結(jié)直腸癌根治術(shù)后腸道菌群、miR-10a表達變化及微生態(tài)腸內(nèi)營養(yǎng)干預(yù)作用

金佳琪,賈新能,宣俊毅,義烏市中心醫(yī)院 浙江省義烏市 322000

0 引言

結(jié)直腸癌是消化道最常見惡性腫瘤之一,資料顯示[1,2],結(jié)直腸癌發(fā)病率僅次于肺癌、乳腺癌,被稱為世界第三大惡性腫瘤,每年約有70萬例結(jié)直腸癌患者死亡.目前,臨床治療結(jié)直腸癌患者以結(jié)直腸癌根治術(shù)為主,放療、化療為輔,手術(shù)可有效切除腫瘤病灶,在控制腫瘤進展、延長患者生存期方面具有良好效果[3].但手術(shù)操作導(dǎo)致患者腸道屏障受損,易發(fā)生腸道菌群失調(diào).相關(guān)研究[4,5]指出,結(jié)直腸癌根治術(shù)后腸道菌群失調(diào)與患者預(yù)后、甚至術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)、發(fā)展有關(guān),加強相關(guān)干預(yù)非常有必要.微生態(tài)腸內(nèi)營養(yǎng)干預(yù)是治療結(jié)直腸癌術(shù)后腸道菌群失調(diào)的安全、可靠方法,同時能明顯增強患者免疫功能,抑制炎癥反應(yīng)[6,7].此外,微小RNA-10a(microRNA-10a,miR-10a)被證實具有調(diào)控機體固有免疫、獲得性免疫的作用,與炎癥性腸病的發(fā)病密切相關(guān),參與腸粘膜的炎癥損傷過程[8].基于此,本研究嘗試探討結(jié)直腸癌根治術(shù)后腸道菌群、miR-10a表達變化情況,并分析miR-10a表達與腸道菌群失調(diào)的關(guān)系,及腸道菌群、miR-10a表達在評估微生態(tài)腸內(nèi)營養(yǎng)干預(yù)效果方面的價值.報告如下.

1 材料和方法

1.1 材料 經(jīng)我院倫理委員會審批通過(審批號為S789356),選取2017-07/2020-06我院107例結(jié)直腸癌根治術(shù)患者作為研究對象,其中男57例,女50例；年齡39-78歲,平均(61.38±8.29)歲；侵襲深度：63例T1-T2,44例T3-T4；臨床分型：49例腫塊型,35例潰瘍型,23例浸潤型；DUKE分期：68例A、B期,39例C、D期.其中侵襲深度、臨床分型、DUKE分期均參照《中國結(jié)直腸癌診療規(guī)范(2017年版)》[9]判定.

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合結(jié)直腸癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[9],并經(jīng)術(shù)后病理診斷確診；(2)原發(fā)病灶均經(jīng)結(jié)直腸癌根治術(shù)切除；(3)腫瘤無遠處轉(zhuǎn)移；(4)術(shù)前1 mo內(nèi)未服用過抗生素、微生態(tài)活菌制劑及導(dǎo)瀉藥；(5)患者知曉本研究,已簽署同意書.

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他原發(fā)惡性腫瘤者；(2)伴有腸道梗阻、胃穿孔等其他胃腸道疾病者；(3)自身免疫性疾病患者；(4)嚴(yán)重感染性疾病患者；(5)血液系統(tǒng)疾病患者；(6)精神疾病患者；(7)嚴(yán)重心腦血管疾病、肝腎功能障礙者.

1.2 方法 腸道菌群檢測方法：所有患者均于結(jié)直腸癌根治術(shù)后2 wk取中段、新鮮糞便標(biāo)本,由專業(yè)檢測人員進行腸道菌群檢測,具體檢測方法：采用無菌試杯收集患者新鮮糞便1 g,于30 min內(nèi)檢測,取0.1 g新鮮糞便標(biāo)本,采用0.9 mL稀釋液充分稀釋,采用10倍稀釋法稀釋至1000 mL,隨后采用血瓊脂及麥康凱平板接種,37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后分離出乳酸桿菌、雙歧桿菌、腸球菌及真桿菌,采用平板計數(shù)法對菌株計數(shù).參照相關(guān)文獻[10]將腸道菌群情況分為菌群正常、菌群失調(diào)Ⅰ度和菌群失調(diào)Ⅱ度.

