整體柱固定化胰蛋白酶反應(yīng)器的設(shè)計(jì)及其在水解β-乳球蛋白中的應(yīng)用

茅宇虹， 李仁寬， 葉秀云

(福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院， 福建省海洋酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 福建 福州 350108)

0 引言

β-乳球蛋白(β-Lactoglobulin, β-Lg)是牛乳中的主要蛋白質(zhì)， 約占乳清總蛋白的80%. 由于母乳中不含該蛋白， β-乳球蛋白一直被認(rèn)為是嬰幼兒的主要過敏原之一[1]. 酶法水解是降低蛋白質(zhì)過敏性的常用方法. 胰蛋白酶(Trypsin, EC3.4.21.4)特異性水解精氨酸(Arg/R)和賴氨酸(Lys/K)的C端肽鍵. 通過胰蛋白酶水解β-乳球蛋白不僅可顯著降低其致敏性[2]， 還可釋放5種生物活性肽[3].

市售的胰蛋白酶主要來源于動(dòng)物， 如牛胰臟和豬胰臟. 原料不足及分離純化成本高昂大大限制了其在食品工業(yè)中的廣泛應(yīng)用. 固定化不僅可提高游離酶的穩(wěn)定性， 還可實(shí)現(xiàn)其重復(fù)使用， 從而降低使用成本. 然而， 底物與產(chǎn)物在固定化酶反應(yīng)器中的擴(kuò)散局限性往往嚴(yán)重阻礙了固定化酶分子與底物的接觸， 從而引起水解效率的降低[4].

為了解決擴(kuò)散限制問題， 基于整體柱的固定化胰蛋白酶近年來備受關(guān)注[5-7]. 整體柱是由單體、 引發(fā)劑與致孔劑等混合物通過熱引發(fā)或光引發(fā)聚合而成的整體材料[8]. 相較于傳統(tǒng)的多孔顆粒， 整體柱往往具有高孔隙率和低擴(kuò)散限制的優(yōu)點(diǎn)， 可避免因擴(kuò)散及逆流問題所導(dǎo)致的底物與酶無法接觸[9-10]. 然而， 絕大多數(shù)所報(bào)道的固定化胰蛋白酶反應(yīng)器專為質(zhì)譜分析研究而設(shè)計(jì)， 處理的底物量往往為微克級(jí). 這與應(yīng)用于食品工業(yè)中蛋白質(zhì)水解物的生產(chǎn)相距甚遠(yuǎn). 在食品工業(yè)的應(yīng)用中， 固定化酶反應(yīng)器不僅需具備高活性， 還需處理大量底物. 高底物處理量往往極易導(dǎo)致因底物和產(chǎn)物的殘留而引起的反應(yīng)器堵塞問題. 理論上， 相對(duì)更大的孔徑可保證其在實(shí)際應(yīng)用中的高流速與高處理量.

本研究旨在制備適用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)水解物的固定化胰蛋白酶反應(yīng)器. 以修飾了醛基官能團(tuán)的聚甲基丙烯酸甲酯的大孔徑(6.0、 2.1 μm)整體柱為載體， 通過共價(jià)固定制備系列固定化胰蛋白酶反應(yīng)器. 從固定化得率、 酶比活及重復(fù)使用性等方面對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià). 此外， 以β-乳球蛋白為底物， 探究反應(yīng)器對(duì)該底物的水解效率. 前期工作已系統(tǒng)比較了不同水解環(huán)境(pH值、 無機(jī)鹽與有機(jī)溶劑)對(duì)固定化胰蛋白酶與游離胰蛋白酶的水解效率及酶切位點(diǎn)特異性的影響[11-13]. 因此， 本研究重點(diǎn)考察固定化酶反應(yīng)器特有的參數(shù)-流速， 對(duì)水解蛋白質(zhì)效率的影響.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

根據(jù)Toro-Sierra等[14]的方法， 以分離乳清蛋白粉為原材料， 通過膜分離得到β-乳球蛋白(干物質(zhì)含量98.6%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))， β-乳球蛋白純度≥99%).

