海藻酸鈉成膜基質(zhì)奶牛乳頭藥浴液研制及臨床應(yīng)用

侯慧君，張 欣，徐承倩，付旭彬，李建軍，孫英峰*

(1.天津農(nóng)學(xué)院 動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津市農(nóng)業(yè)動物繁育與健康養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384；2. 天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司 ，天津 300300)

奶牛乳腺炎是困擾奶牛養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要疾病之一，嚴(yán)重影響奶牛業(yè)的健康發(fā)展[1-2]。據(jù)報道，該病相關(guān)病原已達(dá)150多種以上，主要為大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及無乳鏈球菌。目前，奶牛乳房炎的治療主要包括全身及乳房局部的抗感染治療，但全身用藥治療時乳房局部很難達(dá)到殺菌有效濃度，局部用藥極易引起乳制品中抗生素藥物殘留和超標(biāo)。因此，科學(xué)有效的乳頭藥浴消毒是預(yù)防乳腺炎的一個重要環(huán)節(jié)，能夠有效降低乳房炎的發(fā)生率、減少經(jīng)濟損失、保證原奶品質(zhì)[3]。

目前，奶牛成膜性乳頭藥浴液較多，多數(shù)采用聚乙烯醇(PVA)作為藥浴液成膜基質(zhì)，而世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)于2017年10月27日公布的致癌物清單，將PVA列在3類致癌物清單中，因此從食品安全角度出發(fā)，迫切需要尋找安全無毒成膜基質(zhì)替代品。海藻酸鈉(ALG)又稱海藻膠、褐藻酸鈉或海帶膠，是一種天然多糖，廣泛應(yīng)用于食品可食用保鮮劑以及制藥片劑的粘合劑領(lǐng)域。ALG屬于無毒食品，早在1938年就已被收入美國藥典，1963年收入英國藥典，2010年中國藥典首次收錄海藻酸鈉為藥用輔料，因具有較好的穩(wěn)定性、溶解性、粘性和安全性等特點，現(xiàn)已經(jīng)被廣泛用于食品工業(yè)和醫(yī)藥領(lǐng)域[4-6]，但尚未見以海藻酸鈉成膜基質(zhì)乳頭藥浴液用于預(yù)防和治療奶牛乳房炎的報道。本試驗考察海藻酸奶牛乳頭藥浴成膜基質(zhì)可行性，并先后進(jìn)行安全性、有效性、保質(zhì)期及臨床有效性試驗研究，為奶牛乳腺炎防治獸藥新劑型的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種

金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌和大腸桿菌，由本實驗室分離鑒定并保存。

1.2 主要試劑與設(shè)備

海藻酸鈉粘度(10 g/L，20 ℃)(Pa.s)≥0.02，購自北京索萊寶生物技術(shù)公司，聚維酮碘溶液、硫代硫酸鈉、瓊脂培養(yǎng)基購自天津六合生物技術(shù)公司。超凈臺(江蘇通凈)、滅菌高壓鍋(山東新華醫(yī)療器械股份有限公司)、恒溫培養(yǎng)箱(上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司)、搖床(上海世平實驗設(shè)備有限公司)、天平(奧豪斯儀器常州有限公司)、磁力攪拌儀(天津歐諾儀器儀表有限公司)、低速離心機(上海知信實驗儀器技術(shù)有限公司)、移液槍、離心管。

1.3 試驗動物

清潔級家兔，購自北京通威實驗動物公司。

1.4 藥浴液成膜性試驗

配制濃度為1%海藻酸鈉溶液，加入穩(wěn)定劑氯化鈣(終濃度0.034 g/100 mL)[7]及護(hù)膚成分甘油(終濃度10%)，加入5 mL聚維酮碘溶液，制得藥浴液。用塑料滴管模擬乳頭，蘸取一定量藥浴液置于通風(fēng)且陽光散射處，計算成膜時間。

