牛膝防治慢性牙周炎機制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究①

趙 今，吳澤鈺，龔 怡，王 琛

（1新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院/附屬口腔醫(yī)院牙體牙髓科，2新疆維吾爾自治區(qū)口腔醫(yī)學(xué)研究所，烏魯木齊830054）

慢性牙周炎（chronic periodontitis，CP）是牙菌斑與宿主免疫反應(yīng)共同相互作用后，發(fā)生的一類炎癥性疾病。這種炎癥可以破壞牙周支持組織，進而形成牙周袋和牙槽骨吸收，最終導(dǎo)致牙齒松動脫落[1]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中，慢性牙周炎的治療有時會使用抗生素作為輔助用藥，以緩解機械治療不能到達(dá)的炎癥部位[2]。但是抗生素的一些副作用減少了使用頻率，而中醫(yī)以其良好的治療作用在許多國家引起了廣泛的關(guān)注和接受。牛膝為莧科牛膝屬植物（Achyranthis Bidentatae Radix）之干燥根，牛膝的用藥歷史悠久，藥源廣泛，具有很大的開發(fā)潛力[3]。在很多治療骨質(zhì)疏松的方劑中，牛膝是一味主要用藥?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，牛膝具有抗炎、抗衰老及增強免疫力等作用[4]。天然藥物中通常含有許多活性成分，一般可作用于多個靶點，這與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的思想有很大相似之處。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究牛膝提取物在治療CP的活性成分，及分析其潛在分子機制和藥理活性。

1 材料與方法

1.1篩選牛膝中活性成分及預(yù)測靶點 使用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫及分析平臺（TCMSP）篩選并整理牛膝化學(xué)成分及靶點。以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，化合物類藥性（drug likeness，DL）≥0.18為篩選條件，篩選出牛膝中的活性成分及作用靶點。

1.2 篩選CP靶點 以詞"chronic periodontitis，periodontitis"為關(guān)鍵詞，在Genecards、DrugBank、OMIM數(shù)據(jù)庫檢索，可獲得CP靶點。與牛膝所篩選出的作用靶點進行韋恩分析，得到牛膝治療CP的作用靶點。

1.3構(gòu)建“成分-靶點”網(wǎng)絡(luò) 將牛膝的化學(xué)成分及所篩選出的交集靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，進行“成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建，Network Analyzer計算網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，度值（degree）、中心度（betweenness centrality，BC）、接近中心性（closeness centrality，CC）和拓?fù)湎禂?shù)（topological coefficient）。

1.4構(gòu)建蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò) 所得的交集靶點導(dǎo)入STRING 11.0數(shù)據(jù)庫，設(shè)置“homo sapiens”屬性，置信度得分＞0.4，利用Network Analyzer分析拓?fù)鋵傩?，?gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5基因本體（gene ontology,GO）和京都基因和基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）富集分析 利用Cluster Profiler軟件包對獲得的靶點進行GO富集分析及KEGG富集分析繪圖，篩選生物途徑和分子功能篩選錯誤率(false discovery rate，F(xiàn)DR)＜0.001，P＜0.001，篩選有顯著性差異的生物過程和信號通路。

1.6通路-CP靶點-牛膝活性成分網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將通路、靶點和成分導(dǎo)入Cytoscape3.7.2中，利用的“Merge”功能合并，構(gòu)建“通路-靶點-成分”網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1牛膝活性成分篩選 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫及藥代動力學(xué)（ADME）參數(shù)篩選出牛膝的活性成分20個，見表1。

表1 牛膝主要活性成分及參數(shù)

2.2 牛膝與CP的共同靶點 檢索得到CP相關(guān)的疾病靶點4 543個，去除重復(fù)后得2 132個。檢索得到牛膝作用靶點826個，去除重復(fù)后得457個。韋恩分析二者交集靶點（圖1），獲得牛膝與CP共有靶點183個，其中包括腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、白介素-10（Interleukin 10，IL-10）、白介素-6（Interleukin 6，IL-6）等，見表2。