胰蛋白酶(Trypsin， 來源自牛胰臟)購自美國Sigma-Aldrich公司， 以Nα-苯甲?；?L-精氨酸乙酯(BAEE)為底物的酶活≥10 000 U·mg-1. 鹽酸苯甲脒(benzamidine hydrochloride, BAHC)、 2-(N-嗎啉基)-乙磺酸(2-(N-morpholino)-ethanesulfonic acid， MES)、 2-甲基吡啶硼烷(2-borane picoline 2-PB)、 氰基硼酸(NaCNBH3)、 乙醇胺(ethanolamine)、 三(羥甲基)氨基甲烷(tris(hydroxymethyl)aminomethane， Tris)、 氯化鈉(NaCl)、 氫氧化鈉(NaOH)、 鹽酸(HCl)、 氯化鈣(CaCl2)、 醋酸(CH3COOH)、 乙醇(C2H6O)、 三氟乙酸(trifluoroacetic acid， TFA)、 二硫代蘇糖醇(dithiothreitol， DTT)、 氯乙酰胺(chloroacetamide， CAA)、 乙腈(C2H3N)等均購自美國Sigma-Aldrich公司， 其中乙腈為色譜純， 其余均為分析純.

1.2 固定化酶反應(yīng)器的制備

基于整體柱的固定化胰蛋白酶反應(yīng)器(monolith based immobilized trypsin reactors, MITRs)采用具有醛基官能團(tuán)修飾的聚甲基丙烯酸甲酯整體柱(CIMTM-ALD)為載體. 該載體由BIA Separations d.o.o. 公司(斯洛文尼亞)提供， 其具體尺寸信息如圖1-A部分所示. 游離胰蛋白酶上的氨基與整體柱內(nèi)表面官能團(tuán)醛基通過席夫堿反應(yīng)形成多點(diǎn)共價(jià)固定， 如圖1-C部分所示， 固定步驟如圖1-D部分所示.

圖1 CIMTM-ALD整體柱尺寸及胰蛋白酶固定化流程

胰蛋白酶固定得率R(mg/MITR)可由式(1)計(jì)算得， 其中溶液中胰蛋白酶含量通過液相色譜分析根據(jù)峰面積確定.

R=Δc×V1-c′×V2

(1)

其中： Δc為胰蛋白酶溶液固定前后的濃度差；V1為所用的胰蛋白酶溶液體積(5 mL)；c′為固定后沖洗液中的胰蛋白酶濃度；V2為所用沖洗液的體積(10 mL).

1.3 胰蛋白酶酶活的測(cè)定

1.3.1 游離胰蛋白酶的酶活

采用連續(xù)分光光度速率測(cè)定法(A253， 光程=1 cm)， 以BAEE為底物測(cè)定胰蛋白酶活性. 一個(gè)BAEE單位的胰蛋白酶酶活(U)為每分鐘產(chǎn)生0.001的ΔA253， pH值為7.8或8.7(0.1 mol·L-1Tris-HCl)， 反應(yīng)溫度為25 ℃， 反應(yīng)體積為3.20 mL.

1.3.2固定化胰蛋白酶的酶活

將MITR接入Akta系統(tǒng)后， 采用20 mL去離子水沖洗. 使用0.1 mol·L-1Tris-HCl(pH=7.8或8.7)緩沖液預(yù)平衡反應(yīng)器(5 mL·min-1)后， 將10 mL 10 mmol·L-1BAEE(0.1 mol·L-1Tris-HCl, pH=7.8或8.7)底物溶液以10 mL·min-1的流速通過MITR， 流出液通過自動(dòng)收集器收集(每管2 mL). 為充分排除Akta體系死體積的影響， 取第3管收集液稀釋50倍后于253 nm處測(cè)定其吸光度. 固定化酶酶活U*為在該反應(yīng)條件下每分鐘水解 BAEE產(chǎn)生 Nα-苯甲酰基-L-精氨酸(BA)的微摩爾量， 由式(2)計(jì)算得.U*可通過乘以系數(shù)270轉(zhuǎn)化為BAEE酶活單位U[15].

