生、熟小米提取物降糖效果研究

尹瑞旸，薛 勇，胡錦蓉，胡小松，沈 群

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院 植物蛋白與谷物加工北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室國(guó)家果蔬加工工程技術(shù)研究中心 北京100083）

二型糖尿?。═2DM）是一種復(fù)雜的慢性代謝紊亂疾病，其特征是因胰島素抵抗的進(jìn)一步發(fā)展和胰島素效率降低導(dǎo)致的胰島素相對(duì)或絕對(duì)缺乏而引起高血糖癥狀[1]。T2DM 已成為全球公共衛(wèi)生面臨的一大挑戰(zhàn)，據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)合會(huì)（IDF）估計(jì)，2017年有超過(guò)4.25 億人患有糖尿病，到2045年這一數(shù)字預(yù)計(jì)將增加到6.29 億人。很多科學(xué)家都在尋找合適的藥物或者通過(guò)膳食干預(yù)來(lái)降低二型糖尿病對(duì)人體健康的影響。在1922年發(fā)現(xiàn)胰島素之前，糖尿病的治療主要是通過(guò)飲食控制和植物療法[2]。如今，人們普遍認(rèn)為植物性食品具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，其中超過(guò)400 種植物被用于糖尿病的治療。流行病學(xué)研究表明，谷類食物可以降低二型糖尿病的發(fā)展[3]。

作為粟類代表的小米，由于其種植地域的限制，對(duì)其研究也受到一定程度的限制。早在《神農(nóng)本草》中就記載其具有消渴的功效。國(guó)內(nèi)外的一些研究也指出其具有潛在的健康功效。人群實(shí)驗(yàn)表明，小米膳食可以顯著降低糖耐量減低受試者的空腹血糖、糖耐量后2 h 血糖、胰島素抵抗指數(shù)和肥胖程度[4]。小米的膳食纖維含量是大米的2～10倍，并含有一定量的抗性淀粉[5]，能夠改善餐后血糖反應(yīng)，避免應(yīng)激性低血糖[6]。小米中還富含多酚物質(zhì)（0.30%～3.00%）[7]，有較強(qiáng)的抗氧化作用。然而，關(guān)于小米多酚的降糖效果存在爭(zhēng)議。有研究表明小米多酚可顯著促進(jìn)脂肪分解，降低胰島素及瘦素，達(dá)到降糖的效果[8]；也有研究認(rèn)為小米多酚對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性不及高粱等其它雜糧，無(wú)法調(diào)節(jié)餐后血糖[9]。然而，目前的研究均未明確解析小米的降糖成分。此外，小米作為糧食作物，加工方式也決定了其營(yíng)養(yǎng)特性。加熱為最常見(jiàn)的處理方式，加熱過(guò)程可破壞小米中熱敏性物質(zhì)，使淀粉糊化及蛋白變性。通過(guò)對(duì)生、熟小米提取物的功效比較可以更好地了解其降糖組分的性質(zhì)。

針對(duì)上述情況，本試驗(yàn)系統(tǒng)分析了生、熟小米70%乙醇提取物對(duì)STZ 誘導(dǎo)的SD 大鼠糖脂代謝的影響。依次用正己烷、乙酸乙酯、正丁醇、水4 種不同極性溶劑萃取生、熟小米70%乙醇提取物，比較其抗氧化及α-淀粉酶抑制作用，從而初步判定小米的活性組分。本試驗(yàn)結(jié)果可為小米的生物功能研究提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8 周齡雄性SD 大鼠（動(dòng)物合格證號(hào)：11400700149680），購(gòu)至北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司（SCXK（京）2012-0001）。

1.1.2 試劑 以山西東方亮小米為研究對(duì)象，淀粉（68.2%）、蛋白（11.0%）、脂肪（6.7%）、總膳食纖維（2.04%）、維生素E（6.58 mg/kg）、阿魏酸（15.6 μg/100 g）。STZ，美國(guó)Sigma 公司；其它試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品提取 小米與水比例為1∶1.6 （小米500 g，加入800 mL 水），用電飯鍋蒸20 min，燜10 min。50 ℃，12 h 左右烘干，過(guò)80 目篩。此時(shí)糊化度達(dá)85%以上。

生、熟小米500 g，打粉機(jī)每30 s 停歇1 次，1次10 min，防止打粉機(jī)過(guò)熱，過(guò)80 目篩。料液比1∶10（小米∶70%乙醇），超聲5 s，停5 s 共30 次破碎。在50 ℃旋渦提取2 h。抽濾后將上清減壓蒸餾并冷凍干燥，得生小米70%乙醇粗提取物（UMC）、熟小米70%乙醇粗提取物（M-C），于-80 ℃保存。