微生態(tài)腸內(nèi)營養(yǎng)干預(yù)方法：根據(jù)術(shù)后2 wk腸道菌群檢測結(jié)果,給予腸道菌群失調(diào)患者微生態(tài)腸內(nèi)營養(yǎng)干預(yù),經(jīng)營養(yǎng)管滴入腸內(nèi)營養(yǎng)混懸液[紐迪希亞制藥(無錫)有限公司,國藥準(zhǔn)字H20010285],速度15 mL/h,第1 d滴入250 mL,第2 d適當(dāng)增加腸內(nèi)營養(yǎng)混懸液滴入速度,共入滴入500 mL,第3 d起,視患者耐受情況,逐漸增加到1000-1500 mL,共干預(yù)7 d.干預(yù)結(jié)束后再次采集患者中段、新鮮糞便標(biāo)本進行腸道菌群檢測.

miR-10a檢測方法：于結(jié)直腸癌根治術(shù)后2 wk、微生態(tài)腸內(nèi)營養(yǎng)干預(yù)后,分別采集微生態(tài)腸內(nèi)營養(yǎng)干預(yù)前后患者外周靜脈血3 mL,以3500 r/min轉(zhuǎn)速離心處理5 min(離心半徑8 cm)后取血清,置于-70 ℃冷藏室保存,由專業(yè)檢測人員統(tǒng)一檢測,取血清標(biāo)本,采用實時熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測血清miR-10a水平,Trizol法提取心臟組織總RNA,RNA提取試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司),取1 μL按1：50稀釋,混勻,采用紫外分光光度儀檢測RNA質(zhì)量與濃度,后以1.2%甲醛變性凝膠電泳.根據(jù)miRRase 18.0版,利用Primer 5引物設(shè)計軟件對所設(shè)計的引物進行選擇與確認(rèn).以U6為內(nèi)參,逆轉(zhuǎn)錄引物為5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3',miR-10a上游引物、下游引物分別為5'-GCGGTAAGTGCTTCCATGTT TTAGTAG-3'、5'-ATGAACTCTGCGGATGGTG-3'.上下游引物均購自廣州銳博生物科技有限公司.隨后進行熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),試劑盒購自德國Qiagen公司,檢測操作均由專業(yè)人員嚴(yán)格按照試劑盒說明書完成,選取U6為內(nèi)參照,應(yīng)用公式2-ΔΔct計算miR-10a相對表達水平.

1.3 觀察指標(biāo) (1)不同腸道菌群情況患者腸道菌群、miR-10a表達；(2)分析結(jié)直腸癌根治術(shù)后腸道菌群、miR-10a表達與腸道菌群失調(diào)的關(guān)系；(3)腸道菌群紊亂患者微生態(tài)腸內(nèi)營養(yǎng)干預(yù)前后腸道菌群、miR-10a表達；(4)不同微生態(tài)腸內(nèi)營養(yǎng)干預(yù)療效患者臨床資料、腸道菌群、miR-10a表達,臨床資料包括性別、年齡、病程、侵襲深度、臨床分型、DUKE分期,菌群失調(diào)下降≥1度為療效良好,＜1度則為不良[11]；(5)分析微生態(tài)腸內(nèi)營養(yǎng)干預(yù)療效的影響因素；(6)分析腸道菌群、miR-10a表達對微生態(tài)腸內(nèi)營養(yǎng)干預(yù)療效的評估價值；(7)分析腸道菌群失調(diào)患者腸道菌群與miR-10a表達的相關(guān)性.