(2)

其中： ΔA為BAEE溶液通過MITR前后的吸光度差；F為流速(10 mL·min-1)； Di 為測(cè)定吸光度時(shí)的稀釋倍數(shù)(50)；L為光路徑(1 cm)；ε為BA在253 nm處的摩爾吸光數(shù)(808 mol-1·cm-1)[16].

1.4 固定化胰蛋白酶反應(yīng)器滲透性的測(cè)定

在Akta系統(tǒng)中， 將去離子水分別以不同流速循環(huán)， 分別記錄Akta系統(tǒng)背壓與接入MITR后的背壓. 在相同流速下， 這兩個(gè)背壓值的差值即為由MITR所引起的壓降值. 根據(jù)Podgornik等[17]的研究， MITR的滲透性(B， m2)可根據(jù)其在不同流速下的壓降值公式(3)計(jì)算得.

(3)

其中：F為流速(mL·min-1)； Δp(MPa)為MITR所引起的壓降值；η為流體黏度(去離子水黏度為0.877 mPa·s)；D、d與h分別為MITR的外徑、 內(nèi)徑與高度(m)(見圖1-A部分).

1.5 β-乳球蛋白的水解

底物預(yù)處理： β-乳球蛋白粉于去離子水中攪拌溶解過夜(4 ℃, 150 r·min-1磁力攪拌). 放置至室溫后將pH值調(diào)節(jié)至4.6， 離心去除沉淀蛋白.

所有水解反應(yīng)均在Akta系統(tǒng)中以循環(huán)模式進(jìn)行(25±1 ℃)， 各水解條件分別進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)， 且以隨機(jī)錯(cuò)開模式安排實(shí)驗(yàn)順序， 減少M(fèi)ITRs因使用性能下降所導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏差. 每次實(shí)驗(yàn)后， 分別采用20 mL去離子水， 100 mL 0.5 mmol·L-1NaOH + 5 mmol·L-1NaCL溶液(pH=10.5)以及50 mL去離子水清洗MITR(5 mL·min-1)， 并采用20 mL含1 mmol·L-1CaCl2與5%(體積分?jǐn)?shù))乙醇的20 mmol·L-1醋酸溶液(pH=3.5)潤(rùn)洗后儲(chǔ)存于4 ℃環(huán)境中.

1.5.1流速的影響

20 mL 0.1 mol·L-1Tris-HCl 緩沖液預(yù)平衡MITRs后， 用16 mL 底物溶液(10 mg·mL-1， pH=8.7)以10 mL·min-1的流速潤(rùn)洗MITR， 剩余的100 mL底物溶液于不同流速下進(jìn)行循環(huán)水解. 在水解過程中， 分別于不同時(shí)間取樣1 mL待分析.

1.5.2 pH-stat水解模式

MITR經(jīng)預(yù)平衡及底物溶液潤(rùn)洗后， 100 mL β-乳球蛋白溶液(10 mg·mL-1)以15 mL·min-1的流速循環(huán)通過MITR. 采用pH-stat水解法， 通過滴加0.1 mol·L-1的NaOH溶液維持水解過程中pH值的穩(wěn)定， 并通過實(shí)時(shí)記錄所用的NaOH溶液體積計(jì)算水解度. 水解度(degree of hydrolysis, DH)可根據(jù)式(4)計(jì)算得[18]. 在水解過程中， 分別于不同間隔時(shí)間取樣1 mL待分析.

(4)

1.6 β-乳球蛋白的定量分析

通過高效液相色譜(reversed-phase high-performance liquid chromatography， RP-HPLC)定量分析β-乳球蛋白的含量. 所采用的HPLC系統(tǒng)為安捷倫1100系列(美國Agilent Technologies公司)， 色譜柱為PLRP-S-300 ?(150 mm ×4.6 mm， 德國Eppelheim公司). 將各待測(cè)樣品稀釋2倍后調(diào)節(jié)其pH值至4.6， 采用0.45 μm纖維素膜過濾該樣品后， 取20 μL進(jìn)行分析. 洗脫液A為含0.10%(體積分?jǐn)?shù)， 下同)TFA的去離子水， 洗脫液B為含0.05%TFA的80%乙腈/水溶液. 洗脫梯度： 溶劑B的體積分?jǐn)?shù)由起始的43%于13 min內(nèi)增加55%. 流動(dòng)相的流速恒定為1.0 mL·min-1， 溫度40 ℃， 紫外檢測(cè)器的檢測(cè)波長(zhǎng)226 nm.

