細(xì)菌素-納米金殼核結(jié)構(gòu)的形成和特性表征

圖爾蓀阿依·圖爾貢，王 帆，葛達(dá)娥，努爾古麗·熱合曼，劉小莉*

（1 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所 南京210014 2 新疆師范大學(xué) 烏魯木齊830054）

納米金 （Gold nanoparticles，AuNPs）是直徑在0.5～250 nm 范圍的金超微粒子，具有獨(dú)特的量子效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)和極大的比表面積，與各種配體有相對較高的相容性，可以實(shí)現(xiàn)對生物大分子的精確定位，而且對生物系統(tǒng)沒有毒害作用，因而作為藥物傳遞載體在生物、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用[1-3]。

金納米顆粒的化學(xué)合成方法很多，最為簡單和經(jīng)典的是Turkevitch 等[4]在1951年發(fā)表的使用檸檬酸鈉作還原劑，巰基丙酸鈉作穩(wěn)定化配體的方法，然而，在Turkevitch 法制備納米金過程中，容易出現(xiàn)AuNP 穩(wěn)定性不好，發(fā)生聚集沉淀的現(xiàn)象[5]。許多學(xué)者普遍認(rèn)為在納米粒子合成過程中，添加蛋白質(zhì)或肽類成分包裹在納米粒子表面，生物蛋白分子作為“帽子”試劑與納米顆粒形成核-殼結(jié)構(gòu)，可以保護(hù)納米顆粒，防止團(tuán)聚，提高穩(wěn)定性。目前很多研究者發(fā)現(xiàn)采用微生物代謝產(chǎn)物、植物提取物等作為還原劑和穩(wěn)定劑制備納米金[6-8]，然而，培養(yǎng)微生物、準(zhǔn)備植物浸提物過程比較繁瑣、費(fèi)時(shí)。

食品工業(yè)中微生物污染所引起的腐敗變質(zhì)非常普遍，解決這個(gè)問題最為簡便有效的方法就是使用食品保鮮劑。化學(xué)合成防腐劑因潛在的毒性和致癌作用而受到廣泛質(zhì)疑，乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素一直被人們認(rèn)為是化學(xué)合成防腐劑的理想替代品[9]，如目前市場上廣泛使用的乳酸鏈球菌素（Nisin）[10]。不論是乳酸鏈球菌素還是其它細(xì)菌素，雖對大多數(shù)革蘭氏陽性菌（G+）有良好的抑制作用，但不能有效抑制革蘭氏陰性菌（G-），而且有部分研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)了抗性的G+菌株，其主要原因是保鮮劑不能穿透細(xì)胞壁或細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部發(fā)揮抑菌作用。

納米金具有很好的生物相容性[11]，可滲透進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部[12]。如果將納米金和細(xì)菌素結(jié)合，細(xì)菌素作為穩(wěn)定劑帽子（capping agent）與納米金形成殼核結(jié)構(gòu)，納米金攜帶細(xì)菌素協(xié)助其破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜屏障，為細(xì)菌素進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部打開通道，發(fā)揮抑菌作用，則將是解決食品工業(yè)防腐問題的有效途徑。本研究在檸檬酸還原法合成AuNPs 的基礎(chǔ)上，在反應(yīng)體系中加入前期研究獲得的一種新型細(xì)菌素[13]，通過單因素試驗(yàn)優(yōu)化AuNPs 制備條件，通過測定反應(yīng)體系紫外-可見光譜、表面電勢、粒徑大小、形狀等分析制備條件對AuNPs-細(xì)菌素殼核結(jié)構(gòu)合成的影響。采用透射電鏡觀察殼核結(jié)構(gòu)產(chǎn)物與金黃色葡萄球菌、志賀氏菌混合后對細(xì)菌細(xì)胞膜的穿透能力，評(píng)估AuNPs 作為載體協(xié)助細(xì)菌素對食品腐敗菌的抑制作用。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 材料與試劑 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC25923）、志賀氏菌（Shigella flexneri CMCC51606）；LB 液體培養(yǎng)基；氯金酸（分析純），上海麥克林生化科技有限公司；二水合檸檬酸三鈉（分析純），西隴化工股份有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備 JG-05 型UV-vis 光譜儀，美國BioTeK 公司；ZS90 型Zeta 電位儀，英國Malvern 公司；100CXⅡ型透射電鏡，日本日立公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 納米金的制備 采用改良的Turkevitch 法制備AuNPs[4]。配制氯金酸儲(chǔ)備液（0.34 g 氯金酸，于100 mL 純水中溶解，濃度10 mol/L）以及二水合檸檬酸三鈉儲(chǔ)備液（4.05 g，溶解于100 mL 純水中，濃度40 mol/L）。取玻璃試管，各取1 mL 氯金酸儲(chǔ)備液和二水合檸檬酸三鈉儲(chǔ)備液，加8 mL 純水，使氯金酸和二水合檸檬酸三鈉終濃度分別為1 mol/L 和4 mol/L，加入10 mg/mL 新型細(xì)菌素。避光條件下在一定溫度下水浴，直至溶液顏色變?yōu)樽霞t色。

