多種因素對小鼠卵母細(xì)胞體外受精效果影響的分析

張景鋒,郝京京,徐秋良,朱寬佑,牛 暉,張長興

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 動物科技學(xué)院，河南 鄭州 450046；2.河南省畜禽遺傳資源保護(hù)工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450046)

體外受精是指哺乳動物的精子和卵子在體外人為控制的環(huán)境中完成受精過程的技術(shù)。這項技術(shù)于20世紀(jì)50年代取得了成功，該技術(shù)在瀕危動物和優(yōu)良家畜品種的后代續(xù)繁、性別控制、品種資源保存等方面的應(yīng)用具有重大意義，最大優(yōu)點是能夠打破時間和空間限制[1-3]。鑒于此，科研人員模擬卵母細(xì)胞在體內(nèi)受精和胚胎發(fā)育的情況，研究獲得高受精率和高胚胎發(fā)育率的方法，從而提高體外受精的效果[4-5]。在不同激素對卵母細(xì)胞體外受精的影響方面，有研究者提出促卵泡素(FSH)和胰島素對小鼠卵母細(xì)胞體外成熟有提高作用，并且胰島素的效果要比FSH的效果更加好，但是對于體外受精率，胰島素添加組要比FSH組低4.6%[6-7]。李凱等[8]研究結(jié)果顯示，小鼠卵母細(xì)胞經(jīng)過1 000 ng/mL雌二醇處理后，卵裂率低于其它試驗組，這種現(xiàn)象的出現(xiàn)可能是因為高濃度的雌激素對小鼠卵母細(xì)胞的受精能力有抑制作用。在不同添加劑對卵母細(xì)胞體外受精的影響方面，有學(xué)者提出牛血清白蛋白(BSA)具有降低小鼠體外受精率的作用，認(rèn)為卵母細(xì)胞透明帶在含有BSA的體系中發(fā)生硬化[9]。郭勇等[10]研究結(jié)果證明人的重組促黃體生成素(r-hLH)對小鼠卵母細(xì)胞的體外受精有明顯的促進(jìn)作用， 同時對相應(yīng)胚胎進(jìn)一步發(fā)育產(chǎn)生明顯的抑制作用。朱佳偉等[11]研究結(jié)果顯示半胱氨酸和胱氨酸通過促進(jìn)小鼠體外成熟卵母細(xì)胞合成谷胱甘肽(Glutathione,GSH)的方法提高受精率，這種提高與濃度有很大的關(guān)系，并且只有在200 μM才能顯著提高，更高濃度具有相反的效果。安鐵洙等[12]研究結(jié)果表明在M16培養(yǎng)液中添加EDTA和L-谷氨酰胺后，小鼠卵母細(xì)胞體外受精率有了明顯的提高，由原來的26%提高到51%，并且進(jìn)一步指出這種現(xiàn)象可能是由于EDTA與某些金屬離子發(fā)生螯合作用的結(jié)果，而谷氨酰胺一般被認(rèn)為是胚胎發(fā)育48 h內(nèi)的主要能源物質(zhì)。沈維干等[13]提出氟化鈉具有明顯的生殖毒性，其對卵母細(xì)胞的成熟具有破壞作用，同時還會降低卵母細(xì)胞的受精能力。在不同操作方法對卵母細(xì)胞體外受精的影響方面，研究者將卵母細(xì)胞分為卵丘卵母細(xì)胞、裸卵和人為操作的裸卵(即機(jī)械裸卵)，其中裸卵的體外受精率要比卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體的體外受精率高。同時，其它研究也證明卵丘和透明帶對卵母細(xì)胞體外受精起重要的作用[14-15]。但在體外受精相關(guān)研究中，由于試驗方法和培養(yǎng)液等條件的不同，試驗過程中卵裂率也不盡相同，所以本試驗研究不同精子獲能時間，精卵孵育時間，精子密度以及顆粒細(xì)胞等條件對卵母細(xì)胞體外受精的影響，從而探索和優(yōu)化小鼠卵母細(xì)胞體外受精及早期胚胎發(fā)育的最適環(huán)境。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

