AQP-1、AQP-3 在大腸癌中的表達與腫瘤進展及腹水關(guān)系的研究

趙繼先 王志祥 焦曉萌 劉志剛

1.北京市昌平區(qū)醫(yī)院，北京102200；2.河北北方學院解剖教研室，河北 張家口075000

腹水是多種惡性腫瘤的伴隨癥狀，腹水及腹腔沖洗液中找到癌細胞提示腫瘤腹腔播散轉(zhuǎn)移的可能，惡性腹水產(chǎn)生可能與脈管通透性增加、淋巴管回流受阻、免疫調(diào)節(jié)細胞功能失調(diào)等因素有關(guān)。而決定腹水量和癌細胞出現(xiàn)的關(guān)鍵因素必然與血管通透性密切相關(guān)。水通道蛋白（aquaporins，AQPs）是與血管通透性密切相關(guān)的一組細胞因子。AQPs 是細胞膜上的一組快速轉(zhuǎn)運水的膜蛋白家族，在體內(nèi)分布廣泛，AQP-1 可以實現(xiàn)水分子的細胞內(nèi)外的雙向轉(zhuǎn)運，同時還介導(dǎo)上皮細胞、多種腫瘤細胞的遷移與血管新生；AQP-3 對水具有相對選擇的通透性，除轉(zhuǎn)運水外還轉(zhuǎn)運尿素或甘油。上述指標是否與腫瘤腹水相關(guān)少見報道，本研究收集大腸癌患者的資料，結(jié)合腫瘤細胞AQP1、AQP3 的表達情況探討腹水產(chǎn)生的機制及其高危因素。

1 材料和方法

1.1 臨床材料 收集本院普外科、腫瘤科患者90 例，男52 例，女38 例，年齡45～71 歲，平均（50.5±2.1）歲，均為手術(shù)治療患者，其中升結(jié)腸癌46 例，直腸癌26 例，橫結(jié)腸癌6 例，降結(jié)腸癌6 例，乙狀結(jié)腸癌6 例；伴有腹水60 例，所有病例均經(jīng)腹水細胞學及手術(shù)病理證實。以腸鏡活檢良性病變患者30 例為對照組，男性17例，女性13 例，平均（48.6±1.8）歲，其中黏膜慢性炎癥16 例，增生性息肉8 例，腺瘤樣息肉6 例。兩組患者年齡、性別無統(tǒng)計學差異（P＜0.05），具有可比性。

1.2 方法 腹水患者入院次日清晨抽取腹水送檢，收集所有患者的大腸癌石蠟包埋組織進行免疫組化檢測，收集其臨床病理參數(shù)進行綜合分析。AQP1、AQP3一抗試劑均購自北京中山試劑公司，主要免疫組化步驟：石蠟包埋，4μm 連續(xù)切片，二甲苯脫蠟、梯度酒精至水，3%過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化酶，PBS 緩沖液振洗，微波爐進行抗原熱修復(fù)，正常山羊血清封閉、一抗冰箱過夜，二抗、三抗各1 小時，DAB 顯色10～15分鐘，復(fù)染核脫水透明，中性樹膠封片。

1.3 結(jié)果判斷 著色細胞＜10%為陰性，＞10%為陽性。AQP1 陽性部位定位在血管內(nèi)皮細胞膜，AQP3 定位于腫瘤細胞膜。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0 統(tǒng)計分析軟件，對各組間陽性表達率的比較進行χ2檢驗，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 AQP-1、AQP-3 陽性表達的形態(tài)學觀察 AQP-1陽性表達部位在大腸癌間質(zhì)微血管內(nèi)皮細胞膜以及良性大腸上皮病變間質(zhì)的血管內(nèi)皮細胞，良性病變中的表達較弱，呈淡黃色，且緊鄰增生腺上皮間質(zhì)的陽性細胞分布較為集中，而遠離部位的表達較弱，大腸癌間質(zhì)中的陽性表達分布均勻，但新生薄壁血管的表達較為明顯；AQP-3 在大腸良性病變中表達在腺上皮中呈彌散分布，強度中等，增生性息肉較腺瘤呈低水平表達，而在大腸癌組織中的分布呈彌漫一致的高表達。見圖1～4。

圖1 AQP-1 在大腸癌間質(zhì)血管內(nèi)皮的表達（×200）

圖2 AQP-3 在大腸癌間質(zhì)血管內(nèi)皮的表達（×200）

圖3 AQP-1 在正常大腸黏膜間質(zhì)血管內(nèi)皮表達（×200）

圖4 AQP-3 在正常大腸黏膜間質(zhì)血管內(nèi)皮表達（×200）

2.2 AQP-1、AQP-3 陽性表達率與大腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.2.1 AQP-1 陽性表達。大腸癌組織中AQP-1 陽性表達率為75.6%（68/90），明顯高于正常黏膜20.0%（6/30），差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），惡性腹水組陽性率90.0%（54/60）明顯高于無腹水組46.7%（P＜0.05），且AQP-1與腹水量、腹腔沖洗液找到癌細胞、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)；在腹水大于1000mL、腹腔沖洗液找到癌細胞、浸潤腸壁全層、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組陽性率明顯較高（P＜0.01）。見表1。

2.2.2 AQP-3 陽性表達。大腸癌組織中AQP-3 陽性表達率70.0%（63/90），明顯高于正常黏膜23.3%（7/30），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），惡性腹水組陽性率86.7%（52/60）明顯高于無腹水組36.7%（P＜0.05），且AQP-3與腹水、腹水找到癌細胞、脈管內(nèi)癌栓、網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移、腹膜轉(zhuǎn)移相關(guān)；在腹水找到癌細胞、脈管內(nèi)癌栓、腹膜轉(zhuǎn)移、網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移組陽性率明顯較高（P＜0.01）。見表1。

