關(guān)。ICH過程中生成的大量ROS能夠消耗GSH,使其水平降低,進(jìn)一步削弱血腫組織的抗氧化能力。Nrf2是維護(hù)機(jī)體抗氧化與氧化平衡的重要因子,在受到氧化應(yīng)激等刺激后激活,轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核內(nèi),以Nrf2-Maf 的形式與ARE結(jié)合,通過相關(guān)激活程序,促使下游基因轉(zhuǎn)錄,常見的下游基因產(chǎn)物多是抗氧化物質(zhì),包括醌氧化還原酶、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶、谷氨酰半胱氨酸連接酶以及血紅素加氧酶1等,可有效對抗腦出血后的腦損傷[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),大黃提取液干預(yù)ICH模型大鼠后,可以上調(diào)ICH模型大鼠腦組織中Nrf2蛋白的相對表達(dá)量、增加血清中GSH含量,發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用,減輕腦損傷。

    總之,本研究結(jié)果顯示大黃可通過抗炎和抗氧化作用,起到保護(hù)血腦屏障的作用,從而發(fā)揮對ICH的腦保護(hù)作用。

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