本試驗所用試驗動物為昆明系小白鼠，SPF等級，22～25 g雌鼠，共30只，8～10周齡雄鼠，共10只，購置于鄭州大學(xué)試驗動物中心。

1.2 主要試劑和儀器

1.2.1 主要試劑 礦物油(M8410,500 mL)、透明質(zhì)酸酶購自Sigma；孕馬血清促性腺激素PMSG購自寧波第二激素廠；卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液(M2)、精子獲能液(HTF)、體外受精液(TYH)、胚胎培養(yǎng)液(KSOM)購自南京愛貝生物科技有限公司；PBS、M199(含Hepes)購自GIBCO；四孔板購自NUNC；塑料細(xì)胞培養(yǎng)皿(35 mm)、塑料細(xì)胞培養(yǎng)皿(60 mm)購自NEST；一次性針頭濾器(0.22 μM)購自Millipore。

1.3 小鼠卵母細(xì)胞的體外成熟

選取健康未孕的昆明系雌性小鼠，采用腹腔注射方法注入孕馬血清促性腺激素(PMSG)，每只小鼠注入10 IU，48 h后頸部脫臼法處死小鼠，剪開腹腔并摘取卵巢。卵巢首先放入PBS中洗去血液和脂滴，再放入提前準(zhǔn)備好的體外操作液M199(含Hepes)中，整個操作在37 ℃恒溫板上進(jìn)行；用1 mL注射器針頭刺破卵巢表面的卵泡，釋放出卵母細(xì)胞。在體式顯微鏡下用吸卵針挑選出形狀規(guī)則，胞質(zhì)均勻的GV期卵母細(xì)胞，包括帶有顆粒細(xì)胞的卵母細(xì)胞(COCs)和不帶顆粒細(xì)胞的卵母細(xì)胞(NO)，在卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液M2中洗2～3次，放入提前做好的M2培養(yǎng)液液滴中洗2～3次，最后放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 h后，排出第一極體的體外成熟卵母細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)的體外受精試驗。

1.4 小鼠卵母細(xì)胞的體外受精

1.4.1 小鼠精子的采集和體外獲能 選取健康的昆明系雄性小鼠，將小鼠頸部脫臼致死，將睪丸，附睪和輸精管一起剪下，放入提前備好的PBS中清洗，洗去脂滴和血液，并使附睪和輸精管與睪丸分離，附睪和輸精管放入提前平衡好的300 μL HTF中，撕碎附睪和輸精管，而后放入CO2培養(yǎng)箱孵育10 min，使精子游出。精子游出后，HTF中的碎組織剔除后離心，離心時間為3 min，2 000 r/min。離心完畢，棄去上清液，在離心管中加入已經(jīng)平衡好的200 μL HTF，然后放入37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行精子的體外獲能，根據(jù)不同的獲能時間分為40 min、60 min和80 min三個試驗組。上述過程均需要在37 ℃恒溫板上進(jìn)行。

1.4.2 小鼠卵母細(xì)胞和精子的孵育 將獲能完成后的精子進(jìn)行離心，時間為3 min，2 000 r/min。離心后棄去上清液，在沉淀物中加入提前平衡好的TYH，混合均勻后調(diào)整精子密度，根據(jù)不同的精子密度分為3×105個/mL、3×106個/mL和3×107個/mL三個試驗組；將體外成熟的卵母細(xì)胞COCs和NO分別在TYH中洗2～3次，移入含有精子的TYH中，然后放入37 ℃，5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行體外受精，根據(jù)不同的受精時間分為2 h、4 h、6 h、8 h四個試驗組。整個操作過程均需在37 ℃恒溫板上進(jìn)行。

1.4.3 小鼠早期胚胎的培養(yǎng) 卵母細(xì)胞和精子在TYH中分別培養(yǎng)2 h、4 h、6 h、8 h后，將受精后的卵母細(xì)胞從TYH中移出，用預(yù)熱過的KSOM中洗2～3次，移入平衡好的KSOM中，培養(yǎng)24 h后觀察受精卵卵裂情況，并計算卵裂率。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)用SPSS22.00軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用F檢驗對試驗結(jié)果進(jìn)行差異顯著性分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 精子獲能時間對小鼠卵母細(xì)胞體外受精的影響