以純度為99%的β-乳球蛋白A與B(美國Sigma Aldrich公司)為標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線后， 根據(jù)樣品的保留時(shí)間及峰面積計(jì)算樣品中β-乳球蛋白的含量.

1.7 水解產(chǎn)物的HPLC分析

表1 水解產(chǎn)物色譜分析的洗脫液梯度

預(yù)處理(還原二硫鍵)： 將水解產(chǎn)物樣品用去離子水稀釋2倍后取1 mL加入150 μL 80 mmol·L-1的DTT并震蕩45 min(pH=8， 溫度37 ℃)， 然后加入200 μL CAA(400 mmol·L-1)混合均勻后于黑暗環(huán)境中靜置30 min.

采用安捷倫1100系列HPLC系統(tǒng)分析. 色譜柱型號(hào)為Kinetex-XB-C18-100 ?(100 mm ×4.6 mm， 美國Phenomenex公司). 流動(dòng)相與節(jié)1.6中所述一致. 洗脫梯度如表1所示. 該分析在60 ℃和1.5 mL·min-1的流速下進(jìn)行， 紫外檢測(cè)器的檢測(cè)波長(zhǎng)為214 nm.

1.8 數(shù)據(jù)處理

色譜數(shù)據(jù)采用安捷倫ChemStation分析. 其它實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin 2018計(jì)算分析并作圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 固定化胰蛋白酶反應(yīng)器的表征

2.1.1 胰蛋白酶的固定化得率

本研究比較不同還原劑體系對(duì)胰蛋白酶固定化得率及活性的影響， 結(jié)果如表2所示. 還原劑2-PB的使用導(dǎo)致了胰蛋白酶固載量的顯著降低. 這可能是因?yàn)?-PB分子相較于其他兩種還原劑較大， 限制了其還原席夫堿的能力[19]. 由于2-PB參與的還原反應(yīng)相對(duì)溫和， 對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)影響小， 因此方案1中的固定化胰蛋白酶的酶活顯著高于其它方案. 鑒于NaBH4對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)的破壞性， 該還原劑僅于封閉殘留官能團(tuán)時(shí)使用， 并未在固定化過程中應(yīng)用. 胰蛋白酶的固載量在方案2、 3中并無顯著變化， 但應(yīng)用NaBH4依舊降低了固定化胰蛋白酶的比活. 據(jù)生產(chǎn)商信息， 孔徑大小分別為2.1和6.0 μm的整體柱的表面積分別為5.0和2.0 m2·g-1. 由于比表面積的減少， 6.0 μm-MITR中酶的總固載量均顯著少于2.1 μm-MITR. 然而， 結(jié)合MITRs的固有表面積， 6.0 μm-MITR中的胰蛋白酶分子單位固載率為0.75～1.60 mg·m-2， 高于2.1 μm-MITR(0.68～1.00 mg·m-2). 這說明整體柱孔徑的增大事實(shí)上有助于酶分子的固定.

據(jù)報(bào)道， 游離胰蛋白酶的最適pH值為 7.8～8.1， pH值的升高或降低往往導(dǎo)致酶蛋白結(jié)構(gòu)的變化從而影響其活性[3]. 如表2所示， 相較于pH=7.8， 游離胰蛋白酶的酶活在pH=8.7時(shí)降低了18.6%， 而多點(diǎn)共價(jià)固定的胰蛋白酶的比活不僅沒有降低， 還均略微增加. 然而， 共價(jià)固定法易造成酶分子靈活性的降低并可能引起空間位阻， 從而降低固定化酶的活性. 本研究中， 固定化胰蛋白酶的比活相較于其游離態(tài)降低了50%～80%.