將生、熟小米70%乙醇粗提物（UM-C、M-C）溶解在水中，加入與水等體積的正己烷，常溫萃取3 次，合并上相萃取液并減壓濃縮，得生、熟正己烷相粗提物（UM-HX、M-HX）；下相依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，合并萃取液并減壓濃縮，得乙酸乙酯相生、熟粗提物（UM-EA、M-EA），正丁醇相生、熟粗提物（UM-BT、M-BT）。有機(jī)溶劑萃取后的水相減壓濃縮，獲得水相生、熟粗提物（UM-W、MW）。將上述得到的5 種粗提物冷凍干燥，氮吹過(guò)夜，于-80 ℃保存。

1.2.2 動(dòng)物試驗(yàn)

1.2.2.1 大鼠的常規(guī)飼養(yǎng) 所有SD 大鼠用維持飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，飼養(yǎng)環(huán)境為SPF 級(jí)，晝夜對(duì)半交替，保證自由攝食及攝水。隨后隨機(jī)選取6 只為正常對(duì)照組，采用10%低脂飼料喂養(yǎng)，直至試驗(yàn)結(jié)束。其余改用60%高脂飼料喂養(yǎng)，維持4 周。

1.2.2.2 糖尿病大鼠的制備及分組 高脂飼養(yǎng)4周后的大鼠，經(jīng)隔夜禁食后，腹腔注射35 mg/kg 的STZ 溶液，繼續(xù)60%高脂飼養(yǎng)。STZ 注射3 d 后，隔夜禁食，尾尖取血測(cè)空腹血糖，以空腹血糖>10 mmol/L 為造模成功標(biāo)準(zhǔn)，篩選出血糖達(dá)標(biāo)的糖尿病大鼠，隨機(jī)分為模型對(duì)照組（D）、二甲雙胍陽(yáng)性對(duì)照組（Met，100 mg/kg bw）、生小米70%乙醇粗提物低劑量組 （UM-CL，200 mg/kg bw）、熟小米70%乙醇粗提物低劑量組（M-CL，200 mg/kg bw）、熟小米70%乙醇粗提物高劑量組（M-CH，400 mg/kg bw）。

1.2.2.3 口服糖耐量試驗(yàn)（OGTT）大鼠禁食（不禁水）12 h，各組大鼠經(jīng)口給予2.0 g/kg bw 葡萄糖溶液。在隨后120 min 內(nèi)，分別在0，30，60，120 min 割尾靜脈采血，血糖儀測(cè)定血糖。糖耐量曲線下面積（AUC）采用梯形法計(jì)算：

1.2.2.4 臟器系數(shù)測(cè)定 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處死后，立即取臟器，濾紙吸干表面水分稱其濕重，計(jì)算臟器系數(shù)：

1.2.3 DPPH 自由基清除能力測(cè)定 0.45 mmol/L DPPH 乙醇溶液與樣品溶液（0.5，1.0，2.0，4.0，8.0 mg/mL）1∶1 混合，室溫避光1 h 后，離心取上清，517 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。利用5～50 μmol/L Trolox 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。DPPH·清除率的計(jì)算公式為：

式中：A0——DPPH 溶液3 mL+無(wú)水乙醇/蒸餾水3 mL 的吸光度；A1——DPPH 溶液3 mL +樣品溶液3 mL 的吸光度；A2——樣品溶液3 mL+無(wú)水乙醇3 mL 的吸光度。

1.2.4 總抗氧化能力測(cè)定 將生、熟小米70%乙醇粗提物、正己烷、乙酸乙酯、正丁醇和水配制成不同的濃度梯度5.0，10.0，15.0，20.0，25.0 mg/mL，提取物消化液為5 mg/mL，沉淀物消化液為25 mg/mL，取1.0 mL 樣品溶液加入到3.0 mL 工作液中 （10 mmol/L 2，4，6-三吡啶基三嗪（TPTZ）、20 mmol/L FeCl3、0.3 moL/L 醋酸緩沖液以1∶1∶10 的比例混合，預(yù)熱至37 ℃?zhèn)溆茫?，搖勻后于37 ℃水浴中靜置10 min，593 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光值。另 以0.0125，0.0250，0.050，0.100，0.150，0.200，0.250 和0.300 mmol/L FeSO4作標(biāo)準(zhǔn)曲線（吸光度0.087～0.952），樣品的抗氧化活性以達(dá)到同樣吸光度值所需FeSO4的摩爾數(shù)表示。標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y =3.0485x + 0.0458，R2=0.999。