由表1可以看出，在COCs體外受精試驗中，精子獲能時間40 min、60 min、80 min的試驗組間受精卵卵裂率沒有顯著差異，精子獲能時間80 min試驗組受精卵卵裂率最高。在NO體外受精試驗中，精子獲能時間60 min試驗組受精卵卵裂率最高，獲能時間80 min試驗組卵裂率最差。精子獲能時間60 min試驗組與精子獲能時間40 min試驗組間無顯著差異，與精子獲能時間80 min試驗組間存在顯著差異(P<0.05)。綜上所述，精子獲能時間對NO的卵裂率存在一定影響，精子獲能時間為60 min試驗組的卵裂率最高，精子獲能時間對于COCs卵裂率不存在顯著影響。

表1 精子獲能時間對小鼠卵母細(xì)胞體外受精的影響Table 1 Effect of the sperm capacitation time on mouse oocyte fertilization in vitro

2.2 精卵孵育時間對小鼠卵母細(xì)胞體外受精的影響

由表2可以看出，在COCs體外受精試驗中，精卵孵育時間為2 h的試驗組，受精卵卵裂率最高，與精卵孵育時間4 h、6 h試驗組間均沒有顯著差異。精卵孵育時間為8 h的試驗組，受精卵卵裂率最低。精卵孵育時間2 h、4 h、6 h試驗組與精卵孵育時間8 h試驗組間存在顯著差異，且受精卵卵裂率顯著高于精卵孵育時間8 h試驗組(P<0.05)。在NO體外受精試驗中，精卵孵育時間為6 h試驗組的卵裂率最高，與精卵孵育時間2 h試驗組間沒有顯著差異，與精卵孵育時間4 h差異顯著(P<0.05)，與8 h試驗組間存在極顯著差異(P<0.01)，而且精卵孵育時間8 h的試驗組中受精卵卵裂率最低。綜上所述，精卵孵育時間對小鼠卵母細(xì)胞體外受精結(jié)果存在影響，COCs體外受精結(jié)果顯示精卵孵育時間2 h獲得的效果最好，NO的精卵孵育時間為6 h時效果最好。

表2 精卵孵育時間對小鼠卵母細(xì)胞體外受精的影響Table 2 Effect of sperm-egg incubation time on mouse oocyte fertilization in vitro

2.3 精子密度對小鼠卵母細(xì)胞體外受精的影響

由表3可以看出，在COCs體外受精試驗中，精子密度3×105/mL試驗組的受精卵卵裂率最高，精子密度為3×105/mL試驗組與精子密度為3×106/mL試驗組之間沒有顯著差異，精子密度為3×107/mL試驗組與精子密度3×106/mL試驗組、精子密度3×105/mL試驗組間存在顯著差異(P<0.05)，顯著低于精子密度為3×106/mL和精子密度為3×105/mL試驗組的受精卵卵裂率。在NO體外受精試驗中，精子密度為3×106/mL試驗組的卵裂率最高。精子密度3×106/mL試驗組的卵裂率顯著高于精子密度3×105/mL試驗組(P<0.05)，而且極顯著高于精子密度3×107/mL試驗組(P<0.01)。綜上所述，精子密度對于卵母細(xì)胞卵裂率有影響，NO和COCs體外受精過程中，均是當(dāng)精子密度為3×106/mL時，受精卵的卵裂效果最好。

表3 精子密度對小鼠卵母細(xì)胞體外受精的影響Table 3 Effect of sperm density on mouse oocyte fertilization in vitro

2.4 顆粒細(xì)胞對小鼠卵母細(xì)胞體外受精的影響

由表4可以看出，在小鼠卵母細(xì)胞體外受精過程中，NO的卵裂率與COCs的卵裂率之間存在顯著差異(P<0.05)，NO的卵裂率要顯著高于COCs的卵裂率。

表4 顆粒細(xì)胞對小鼠卵母細(xì)胞體外受精的影響Table 4 Effect of granulose cells on mouse oocyte fertilization in vitro