2.3“成分-靶點”網(wǎng)絡(luò) 網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)分析顯示，化合物的平均度數(shù)為5.9，其中度數(shù)較大（度數(shù)＞10）的化合物為槲皮素、漢黃芩素、黃芩素、山奈酚、黃芩苷、豆甾醇、β谷甾醇、小檗堿、刺苷A、黃連堿、表小檗堿、巴馬汀。牛膝中各成分作用于多種靶點，多條線互相交織。根據(jù)獲得的交集靶點，對應(yīng)到牛膝中18個主要成分，共含248個節(jié)點，1 738條邊緣，并根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)中的度值從大到小依次進行排列，見圖2、表3。

圖1牛膝與CP的Venn圖

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)分析 將183個交集靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，進行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析，得到PPI網(wǎng)絡(luò)（圖3A）。根據(jù)度值大小篩選出前30位的靶點（圖3B），其中前10位分別為是AKT1、IL-6、TNF、VEGFA、TP53、EGFR、PTGS2、CASP3、JUN、MAPK1（表4）。

表2牛膝治療CP的成分作用靶點信息

圖2 牛膝-成分-靶點-牙周炎網(wǎng)絡(luò)關(guān)系

表3 牛膝活性成分的拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)分析

圖3牛膝化學(xué)成分治療CP靶點-蛋白相互作用

2.5 GO和KEGG富集分析 對上述183個交集靶點進行GO富集分析，設(shè)置閾值P＜0.01，生物過程(biological process，BP)相關(guān)條目880個，涉及抑菌活性、細(xì)胞對有機環(huán)化合物的反應(yīng)等方面；分子功能(molecular function，MF)相關(guān)條目49個，涉及DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、RNA聚合酶II特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等方面；細(xì)胞成分(cellular component，CC)相關(guān)條目23個，涉及膜筏、膜區(qū)等方面。BP、MF、CC功能分別GO富集分析出的前5條條目信息見表5。MF、CC、CC功能GO富集分析結(jié)果見圖4～6。KEGG分析得到265條信號通路，根據(jù)P值篩選出101條通路。其中信號通路包括糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路等；疾病通路有癌癥通路、流體剪應(yīng)力與動脈粥樣硬化、乙肝、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染等通路。見圖7、表5。

表4牛膝治療CP核心蛋白互作的拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)

表5牛膝治療CP的潛在靶點GO富集分析結(jié)果（各前5條）

圖4 MF功能GO富集分析結(jié)果

圖5 CC功能GO富集分析結(jié)果

圖6 BP功能GO富集分析結(jié)果

圖7牛膝治療CP的潛在靶點的KEGG富集分析

表5牛膝治療CP的潛在靶點KEGG富集分析（前10條）

2.6 牛膝活性成分-核心CP靶點-代謝通路網(wǎng)絡(luò)“通路-靶點-牛膝成分”網(wǎng)絡(luò)可見45個信號通路、183個核心靶點、18個藥物成分間關(guān)系密切，見圖8。提示，牛膝中的多種活性成分可能通過調(diào)節(jié)多條信號通路以調(diào)節(jié)慢性牙周炎的炎癥、成骨等過程。

圖8 牛膝活性成分-核心靶點-通路網(wǎng)絡(luò)

3 討論

CP是口腔疾病中常見疾病，臨床表現(xiàn)常以牙齦腫脹，牙槽骨吸收最終牙齒松動脫落為主要發(fā)展過程，這已成為人類失牙的主要原因之一。有效的牙周治療仍是一個長期的難題，牙周治療的目標(biāo)以消除牙周病的感染和炎癥過程為主[5]。研究發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)藥可通過藥物配伍控制菌斑、殺滅微生物、促組織再生、消炎等治療牙周炎[6]。