統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)處理采用SPSS 22.0軟件,計數(shù)資料以例數(shù)描述,采用χ2檢驗,計量資料以mean±SD描述,多組間比較采用單因素方差分析,進一步兩兩組間比較采用SNK-q檢驗,組內(nèi)比較采用配對t檢驗,兩組間比較采用獨立樣本t檢驗,相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)系數(shù)模型,通過Logistic進行多因素回歸分析,評估效能分析采用受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線,獲取曲線下面積(area under the curve,AUC)、置信區(qū)間、敏感度、特異度及cut-off值,不同評估方案間曲線下面積比較采用DeLong檢驗,均采用雙側(cè)檢驗,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 不同腸道菌群情況患者腸道菌群、miR-10a表達對比 不同腸道菌群情況患者乳酸桿菌、雙歧桿菌、腸球菌及真桿菌菌群菌落數(shù)、miR-10a表達相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05).見表1.

2.2 腸道菌群、miR-10a表達與腸道菌群失調(diào)的關(guān)系以結(jié)直腸癌根治術(shù)后是否發(fā)生腸道菌群失調(diào)為因變量(未發(fā)生=0,發(fā)生=1),納入腸道菌群、miR-10a作為自變量,進行Logistic回歸分析顯示,乳酸桿菌、雙歧桿菌、腸球菌及真桿菌菌群菌落數(shù)、miR-10a表達與結(jié)直腸癌根治術(shù)后腸道菌群失調(diào)有關(guān)(P＜0.05).見表2.

2.3 微生態(tài)腸內(nèi)營養(yǎng)干預(yù)前后腸道菌群、miR-10a表達與干預(yù)前相比,微生態(tài)腸內(nèi)營養(yǎng)干預(yù)后乳桿菌、雙歧桿菌、真桿菌菌群菌落數(shù)及miR-10a均明顯升高,腸球菌菌群菌落數(shù)明顯下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05).見表3.

2.4 不同療效患者臨床資料、干預(yù)后腸道菌群、miR-10a表達 不同療效患者性別、病程、侵襲深度、臨床分型、干預(yù)前乳酸桿菌、雙歧桿菌、腸球菌及真桿菌菌群菌落數(shù)、miR-10a表達相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義；療效良好患者年齡、DUKE分期、干預(yù)后乳酸桿菌、雙歧桿菌、腸球菌及真桿菌菌群菌落數(shù)、miR-10a表達相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05).見表4.

2.5 微生態(tài)腸內(nèi)營養(yǎng)干預(yù)療效影響因素 以微生態(tài)腸內(nèi)營養(yǎng)干預(yù)療效為因變量(賦值：療效良好=1,療效不佳=2),將結(jié)果2.4中有差異因素納入Logistic回歸分析,結(jié)果顯示,年齡、DUKE分期、干預(yù)后乳酸桿菌、雙歧桿菌、腸球菌及真桿菌菌群菌落數(shù)、miR-10a表達均為微生態(tài)腸內(nèi)營養(yǎng)干預(yù)療效的影響因素(P＜0.05).見表5.

2.6 腸道菌群、miR-10a表達對微生態(tài)腸內(nèi)營養(yǎng)干預(yù)效果的評估價值 繪制干預(yù)后腸道菌群、miR-10a表達評估微生態(tài)腸內(nèi)營養(yǎng)干預(yù)效果的ROC曲線,結(jié)果顯示各指標(biāo)評估的AUC均＞0.7,其中乳桿菌評估的AUC最大,為0.78,截斷值下評估敏感度、特異度分別為64.71%、84.44%.見表6、圖1.

表1 不同腸道菌群失調(diào)患者腸道菌群、miR-10a表達對比(mean±SD)

表2 腸道菌群、miR-10a表達與腸道菌群失調(diào)的關(guān)系

2.7 腸道菌群失調(diào)患者腸道菌群與miR-10a表達相關(guān)性腸道菌群失調(diào)患者微生態(tài)腸內(nèi)營養(yǎng)干預(yù)后乳桿菌、雙歧桿菌、真桿菌菌群菌落數(shù)與miR-10a間存在正相關(guān)關(guān)系,腸球菌菌群菌落數(shù)與miR-10a間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系(P＜0.05).見圖2-5.

表3 微生態(tài)腸內(nèi)營養(yǎng)干預(yù)前后腸道菌群、miR-10a表達對比(mean±SD)

圖1 腸道菌群、miR-10a表達評估干預(yù)效果的ROC曲線.