3 討 論

在卵母細(xì)胞體外受精過程中，將獲能后的精子與體外培養(yǎng)成熟的卵母細(xì)胞進(jìn)行精卵孵育時發(fā)現(xiàn)，在COCs體外受精過程中，精卵孵育2 h試驗組的卵裂率最高，達(dá)到36.09%；在NO體外受精過程中，精卵孵育6 h試驗組的卵裂率最高，達(dá)到55.99%。而江楠等[16]研究小鼠卵母細(xì)胞體外受精的結(jié)果顯示精卵共孵育2 h時，受精率達(dá)到85.4%，囊胚形成率達(dá)到75.6%。與本研究結(jié)果相差20%，對比之后發(fā)現(xiàn)原因可能是由于精子體外獲能液與受精液不同所造成的。本文所用的精子獲能液為TYH獲能液，體外受精液為HTF，而江楠等[16]在卵母細(xì)胞培養(yǎng)，精子獲能，體外受精以及胚胎早期培養(yǎng)時所用培養(yǎng)液均為HTF，并且在培養(yǎng)液中添加了牛血清清蛋白，計量為4 g/L。在 HTF體外受精液含有高鈣配方，這可能是造成出現(xiàn)上述結(jié)果的原因。

在研究顆粒細(xì)胞對小鼠卵母細(xì)胞體外受精的影響過程中，將培養(yǎng)成熟后的卵母細(xì)胞分為COCs以及NO兩個試驗組，試驗結(jié)果顯示NO卵裂率達(dá)到55.99%，COCs卵裂率僅為33.75%，兩者之間存在顯著差異，NO卵裂率要顯著高于COCs卵裂率。這個試驗結(jié)果與劉淑娟等[17]在昆白系小鼠體外受精一文中指出的結(jié)果不同，顆粒細(xì)胞對于小鼠的體外受精有一定的促進(jìn)作用，并且指出，顆粒細(xì)胞可增加精子對透明帶的敏感性，具有防止透明帶變硬和延長卵母細(xì)胞壽命的作用。而有研究進(jìn)一步指出，去除卵丘細(xì)胞的卵母細(xì)胞的受精率要低于沒有去除卵丘細(xì)胞的卵母細(xì)胞受精率，并指出原因可能是由于經(jīng)過透明質(zhì)酸酶處理的卵母細(xì)胞的透明帶結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，導(dǎo)致受精率下降。試驗結(jié)果存在差異的原因是多方面的，精子獲能液，體外受精液，胚胎培養(yǎng)液的不同，均有可能出現(xiàn)與其他科研人員結(jié)果不一致的情況。其中，在胚胎培養(yǎng)階段，很多研究者采用卵裂培養(yǎng)液G1，囊胚培養(yǎng)液G2，可以得到較高的卵裂率。段彪等[18]在精子獲能時間及精卵共孵育時間對小鼠體外受精和胚胎發(fā)育的影響一文中采用G-IVF作為受精液，以G1/G2作為胚胎發(fā)育液，在獲能時間60 min，受精時間為6 h的情況下受精率達(dá)到86.4%，卵裂率達(dá)到85.4%。這個結(jié)果比本文用HTF作為受精液，KSOM作為胚胎培養(yǎng)液的卵裂率高出近30%。出現(xiàn)這種情況的原因是由于G1/G2系統(tǒng)中存在不同成分的組合，這些成分之間有互補(bǔ)效應(yīng)。G1/G2系統(tǒng)含有氨基酸，而KSOM培養(yǎng)液中沒有。其中，G1培養(yǎng)液中含有一些非必需氨基酸以及谷氨酰胺，這些對于小鼠早期胚胎的卵裂率有一定的提高作用，而在G2培養(yǎng)液中，則包括有G1培養(yǎng)液中所含有的成分和一些必需氨基酸，對于不含有谷氨酰胺的必需氨基酸則有助于提高8細(xì)胞以后的胚胎發(fā)育[19]。