1.2.2 納米金制備條件的優(yōu)化 設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)，分別在不同反應(yīng)溫度（30～100 ℃）、不同反應(yīng)pH （4～10）、不同反應(yīng)時(shí)間（10～60 min）下制備AuNPs-細(xì)菌素殼核結(jié)構(gòu)產(chǎn)物，根據(jù)反應(yīng)速率及肉眼觀察納米金溶液顏色變化初步判斷納米金最佳制備條件。

1.2.3 紫外-可見光譜分析 紫外-可見光譜被認(rèn)為是檢測金屬納米顆粒特征性表面等離子體共振（SPR）帶的重要技術(shù)。將不同條件下制備的AuNPs-細(xì)菌素殼核結(jié)構(gòu)產(chǎn)物分別進(jìn)行紫外-可見光譜掃描，根據(jù)表面等離子體共振吸收峰值大小及其移動(dòng)位置進(jìn)一步確定最佳制備條件。設(shè)定掃描參數(shù)為波長200～800 nm，夾縫寬度1 nm，分析速度200 nm/min。

1.2.4 表面電勢測定 將不同條件下制備的AuNP-細(xì)菌素復(fù)合物溶膠注入樣品池，采用Zeta電位分析儀測定溶膠的表面電勢、粒度分布和分散性指數(shù)。每樣品測3 組表面電勢，求平均值。

1.3 透射電鏡表征

1.3.1 納米金的透射電鏡表征 吸取制備所得的AuNP-細(xì)菌素殼核結(jié)構(gòu)產(chǎn)物滴到碳膜覆蓋的銅網(wǎng)上，室溫條件下自然晾干，采用透射電鏡觀察納米金粒子的大小和形貌。

1.3.2 納米金與細(xì)菌共培養(yǎng)的透射電鏡觀察 以金黃色葡萄球菌、志賀氏菌為指示菌，利用LB 液體培養(yǎng)基活化菌體，150 r/min、37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，備用。取已活化的菌液2 mL 至離心管中，10 000 r/min 離心3 min，用PBS 緩沖溶液洗滌2～3 次收集菌體，加入1 mL AuNPs-細(xì)菌素復(fù)合物溶液，于200 r/min、37 ℃ 條件下放置6～8 h，5 000 r/min 離心收集菌體后加入2.5%戊二醛固定12 h，樣品脫水后包埋，切片，經(jīng)檸檬酸鉛溶液和醋酸雙氧鈾溶液染色后，采用透射電鏡觀察。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)結(jié)果以重復(fù)性條件下獲得的3 次獨(dú)立測定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Origin 8.5軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 納米金制備條件優(yōu)化