表4 不同療效患者臨床資料、干預(yù)后腸道菌群、miR-10a表達對比[(mean±SD)/n(%)]

圖2 乳桿菌菌群菌落數(shù)與miR-10a相關(guān)性.

圖3 雙歧桿菌菌群菌落數(shù)與miR-10a相關(guān)性.

表5 微生態(tài)腸內(nèi)營養(yǎng)干預(yù)療效影響因素

表6 腸道菌群、miR-10a表達評估干預(yù)效果的價值分析

圖4 真桿菌菌群菌落數(shù)與miR-10a相關(guān)性.

圖5 腸球菌菌群菌落數(shù)與miR-10a相關(guān)性.

3 討論

腸道菌群是組成腸道保護屏障的重要部分,而結(jié)直腸癌根治術(shù)圍術(shù)期需進行多種準(zhǔn)備和操作,如術(shù)前腸道準(zhǔn)備、手術(shù)切除腸道、禁食、術(shù)后抗生素的應(yīng)用等,均會給腸道菌群平衡帶來明顯影響[12,13].腸道菌群失調(diào)可導(dǎo)致大量細菌產(chǎn)生腸道毒素,加重患者局部炎癥反應(yīng),降低機體免疫功能,也在一定程度上影響腫瘤浸潤[14,15].

本研究發(fā)現(xiàn),結(jié)直腸癌根治術(shù)后發(fā)生菌群失調(diào)患者乳酸桿菌、雙歧桿菌、真桿菌菌群菌落數(shù)明顯低于菌群正?；颊?而腸球菌則明顯高于菌群正?；颊?進一步經(jīng)多因素分析發(fā)現(xiàn)上述腸道菌群菌落數(shù)變化與結(jié)直腸癌根治術(shù)后菌群失調(diào)的發(fā)生顯著相關(guān).腸道菌群以厭氧菌為基礎(chǔ),其中乳酸桿菌、雙歧桿菌、真桿菌是組成腸道菌群的主要益生菌,益生菌與腸上皮細胞在特異性受體結(jié)合情況下形成一道保護屏障,此屏障具有一定層次性,受占位效應(yīng)保護,在阻礙腸球菌等有害菌增殖方面發(fā)揮重要作用[16,17].手術(shù)等一系列操作導(dǎo)致乳酸桿菌、雙歧桿菌等益生菌菌落數(shù)減少,其抑制有害菌的作用減弱,致使腸球菌菌落數(shù)增加,最終形成腸道菌群失調(diào)[18].本研究還發(fā)現(xiàn),結(jié)直腸癌根治術(shù)后發(fā)生菌群失調(diào)患者血清miR-10a表達水平明顯降低,且其水平降低可明顯增加術(shù)后腸道菌群失調(diào)發(fā)生風(fēng)險,提示miR-10a表達與腸道菌群失調(diào)有關(guān).miR-10a是定位于17號染色體短臂HOXB4與HOXB5之間的非編碼RNA,其在多種惡性腫瘤中表達降低,如胃癌、前列腺癌[19,20].新近研究指出[21],轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌細胞中miR-10a表達降低,與腫瘤的轉(zhuǎn)移和浸潤呈負(fù)相關(guān).程海霞等[22]研究發(fā)現(xiàn),miR-10a具有介導(dǎo)腸道黏膜屏障功能的作用,并指出結(jié)直腸癌患者圍手術(shù)期應(yīng)用益生菌可有效上調(diào)miR-10a表達.本研究發(fā)現(xiàn),對結(jié)直腸癌根治術(shù)后發(fā)生菌群失調(diào)患者進行微生態(tài)腸內(nèi)營養(yǎng)干預(yù)7 d后,患者血清miR-10a均高于干預(yù)前,與上述研究結(jié)果一致,同時患者乳桿菌、雙歧桿菌、真桿菌、腸球菌菌群菌落數(shù)均得到明顯改善,且本研究通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)患者干預(yù)后乳桿菌、雙歧桿菌、真桿菌菌群菌落數(shù)與miR-10a呈正相關(guān),腸球菌菌群菌落數(shù)與miR-10a呈負(fù)相關(guān).筆者認(rèn)為微生態(tài)腸內(nèi)營養(yǎng)干預(yù)能上調(diào)血清miR-10a表達水平,miR-10a可介導(dǎo)腸道黏膜屏障相關(guān)蛋白表達,從而修復(fù)、改善腸道黏膜屏障功能,進而糾正腸道菌群失調(diào).