1.5 藥浴液安全性試驗

依據(jù)《中國獸藥典》(2015)開展皮膚的刺激性安全試驗。選擇9只成年健康母兔進(jìn)行皮膚敏感性試驗，連續(xù)7 d，分別將聚維酮碘原液、藥浴液和生理鹽水分別抹于母兔的背部皮膚，進(jìn)行觀察。試驗7 d后，切下背部皮膚，制作切片，觀察病理變化。

1.6 藥浴液有效性試驗

按照《消毒技術(shù)規(guī)范》要求，采用殺菌率判定藥浴液有效性。取標(biāo)準(zhǔn)菌種接種于LB肉湯培養(yǎng)基，細(xì)菌計數(shù)調(diào)整濃度量為1×108～5×108cfu/mL進(jìn)行殺菌率試驗。殺菌時間依次為30 s、5 min，采用硫代硫酸鈉進(jìn)行中和，細(xì)菌計數(shù)并計算殺菌率。

1.7 藥浴液保質(zhì)期試驗

將制備好的成膜性乳頭藥浴液，在常溫避光條件下保存，按照成膜性試驗及有效性步驟，分別設(shè)定30 d、90 d、180 d成膜效果及殺菌率，評估保質(zhì)期。

1.8 藥浴液對比試驗

購買市售某商品化聚乙烯醇(PVA)成膜基質(zhì)的奶牛乳頭藥浴液，查看生產(chǎn)日期，選取日期相近成膜藥浴液測定5 min時間節(jié)點殺菌率。

1.9 藥浴液臨床應(yīng)用試驗

選取天津武清區(qū)某奶牛養(yǎng)殖場，將本產(chǎn)品用于擠奶后藥浴，觀察成膜效果及牛場臨床乳腺炎發(fā)病情況，并采用LMT法測定應(yīng)用前后隱性乳腺炎發(fā)病比例，評估本產(chǎn)品臨床應(yīng)用效果。

2 結(jié) 果

2.1 藥浴液成膜性結(jié)果

通過體外模擬成膜性試驗可知，本試驗研制的藥浴液可以在室溫自然環(huán)境條件情況下，約在5 min可以成單層薄膜，且韌性良好。

2.2 藥浴液安全性結(jié)果

試驗第1～2天，聚維酮碘原液組中家兔皮膚部位出現(xiàn)紅色炎性反應(yīng)并出現(xiàn)小疙瘩現(xiàn)象，第3天開始消退，海藻酸鈉成膜藥浴液和生理鹽水對照組均無不良反應(yīng)。顯微病理切片結(jié)果顯示聚維酮碘原液組皮下血管高度充血，海藻酸鈉成膜性藥浴液組僅表現(xiàn)輕微血管充血，與空白對照組無顯著差異，具體見圖1。

圖1 海藻酸鈉成膜性乳頭藥浴液對家兔皮膚刺激性顯微切片結(jié)果(100×)Fig.1 Results of microscopic sectioning of rabbit skin by sodium alginate film-forming papillary bath (100×)

2.3 藥浴液有效性結(jié)果

本試驗研制的成膜性乳頭藥浴液在30 s、5 min的殺菌率詳見表1。由表1可見，海藻酸鈉成膜性藥浴劑在30 s對奶牛乳腺炎常見病原菌殺菌率達(dá)99.99%以上。

表1 海藻酸鈉成膜性藥浴液對奶牛乳腺炎致病菌的殺菌效果Table 1 Sterilization effect of sodium alginate film-forming medicated bath on pathogenic bacteria of cow mastitis

2.4 藥浴液保質(zhì)期內(nèi)不同時間殺菌效果

本試驗研制的成膜性乳頭藥浴液在30 d、90 d、180 d時間，均可在5 min成膜，成膜效果良好，且表現(xiàn)出良好殺菌率(見表2)。

表2 海藻酸鈉成膜性藥浴液對奶牛乳腺炎致病菌的殺菌效果Table 2 Sterilization effect of sodium alginate film-forming medicated bath on pathogenic bacteria of cow mastitis %