牛膝是我國的一味傳統(tǒng)中藥，歷史非常悠久，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，因為形狀似牛膝而得名。本研究得出牛膝在治療CP時含有18種有效成分。其中黃芩苷是牛膝中的主要成分之一，黃芩苷治療牙周疾病的過程中，在抑菌和抗炎中發(fā)揮了很好的效果[7]。牛膝中的蛻皮甾酮經(jīng)過細(xì)胞實驗證實能夠顯著促進成骨細(xì)胞的增殖以及分化，牛膝甾酮能夠顯著上調(diào)成骨分化相關(guān)標(biāo)志物，最終促進成骨細(xì)胞的早期分化和晚期礦化能力[8]。近年來的研究表明，牛膝中的成分不僅能抑制小鼠耳廓腫脹，而且也能抑制毛細(xì)血管的通透性增加[9]，抵抗炎癥反應(yīng)。其抗炎機制可能與抑制活化巨噬細(xì)胞炎性因子TNF-α，IL1β的釋放有關(guān)[10]。根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)分析，與牛膝治療CP有關(guān)的前10位靶點分別是AKT1、IL6、TNF、VEGFA等。其中AKT是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，被PI3K激活并募集到質(zhì)膜上，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和凋亡方面起著重要作用[11]。而TNF-α能夠增加破骨細(xì)胞前體細(xì)胞數(shù)量、誘導(dǎo)骨髓中巨噬細(xì)胞的破骨分化及破骨細(xì)胞成熟從而促進骨吸收[12]，IL-6不僅可以促進成骨細(xì)胞活化并產(chǎn)生破骨細(xì)胞分化因子，進一步加速破骨細(xì)胞形成[13]，而且還參與牙周炎的炎癥過程，其濃度的變化與牙周炎的炎癥程度相關(guān)，并抑制牙周膜的再生[14]。VEGFA是血管發(fā)育中最重要的生長因子，它促進骨祖細(xì)胞分化，還可以促進骨相關(guān)細(xì)胞因子如膠原、相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runx2）、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)和堿性磷酸酶(ALP)的分泌[15]。

本研究對牛膝治療CP所富集到的183個靶點進行GO和KEGG信號通路分析，涉及到抑菌活性、創(chuàng)傷愈合、細(xì)胞遷移的正調(diào)控等952個GO條目。已有研究證明槲皮素對牙齦假單胞菌的各種毒力因子均有很好的抑制作用[16]。牙周組織的再生依賴于有效和平穩(wěn)的傷口愈合過程，而創(chuàng)傷愈合過程在很大程度上取決于血管生成[17]。研究發(fā)現(xiàn)牛膝提取物主要通過促進細(xì)胞遷移來促進體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和體內(nèi)斑馬魚的血管生成，也可加速成纖維細(xì)胞由G0/G1期進入S期，促進成纖維細(xì)胞的增殖，從而促進創(chuàng)面愈合[18]。這體現(xiàn)了牛膝治療CP多成分、多靶點的作用特點。KEGG富集分析得到與牛膝治療CP相關(guān)的信號通路有101條，其中涉及了糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路等。AGEs通過RAGE、MAPK和NF-κB途徑增加IL-6和ICAM-1的表達(dá)，可能加重牙周病發(fā)病的進程[19]。此外，Lin等[20]的研究發(fā)現(xiàn)，IL-17刺激健康人牙周膜細(xì)胞后，p38、ERK1/2和JNK磷酸化水平均明顯增強。實驗證明，牛膝提取物中的黃芩苷可降低ERK、p38、JNK等蛋白的磷酸化，進一步抑制炎癥因子的產(chǎn)生和細(xì)胞凋亡，在牙周炎的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用[21]。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，闡述了牛膝中的主要成分、潛在治療CP的靶點、作用途徑及可能的機制。探究了牛膝治療CP具有多成分、多靶點、多途徑的特點，為今后牛膝在治療CP中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)，具體作用機制還需進一步實驗進行驗證。