從本研究結(jié)果2.4可見,不同微生態(tài)腸內(nèi)營養(yǎng)干預(yù)療效患者的干預(yù)后乳酸桿菌、雙歧桿菌、腸球菌及真桿菌菌群菌落數(shù)、miR-10a表達存在明顯差異,進一步經(jīng)多因素分析發(fā)現(xiàn)上述指標(biāo)均與療效顯著相關(guān),據(jù)此筆者推測干預(yù)后腸道菌群、miR-10a表達可作為評估微生態(tài)腸內(nèi)營養(yǎng)干預(yù)療效的指標(biāo).本研究首次采用ROC曲線分析干預(yù)后腸道菌群、miR-10a表達對微生態(tài)腸內(nèi)營養(yǎng)干預(yù)效果的評估價值,結(jié)果發(fā)現(xiàn)各指標(biāo)評估干預(yù)效果的AUC均在0.7以上,具有良好評估效能,證實了筆者推測的正確性,各指標(biāo)中乳桿菌評估的AUC最大,為0.78,可為臨床評估微生態(tài)腸內(nèi)營養(yǎng)干預(yù)療效提供更準(zhǔn)確參考.本研究還發(fā)現(xiàn),年齡＞60歲、DUKE分期為C、D期均為微生態(tài)腸內(nèi)營養(yǎng)干預(yù)療效不良的危險因素,因此對于老年、DUKE分期較高的結(jié)直腸癌患者,臨床應(yīng)給予足夠重視,加強術(shù)后微生態(tài)腸內(nèi)營養(yǎng)干預(yù),盡量糾正腸道菌群失調(diào).

4 結(jié)論

綜上可知,結(jié)直腸癌根治術(shù)后腸道菌群、miR-10a表達變化是發(fā)生腸道菌群失調(diào)的影響因素,采用微生態(tài)腸內(nèi)營養(yǎng)干預(yù)在改善腸道菌群、miR-10a表達方面具有良好效果,干預(yù)后通過檢測腸道菌群、miR-10a表達可輔助臨床評估干預(yù)效果,具有較高臨床應(yīng)用價值.但本研究收集的病例數(shù)有限,研究結(jié)果可能存在一定偏倚,后續(xù)工作中仍需納入更多病例進一步驗證.

文章亮點

實驗背景

結(jié)直腸癌為臨床常見惡性腫瘤,近年來其發(fā)病率逐漸升高,本研究主要探討直腸癌根治術(shù)后腸道菌群失調(diào)、基因表達變化,以期獲得指導(dǎo)術(shù)后干預(yù)的指標(biāo).

實驗動機

隨著直腸癌患者的增加,直腸癌根治術(shù)隨之增多,本研究主題為探究手術(shù)引起的腸道菌群失調(diào)、基因表達變化情況,并分析其在微生態(tài)腸內(nèi)營養(yǎng)干預(yù)效果的關(guān)系,以期明確腸道菌群、相關(guān)基因表達變化情況在指導(dǎo)干預(yù)措施制定方面的指導(dǎo)價值.

實驗?zāi)繕?biāo)

本研究主要目標(biāo)為分析結(jié)直腸癌根治術(shù)后腸道菌群、微小RNA-10a(microRNA-10a,miR-10a)表達變化情況,并分析微生態(tài)腸內(nèi)營養(yǎng)干預(yù)的作用,旨在為結(jié)直腸癌根治術(shù)后干預(yù)措施的制定提供參考.