2.5 藥浴液殺菌效果

本試驗研制的成膜性乳頭藥浴液與市售商品化聚乙烯醇(PVA)在5 min時殺菌對比試驗結(jié)果見表3。由表3可見，海藻酸鈉成膜性藥液殺菌效果良好。

表3 海藻酸鈉成膜性藥浴液5 min殺菌效果Table 3 Comparison of sterilization of sodium alginate film-forming medicated bath with commercially available medicated bath %

2.6 藥浴液臨床應(yīng)用結(jié)果

在天津武清區(qū)某奶牛養(yǎng)殖場，應(yīng)用本試驗研制的成膜性乳頭藥浴液后，其臨床乳腺炎發(fā)病率由原來5%下降到2%，隱性乳腺炎發(fā)病率由原來的20%下降到8%(見表4)。本試驗研制的成膜性乳頭藥浴液表現(xiàn)出良好的預(yù)防乳腺炎發(fā)病效果，具有較好臨床應(yīng)用前景。

表4 海藻酸鈉成膜性藥浴液臨床應(yīng)用效果評估Table 4 Evaluation of clinical application of sodium alginate film-forming medicated bath %

3 討 論

奶牛乳腺炎是奶牛的常見病，發(fā)病原因較為復(fù)雜，其中環(huán)境性病原微生物是主要生物性因素，而擠奶廳奶牛乳頭后藥浴輔助控制是常用手段之一。目前市售的奶牛乳頭擠后藥浴液成膜基質(zhì)多選用聚乙烯醇(PVA)，除醫(yī)用級別外，其他級別的聚乙烯醇曾被世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)列入三類致癌物質(zhì)清單，因此，篩選出安全級別更高的成膜基質(zhì)已經(jīng)迫在眉睫。海藻酸鈉具有無毒、可生物降解、良好生物相容性、緩釋和控釋等特點，主要作肉類制品保鮮可食用涂膜的主要原料[9]。因此，將海藻酸鈉的成膜性和安全性應(yīng)用于奶牛乳頭藥浴液成膜基質(zhì)上，將大幅度提升藥浴液的安全性。

目前市場上商品化奶牛乳頭藥浴液對奶牛乳腺皮膚組織有一定的損傷和刺激[10]。為研究本成膜藥浴制劑對奶牛乳房皮膚的刺激性，本試驗依據(jù)《中國獸藥典》(2015)開展皮膚的刺激性安全試驗。結(jié)果表明，聚維酮碘組家兔皮膚出現(xiàn)不同程度炎癥反應(yīng)，成膜藥浴劑試驗組未見明顯可見病理變化。顯微病理切片進(jìn)一步證實藥浴液組表現(xiàn)輕微血管充血現(xiàn)象，無組織壞死。說明本研究的成膜性藥浴對動物皮膚無不良刺激，且組分中的潤膚成分可很好地保護(hù)乳頭。

據(jù)報道，鏈球菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌是引發(fā)我國奶牛場乳腺炎主要病原菌[11]。對奶牛乳腺炎常見致病菌的殺菌試驗表明，本次研制成膜性乳頭藥浴液在30s時間節(jié)點均表現(xiàn)出不同程度的殺菌作用，其中對金黃色葡萄球菌殺菌率100%，無乳鏈球菌和大腸桿菌殺菌率達(dá)99.99%以上；且在180 d時同樣表現(xiàn)出了良好的殺菌效果。成膜性乳頭藥浴液除了直接將附著于乳頭部位的細(xì)菌殺死外，同時形成保護(hù)膜，發(fā)揮物理性屏障作用保護(hù)乳頭，有效減少病原菌進(jìn)入乳房的機會，從而降低乳腺炎的發(fā)生概率。該成膜性乳頭藥浴液制劑安全無刺激性，良好殺菌效果，具有很好的推廣和應(yīng)用前景。