1.2.5 α-淀粉酶抑制作用測(cè)定 10 μL 樣品與50 μL 酶液混合（2 U/mL），加入50 μL 磷酸鈉緩沖溶液 （0.02 mol/L，pH 6.9），37 ℃孵育10 min。加入90 μL 可溶性淀粉溶液（0.5%），37 ℃反應(yīng)20 min。加入100 μL 二硝基水楊酸（DNS）溶液沸水浴10 min。冷卻至室溫后，540 nm 下測(cè)定。當(dāng)吸光值在0～2.22 時(shí)，吸光值與葡萄糖濃度有較好的線性關(guān)系，此方法所用酶及底物濃度、反應(yīng)時(shí)間產(chǎn)生的葡萄糖含量落在標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)（y=452.64x-0.064，R2=0.992）。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理方法 采用Excel 軟件統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)均為4 次重復(fù)試驗(yàn)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤。采用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行顯著性分析，P<0.05表示差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 粗提取物對(duì)大鼠體重及臟器指數(shù)的影響

由表1可知，隨著干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)，各組大鼠體重持續(xù)增長(zhǎng)，但干預(yù)組與模型組體重并無(wú)差異。臟器指數(shù)能夠反映藥物對(duì)相關(guān)器官的影響。各組大鼠的脾、睪丸及睪丸脂肪系數(shù)與D 組均無(wú)顯著差異。與正常對(duì)照組（ND）相比，D 組大鼠腎臟及肝臟系數(shù)均顯著增加，灌胃小米提取物的大鼠肝臟系數(shù)沒(méi)有明顯變化（與D 組相比）。Met、UM-CL組腎臟系數(shù)有所降低，但與D 組相比均無(wú)顯著差異。M-CL 組、M-CH 組大鼠腎臟系數(shù)升高，其中M-CH 顯著高于D 組大鼠（P<0.05）。

表1 粗提物對(duì)大鼠臟器指數(shù)的影響Table 1 Effects of crude extracts on visceral index in rats

2.2 粗提物對(duì)糖耐量及空腹血糖影響

注射STZ 成模后，經(jīng)過(guò)為期4 周的高脂喂養(yǎng)，D 組及干預(yù)組的空腹血糖顯著高于ND 組 （圖1a），并出現(xiàn)了糖耐量受損（IGT），OGTT 曲線下面積（AUC）增加（圖1b），與ND 組有極顯著差異（P<0.01）。二甲雙胍可顯著改善由STZ 聯(lián)合高脂誘導(dǎo)的大鼠IGT 及空腹血糖，AUC 及空腹血糖與D 組比有顯著差異（P<0.05）。UM-CL 可顯著改善大鼠IGT 及空腹血糖，其效果與二甲雙胍相當(dāng)，Met 組及UM-CL 組小鼠AUC 分別降低38.97%，19.95%。而熟小米粗提取物效果較差，在低/高濃度下AUC 及空腹血糖均與D 組無(wú)顯著差異。

圖1 粗提物對(duì)大鼠糖耐量影響Fig.1 Effect of crude extract on glucose tolerance in rats

2.3 粗提取物對(duì)大鼠血脂的影響

由表2可知，D 組大鼠血清中膽固醇（TC）及高密度脂蛋白（HDL）含量顯著低于ND 組大鼠（P<0.05）。經(jīng)過(guò)為期4 周的干預(yù)，干預(yù)組的TC、甘油三酯、低密度脂蛋白與模型組相比均無(wú)顯著性差異（P>0.05）。UM 組大鼠血清HDL 顯著高于D組（P<0.05）。

表2 粗提物對(duì)大鼠血脂的影響Table 2 Effect of crude extract on blood lipid in rats

2.4 生、熟小米提取物的DPPH 清除能力

如圖2所示。各提取物對(duì)DPPH 的清除效果與樣品濃度呈劑量依賴關(guān)系。各提取物的抗氧化能力存在較大差距，在樣品質(zhì)量濃度為8 mg/mL時(shí)，生小米組UM-C、UM-HX、UM-EA、UM-BT、UM-W 的DPPH 清除能力分別為（73.26±0.22）%，（50.91±0.40）%，（48.14±0.74）%，（80.19±1.31）%及（69.91±0.85）%（圖2a）；熟小米組M-C、M-HX、M-EA、M-BT、M-W 的DPPH 清除能力分別為（85.14±0.43）%，（37.57±0.73）%，（74.29±0.16）%，（87.61±0.32）%，（65.61±0.5）%（圖2b）。由圖2a 和圖2b 可知，各提取物的DPPH 清除能力為MBT>M-C>UM-BT>M-EA>UM-C>UM-W>M-W>UM-HX>UM-EA>M-HX?？梢?jiàn)，通過(guò)熟化處理后的M-C、M-BT 的DPPH 清除能力高于UM-C、UM-BT，說(shuō)明熟化后小米可能具有更好的DPPH清除能力。