表2 不同方案下胰蛋白酶固定于ALD-CIMTM 整體柱的得率及酶活

2.1.2固定化酶反應(yīng)器的柱壓及滲透性

6個(gè)MITRs在不同流速下的柱壓均呈線性上升， 如圖2(a)所示. 這表明所使用的整體柱材料在15 mL·min-1的流速下沒有發(fā)生壓縮形變. 2.1 μm-MITR在15 mL·min-1時(shí)柱壓為0.20～0.25 MPa， 而6.0 μm-MITR在該流速下的柱壓低于0.05 MPa. 據(jù)生產(chǎn)商信息， 該整體柱耐受柱壓可高至2.0 MPa， 因此理論上可在更高流速下應(yīng)用. 根據(jù)不同流速下的柱壓及公式(3)計(jì)算所得的滲透性如圖2(b)所示. 在孔隙率不變的情況下， 所用整體柱的孔徑由2.1 μm 增加到6.0 μm， 滲透性增加了5倍左右.

圖2 不同流速下MITRs的柱壓及滲透性.

2.2 固定化胰蛋白酶水解β-乳球蛋白

N3與N4的總酶活最高， 因此被用于β-乳球蛋白的水解實(shí)驗(yàn). 此外， 固定化胰蛋白酶的酶活在pH=8.7時(shí)高于pH=7.8時(shí)， 因此水解反應(yīng)在pH=8.7下進(jìn)行.

2.2.1流速的影響

在基于大孔整體柱的反應(yīng)器中， 底物主要通過對(duì)流方式與固定化酶接觸， 因此傳質(zhì)速度主要由流速?zèng)Q定. 本研究比較N3、 N4在不同流速下水解β-乳球蛋白的能力， 結(jié)果如圖3所示. 無論是2.1 μm還是6.0 μm孔徑的MITR， 其水解β-乳球蛋白的能力均隨著循環(huán)流速的增大而增加. 例如， 在0.5 mL·min-1的流速下， N3在2 h內(nèi)可水解25%β-乳球蛋白， 而在同樣水解時(shí)間下將循環(huán)流速提高至10.0 mL·min-1， 50%β-乳球蛋白被降解. 顯然， 流速的提高大大增加了MITRs內(nèi)的傳質(zhì)效率， 因此提高了其水解底物蛋白的能力.

圖3 N3與N4在不同流速下水解β-乳球蛋白的效率

2.2.2 pH-stat法水解模式

圖4 N3與N4循環(huán)水解β-乳球蛋白過程中水解度與殘留β-乳球蛋白含量的變化

理論上， 胰蛋白酶水解β-乳球蛋白最大水解度可達(dá)11.11%[3]. 經(jīng)過6 h的循環(huán)水解， 水解度分別為10.1%(N3)與6.9%(N4)， 如圖4所示. 其中， 使用N3的水解度在最后的1 h內(nèi)只增加了0.2%， 說明其水解度已接近最大值. N3的整體酶活是N4的1.5倍， 這與兩者水解β-乳球蛋白的效率十分相符. 由此可見， N3與N4的孔徑差異對(duì)傳質(zhì)效率并無明顯影響. 此外， 在前期研究中[11]， 游離胰蛋白酶水解β-乳球蛋白往往在初期反應(yīng)迅速， 隨后由于底物的減少以及游離酶的自降解而逐漸減緩. 固定化胰蛋白酶雖避免了自降解問題， 但由于其靈活性的降低， 并未出現(xiàn)初期十分迅速的反應(yīng)階段. 此外， 水解過程中殘留蛋白含量的變化如圖4(藍(lán)色)所示. 在240 min時(shí)(DH 8.8%)， N3的水解產(chǎn)物中幾乎已檢測(cè)不到完整的β-乳球蛋白， 而采用N4水解360 min后， 14.2%β-乳球蛋白還未被降解.

2.2.3水解產(chǎn)物的分析

將經(jīng)N3與N4水解的β-乳球蛋白水解物分別經(jīng)含10 ku與3 ku過濾膜的離心管過濾后采用高效液相色譜分析， 結(jié)果如圖5所示.