紫外-可見光譜對高分散和締合態(tài)存在的金屬顆粒有完全不同的響應(yīng)，通過分析其譜圖，可以得到有關(guān)顆粒粒度和結(jié)構(gòu)等重要信息[14]。研究發(fā)現(xiàn)，金屬離子溶液在特定體系中被還原成納米粒子后會(huì)產(chǎn)生不同顏色的納米粒子溶膠，在特定波長范圍內(nèi)產(chǎn)生特征性等離子吸收峰，利用這一特性可快速檢測納米粒子的產(chǎn)生。而且吸收峰位置的藍(lán)移或紅移也能在一定程度上反映納米粒徑和形貌的變化。AuNPs 顆粒的等離子體共振分為橫向伸縮振動(dòng)與縱向伸縮振動(dòng)，當(dāng)AuNPs 為球形時(shí)，表現(xiàn)出橫向伸縮振動(dòng)，隨著粒徑的增大，最大吸收峰藍(lán)移，AuNPs 溶液的顏色發(fā)生由深黃色-粉紅色-酒紅色-紫紅色-藍(lán)色-黑色沉淀的變化[15]。另外，Zeta 電位在確定納米粒子在溶液中的穩(wěn)定性和分散性方面被認(rèn)為是一個(gè)重要的參數(shù)。在20世紀(jì)40年代，楊志等[16]提出了描述膠體穩(wěn)定的理論，認(rèn)為膠體體系的穩(wěn)定性是當(dāng)顆粒相互接近時(shí)它們之間的雙電層互斥力與范德瓦爾互吸力的凈結(jié)果。此理論提出當(dāng)顆粒接近時(shí)顆粒之間的能量障礙來自于互斥力，當(dāng)顆粒有足夠的能量克服此障礙時(shí)，互吸力將使顆粒進(jìn)一步接近并不可逆地黏在一起。Zeta 電位對分散體系的凝結(jié)穩(wěn)定性和其流變性，以及界面和分散體系的相互作用有密切關(guān)系。Zeta 電位可作為膠體體系穩(wěn)定性的指示。如果顆粒帶有很多負(fù)的或正的電荷，也就是說很高的Zeta 電位，它們會(huì)相互排斥，從而達(dá)到整個(gè)體系的穩(wěn)定性；如果顆粒帶有很少負(fù)的或正的電荷，也就是說它的Zeta 電位很低，它們會(huì)相互吸引，從而達(dá)到整個(gè)體系的不穩(wěn)定性。根據(jù)研究表明，當(dāng)反應(yīng)體系的分散性指數(shù)（PDI）越低時(shí)，體系穩(wěn)定性越強(qiáng)[17-18]。

2.1.1 反應(yīng)時(shí)間對納米金合成的影響 Haiss等[19]的研究表明，金納米顆粒在520～540 nm 可見光區(qū)域的吸收峰與納米顆粒大小存在對應(yīng)關(guān)系。從圖1可以看出本研究中不同時(shí)間條件下納米金溶液在520～525 nm 范圍內(nèi)具有最大吸收峰，反應(yīng)體系的紫外-可見光譜沒有發(fā)生明顯的藍(lán)移或者紅移，說明反應(yīng)時(shí)間的變化對納米金的粒徑影響不大。50 min 納米金產(chǎn)量最大，60 min 產(chǎn)量反而下降。通過觀察溶液顏色發(fā)現(xiàn)由深紅色逐漸變成紫紅色，50 min 開始出現(xiàn)聚集現(xiàn)象。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，Zeta 電位先增大后變小，反應(yīng)時(shí)間到達(dá)30 min 時(shí)Zeta 電位到達(dá)最高絕對值45.3±4.36，平均粒徑最小為38.86±0.52，平均多分散性指數(shù)最低為0.33±0.02（表1），其穩(wěn)定性強(qiáng)，因此優(yōu)選反應(yīng)時(shí)間為30 min。

圖1 不同反應(yīng)時(shí)間對納米金合成的影響Fig.1 Effect of different reaction times on the synthesis of AuNPs

2.1.2 pH 值對納米金合成的影響 由圖2可知，pH 5 條件下，吸光值達(dá)到峰值，且與其它pH 條件相比發(fā)生明顯藍(lán)移，可能得到的納米金粒徑較小。隨著pH 的變大，納米金發(fā)生聚焦，顏色依次由淺紫紅色變深再變淺紅色，在偏堿情況下反應(yīng)體系中黑色沉淀增加，顏色透明。研究表明AuNPs 表面吸附的檸檬酸根負(fù)離子之間的靜電斥力能夠克服顆粒之間的范德華力而穩(wěn)定存在于溶液中，此時(shí)AuNPs 在溶液中呈分散狀態(tài)。當(dāng)提高溶液堿性時(shí)，AuNPs 表面檸檬酸根離子所帶負(fù)電荷將被中和，且隨著pH 值上升，AuNPs 發(fā)生聚集的程度增加[20]，試驗(yàn)結(jié)果與此理論相符。據(jù)表2所知，Zeta電位隨pH 值增加呈現(xiàn)減小的趨勢，同時(shí)納米金平均粒徑變大，吸收光譜值變大，出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，合成的納米金不穩(wěn)定。在微酸性條件下金納米顆粒平均粒徑小，紫外-可見吸收光譜大，穩(wěn)定性強(qiáng)。該結(jié)果表明微酸性系統(tǒng)中金納米顆粒含量多，粒徑小，反應(yīng)體系較穩(wěn)定。