實驗方法

本研究選取我院107例結(jié)直腸癌根治術(shù)患者,根據(jù)其術(shù)后腸道菌群情況分組,所有患者均于結(jié)直腸癌根治術(shù)后2 wk取中段、新鮮糞便標(biāo)本及血清標(biāo)本,檢測術(shù)后2周腸道菌群及血清miR-10a水平,通過對比不同腸道菌群情況患者腸道菌群、miR-10a表達變化,分析腸道菌群、miR-10a表達與腸道菌群失調(diào)的關(guān)系,并對腸道菌群紊亂患者予以微生態(tài)腸內(nèi)營養(yǎng)干預(yù),對比干預(yù)前后患者腸道菌群、miR-10a表達,不同療效患者臨床資料、腸道菌群、miR-10a表達,分析微生態(tài)腸內(nèi)營養(yǎng)干預(yù)療效影響因素,通過ROC曲線分析腸道菌群、miR-10a表達對微生態(tài)腸內(nèi)營養(yǎng)干預(yù)療效的評估價值,采用Pearson相關(guān)系數(shù)模型分析腸道菌群失調(diào)患者腸道菌群、miR-10a表達相關(guān)性.

實驗結(jié)果

本研究通過實驗達到了主要目標(biāo),結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1)結(jié)直腸癌根治術(shù)后菌群正?；颊呷樗釛U菌、雙歧桿菌、真桿菌菌群菌落數(shù)、miR-10a表達均高于菌群失調(diào)Ⅰ度、Ⅱ度患者,菌群失調(diào)Ⅰ度患者高于菌群失調(diào)Ⅱ度患者,腸球菌均低于菌群失調(diào)Ⅰ度、Ⅱ度患者,菌群失調(diào)Ⅰ度患者低于菌群失調(diào)Ⅱ度患者(P＜0.05)；(2)隨著乳酸桿菌、雙歧桿菌、真桿菌菌群菌落數(shù)、miR-10a表達降低、腸球菌菌群菌落數(shù)升高,結(jié)直腸癌根治術(shù)后腸道菌群失調(diào)發(fā)生風(fēng)險升高(P＜0.05)；(3)腸道菌群紊亂患者微生態(tài)腸內(nèi)營養(yǎng)干預(yù)后乳桿菌、雙歧桿菌、真桿菌菌群菌落數(shù)及miR-10a均高于干預(yù)前,腸球菌菌群菌落數(shù)低于干預(yù)前(P＜0.05)；(4)療效良好患者年齡≤60歲占比、DUKE分期A、B期占比、干預(yù)后乳酸桿菌、雙歧桿菌、真桿菌菌群菌落數(shù)、miR-10a表達均高于療效不良患者,干預(yù)后腸球菌低于療效不良患者(P＜0.05)；(5)年齡、DUKE分期、干預(yù)后乳酸桿菌、雙歧桿菌、腸球菌及真桿菌菌群菌落數(shù)、miR-10a表達均與微生態(tài)腸內(nèi)營養(yǎng)干預(yù)療效顯著相關(guān)(P＜0.05)；(6)干預(yù)后腸道菌群、miR-10a表達評估微生態(tài)腸內(nèi)營養(yǎng)干預(yù)效果的曲線下面積(AUC)均＞0.7,其中乳桿菌評估的AUC最大,為0.784,截斷值下評估敏感度、特異度分別為64.71%、84.44%；(7)腸道菌群失調(diào)患者微生態(tài)腸內(nèi)營養(yǎng)干預(yù)后乳桿菌、雙歧桿菌、真桿菌菌群菌落數(shù)與miR-10a呈正相關(guān),腸球菌菌群菌落數(shù)與miR-10a呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05).

實驗結(jié)論

結(jié)直腸癌根治術(shù)后腸道菌群、miR-10a表達變化是發(fā)生腸道菌群失調(diào)的影響因素,采用微生態(tài)腸內(nèi)營養(yǎng)干預(yù)在改善腸道菌群、miR-10a表達方面具有良好效果.

展望前景

本研究收集的病例數(shù)有限,研究結(jié)果可能存在一定偏倚,后續(xù)工作中仍需納入更多病例進一步驗證.未來我們將探究檢測腸道菌群、miR-10a表達在輔助臨床評估干預(yù)效果方面的價值,可通過設(shè)計對比試驗進行探討.