2.3 AQP-1、AQP-3 陽性表達間相關(guān)性分析 AQP-1、AQP-3 陽性表達在良性病變中無相關(guān)性（r=0.3122，P＞0.05），兩者在大腸癌組織中的表達呈正相關(guān)（r=0.7837，P＜0.05）。

表1 不同組別大腸癌AQP-1、AQP-3 陽性表達率的比較（%）

3 討論

腹水是多種腫瘤出現(xiàn)腹腔轉(zhuǎn)移和惡性度增加的臨床癥狀，但是腫瘤性腹水產(chǎn)生的原理尚不清楚，以往的研究顯示腫瘤性腹水產(chǎn)生與腫瘤侵襲腹膜，血管內(nèi)皮受損、通透性增加、腫瘤壓迫門靜脈和下腔靜脈、腫瘤導(dǎo)致的低蛋白血癥從而引起膠體滲透壓下降有關(guān)［1-4］。目前研究認為腫瘤引起的腹水還與血管內(nèi)皮生長因子、基質(zhì)金屬蛋白酶、免疫調(diào)節(jié)異常等因素有關(guān)［1-2］。而惡性腫瘤生長過程中代謝旺盛，對水的需求增加，細胞內(nèi)外滲透壓的變化頻率加快，不僅要求血管內(nèi)皮細胞的通透性增加，而且腫瘤細胞內(nèi)外滲透壓的不斷變化有利于腫瘤細胞變形，在間質(zhì)中獲得營養(yǎng)并運動遷徙［5，6］。因此。腫瘤組織微環(huán)境的高滲透壓和血管的高通透性既是腫瘤生長的必需條件，也促進腫瘤細胞進一步生長和浸潤轉(zhuǎn)移的必備條件。

AQP 是與液體分泌吸收密切相關(guān)的細胞膜蛋白家族，在上皮細胞和血管內(nèi)皮細胞中含量尤為豐富，AQP-1 在除中樞神經(jīng)系統(tǒng)外的所有血管內(nèi)皮細胞均有表達，在膽管上皮癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、前列腺癌、結(jié)腸癌都有較高的表達，缺乏AQP-1 的小鼠其腫瘤血管發(fā)生于內(nèi)皮細胞遷移明顯受損。AQP-1 基因敲除小鼠的主動脈內(nèi)皮細胞對趨化因子的刺激比野生型小鼠明顯減慢［7，8］。腫瘤細胞內(nèi)AQP-1 的過表達后細胞外形、體積生長均不受影響，但是細胞的滲透壓增加5～10 倍，且肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生概率增加4 倍。AQP-3 廣泛表達于多種組織的細胞膜上，在腎臟泌尿、腺體分泌、肺內(nèi)液體轉(zhuǎn)運、腸道脂肪消化吸收及腦水腫形成等生理、病理過程中具有重要作用［9，10］。本研究發(fā)現(xiàn)AQP-1 陽性表達部位在大腸癌間質(zhì)微血管內(nèi)皮細胞膜以及良性大腸上皮病變間質(zhì)的血管內(nèi)皮細胞，良性病變中的表達較弱，呈淡黃色，且緊鄰增生腺上皮間質(zhì)的陽性細胞分布較為集中，而遠離部位的表達較弱，大腸癌間質(zhì)中的陽性表達分布均勻，但新生薄壁血管的表達較為明顯；AQP-3 在大腸良性病變中表達在腺上皮中呈彌散分布，強度中等，增生性息肉較腺瘤呈低水平表達，而在大腸癌組織中的分布呈彌漫一致的高表達，說明AQP-1、AQP-3 的表達與大腸癌的發(fā)生密切相關(guān)。同時顯示大腸癌組織中AQP-1 陽性表達率明顯高于正常黏膜，腹水組陽性率明顯高于無腹水組，且AQP-1陰性表達率與腹水量、腹腔沖洗液找到癌細胞、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)；在腹水大于1000mL、腹腔沖洗液找到癌細胞、浸潤腸壁全層、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組陽性率較高；大腸癌組織中AQP-3 陽性表達率明顯高于正常黏膜；腹水組陽性率明顯高于無腹水組，且AQP-3陽性表達率與腹水、腹水找到癌細胞、脈管內(nèi)癌栓、網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移、腹膜轉(zhuǎn)移相關(guān)；在腹水找到癌細胞、脈管內(nèi)癌栓、腹膜轉(zhuǎn)移、網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移組陽性率較高；說明隨著大腸癌的發(fā)展，浸潤深度的增加，對營養(yǎng)需求的增加導(dǎo)致血管內(nèi)皮細胞滲透性增加，腫瘤血管生成旺盛，AQP-1、AQP-3 表達升高，這不僅導(dǎo)致局部細胞外微環(huán)境中的漿液性滲出，而且便利腫瘤細胞進入血管系統(tǒng)發(fā)生遠處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

同時，AQP-1、AQP-3 陽性表達在良性病變中表達不存在相關(guān)，兩者在大腸癌組織中的表達存在明顯相關(guān)。說明惡性腫瘤代謝，新生血管增加，內(nèi)皮細胞的不成熟等因素導(dǎo)致AQP-1、AQP-3 同時升高，在疾病進展中密切協(xié)同。