表1 不同反應(yīng)時(shí)間對納米金Zeta 電位的影響Table 1 Effect of different reaction time on the AuNPs Zeta point

圖2 不同反應(yīng)pH 值對納米金合成的影響Fig.2 Effect of different reaction pH on AuNPs synthesis

表2 不同反應(yīng)pH 值對納米金Zeta 電位分析的影響Table 2 Effect of different reaction pH on the AuNPs Zeta analysis

2.1.3 反應(yīng)溫度對納米金合成的影響 反應(yīng)溫度對納米金的合成影響較大。當(dāng)溫度范圍在50～60 ℃時(shí)，納米金產(chǎn)量差異不大，當(dāng)溫度上升到70 ℃，產(chǎn)量出現(xiàn)一個(gè)小的峰值，溶液顏色較深，出現(xiàn)黑色沉淀，納米金聚集，之后隨著溫度進(jìn)一步升高，產(chǎn)量下降，但當(dāng)溫度達(dá)到100 ℃時(shí)出現(xiàn)最大吸收峰，納米金含量最多，而且曲線出現(xiàn)輕的藍(lán)移，納米金粒徑減小。Zeta 電位也隨溫度升高呈現(xiàn)上升趨勢，當(dāng)溫度達(dá)到100 ℃時(shí)，Zeta 電位值到達(dá)最高絕對值，平均粒徑最小，多分散性指數(shù)低，表明納米金穩(wěn)定性最強(qiáng)，是最佳反應(yīng)溫度。

圖3 不同反應(yīng)溫度對納米金合成的影響Fig.3 Effect of different reaction temperatures on AuNPs synthesis

表3 不同反應(yīng)溫度對納米金Zeta 電位的影響Table 3 Effect of different reaction temperatures on the AuNPs Zeta point

2.2 透射電鏡表征

由于納米金屬粒子直徑極微小，具有獨(dú)特的量子效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)和極大的比表面積，與各種不同的配體有相對較高的相容性[21]，很容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)[22]。圖4為最佳制備條件下（溫度100 ℃，pH 5，時(shí)間30 min）的納米金TEM 照片，可看出納米金均為球形，粒子粒徑分布均勻，粒徑范圍為15～20 nm，溶液呈現(xiàn)酒紅色。圖5是AuNPs-細(xì)菌素復(fù)合物與兩種食品腐敗菌混合后的透射電鏡圖，如圖所示，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)發(fā)生紊亂，細(xì)胞膜被破壞，納米金顆粒能夠穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，從而協(xié)助細(xì)菌素進(jìn)入細(xì)胞。

3 結(jié)論

圖4 納米金透射電鏡圖Fig.4 TEM images of AuNPs

圖5 納米金與菌體混合的透射電鏡圖Fig.5 TEM image of AuNPs distribution in bacterial cells

本文在改良經(jīng)典Turkevitch 法制備納米金的基礎(chǔ)上，在反應(yīng)體系中加入細(xì)菌素作為納米金的帽子試劑，增強(qiáng)納米金粒子的穩(wěn)定性，同時(shí)借助納米金穿透細(xì)胞膜的特點(diǎn)協(xié)助細(xì)菌素進(jìn)入腐敗菌內(nèi)部發(fā)揮抑菌作用。通過測定表面等離子共振吸收峰、表面電勢、粒徑等最后確定納米金最佳制備條件為：反應(yīng)體系pH 5，100 ℃反應(yīng)30 min。在此條件下制備的納米金經(jīng)透射電鏡檢測粒徑范圍為15～20 nm，以革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性菌志賀氏菌為指示菌，與AuNPs-細(xì)菌素復(fù)合物混合，透射電鏡顯示納米金能滲透進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)部，為下一步利用納米金協(xié)助食品防腐劑進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部發(fā)揮抑菌作用提供依據(jù)。