圖5 N3與N4水解β-乳球蛋白產(chǎn)物的色譜分析

N3的水解產(chǎn)物在過濾前后無明顯變化， 說明該水解產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量均小于3 ku(圖5(a))； 而N4的水解產(chǎn)物中依舊含有相對(duì)分子質(zhì)量大于10 ku的多肽(見圖5(b)). 此外， 較多在N3水解產(chǎn)物中檢測(cè)到的肽， 并未出現(xiàn)在N4的水解產(chǎn)物中. 這說明這些肽在水解反應(yīng)的后期釋放.

2.3 固定化酶反應(yīng)器使用的重復(fù)性

MITRs的穩(wěn)定性和可重復(fù)使用性取決于酶活以及滲透性(柱壓)的穩(wěn)定性. 為了系統(tǒng)研究孔徑大小對(duì)其的影響， N3與N4被重復(fù)用于β-乳球蛋白的水解實(shí)驗(yàn). 在10 mg·mL-1的β-乳球蛋白溶液的單次6 h循環(huán)水解實(shí)驗(yàn)中， 柱壓的變化如圖6所示. 由于N3孔徑較小， 其背壓約為N4的4倍. 此外， 在6 h的連續(xù)水解實(shí)驗(yàn)中， N3的柱壓從0.30 MPa增加到0.33 MPa， 而N4的背壓幾乎完全保持不變. 這可能是由于β-乳球蛋白分子及其水解產(chǎn)物在N3中的非特異性吸附.

為了探究該非特異性吸附問題是否可通過現(xiàn)有的沖洗步驟消除， 本研究在每次水解實(shí)驗(yàn)及清洗后均記錄N3與N4的滲透性以及酶活. 在用N4水解β-乳球蛋白(10 mg·mL-1)的18次實(shí)驗(yàn)中(前3次循環(huán)為6 h， 其余每次持續(xù)3 h)， 酶活性和柱壓基本保持不變， 如圖7所示. 對(duì)于N3， 其柱壓在前10個(gè)循環(huán)中并沒有明顯下降， 這表明沖洗步驟具有一定效果. 然而， 隨著使用次數(shù)的不斷累積， N3的滲透性逐漸下降. 有趣的是N3的酶活在18次重復(fù)使用中幾乎沒有顯著變化. 此外， 在連續(xù)水解實(shí)驗(yàn)后， N3與N4于4 ℃儲(chǔ)存超過30周， 其酶活和滲透性均十分穩(wěn)定.

圖6 N3與N4水解β-乳球蛋白溶液時(shí)的柱壓變化

圖7 N3與N4在18次重復(fù)使用中酶活與滲透性的變化

3 結(jié)語

本研究采用大孔徑(2.1 μm與6.0 μm)的有機(jī)整體柱為載體， 比較不同還原劑對(duì)所制備的固定化酶反應(yīng)器的固載量及酶比活的影響. 相對(duì)溫和的2-甲基吡啶硼烷可提高酶的比活但大大降低了固載量. 所制備的MITRs可有效水解β-乳球蛋白， 其中2.1 μm-MITR可在6 h內(nèi)使100 mL 10 mg·mL-1的β-乳球蛋白溶液水解度達(dá)到10.1%(理論最大值為11.1%)， 該水解產(chǎn)物主要為相對(duì)分子質(zhì)量于3 ku的小肽. 值得注意的是， 本研究中的水解時(shí)間為循環(huán)時(shí)間. 由于MITRs的孔體積為0.6 mL， 固定化胰蛋白酶與底物的有效接觸時(shí)間比循環(huán)時(shí)間短得多. 此外， 2.1 μm-MITR 在10次重復(fù)使用后， 由于現(xiàn)有的清洗方法無法完全去除殘留的蛋白質(zhì)， 其柱壓逐漸上升但酶活幾乎保持不變. 6.0 μm-MITR的柱壓及酶活在18次重復(fù)使用中均十分穩(wěn)定.