圖2 生、熟小米提取物DPPH 清除能力Fig.2 DPPH scavenging capacity of raw and cooked millet extracts

2.5 生、熟小米提取物的總抗氧化能力比較

由圖3可知，不同提取物濃度與總抗氧化能力呈劑量依賴關(guān)系。當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為30 mg/mL時(shí)，UM-C、UM-HX、UM-EA、UM-BT 和UM-W 的總抗氧化能力分別為 （1.25±0.00），（0.33±0.01），（0.50±0.00），（0.93±0.01）及（1.92±0.02）mmol/L/mg（圖3a）。說(shuō)明生小米水提物的抗氧化能力優(yōu)于有機(jī)溶劑相，隨提取溶劑極性的減小，相應(yīng)提取物的總抗氧化能力減弱。當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為30 mg/mL時(shí)，M-C、M-HX、M-EA、M-BT 及M-W 的總抗氧化能力分別為 （0.97±0.00），（0.17±0.00），（1.09±0.00），（0.91±0.01）及（1.51±0.01）mmol/L/mg。小米熟化后的70%乙醇提取物、正己烷及水提物總抗氧化能力降低，乙酸乙酯提取物總抗氧化能力升高。

圖3 生、熟小米提取物總抗氧化能力Fig.3 Total antioxidant capacity of raw and cooked millet extracts

2.6 各提取物對(duì)α-淀粉酶抑制作用

α-淀粉酶抑制劑是一種糖苷酶抑制劑，通過(guò)抑制消化道內(nèi)淀粉酶活性，降低碳水化合物的水解和吸收，從而降低餐后血糖，用于糖尿病的預(yù)防與治療。各提取物對(duì)α-淀粉酶作用如圖4所示，其中，70%乙醇粗提物、正己烷提取物、乙酸乙酯提取物及正丁醇提取物對(duì)α-淀粉酶均有一定的抑制作用，而水提取對(duì)α-淀粉酶則有促進(jìn)作用。說(shuō)明在小米中，起到降低餐后血糖作用的物質(zhì)主要集中在70%乙醇粗提物、正己烷提取物、乙酸乙酯提取物及正丁醇提取物中，在0.125～8.00 mg/mL 范圍內(nèi)，這4 種提取物對(duì)α-淀粉酶的抑制作用隨濃度的增高而增強(qiáng)。在樣品質(zhì)量濃度4～8 mg/mL 范圍內(nèi)，抑制作用趨于平穩(wěn)，整體的抑制率未達(dá)到50%。當(dāng)質(zhì)量濃度為8 mg/mL 時(shí)，UM-C、UM-HX、UM-EA 及UM-BT 的抑制率分別為（29.89±0.64）%，（40.06±1.66）%，（40.86±0.26）%及（31.47±0.76）%（圖4a）。

熟小米提取物對(duì)α-淀粉酶作用結(jié)果與生小米類似，M-W 有較強(qiáng)的酶促進(jìn)作用。而M-HX 及M-EA 對(duì)酶的抑制作用相近（圖4b）。當(dāng)質(zhì)量濃度為8 mg/mL 時(shí)，M-C、M-HX、M-EA、M-BT 的α-淀粉酶作用分別為 （13.61±2.94）%，（39.61±0.36）%，（39.00±0.01）%，（21.08±1.85）%。

由圖4a、圖4b 和表3可知，各提取物的α-淀粉酶抑制作用為UM-EA>UM-HX>M-HX>MEA>UM-BT>UM-C>M-BT>M-C。除M-HX、MEA、UM-HX 及UM-EA 相近外，其它兩種熟小米提取物的酶抑制作用都低于生小米相應(yīng)的提取物，說(shuō)明小米中抑制α-淀粉酶活性的物質(zhì)具有熱敏性。但無(wú)論是生小米還是熟小米提取物的酶抑制作用都不及陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖 （IC50為0.545 mg/mL）。

圖4 生、熟小米提取物α-淀粉酶抑制率Fig.4 Inhibitory of α-amylase activities of raw and cooked millet extracts

3 討論

小米作為一種糧食作物，其主要成分為淀粉、蛋白、脂肪、膳食纖維，還包含一些微量物質(zhì)如多酚、胡蘿卜素等。小米中的類黃酮主要為黃酮類化合物，有異/東方紅素、異/牡荊素、木犀草素、芹菜素等[10]。有研究表明異/東方紅素及異/牡荊素等黃酮類化合物可有效抑制α-淀粉酶作用，調(diào)節(jié)餐后高血糖，調(diào)節(jié)由高糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，降低糖尿病并發(fā)癥及粥樣動(dòng)脈硬化[11-12]。70%乙醇提取物中富含豐富的蛋白、黃酮及維生素，賦予了其較高的生物活性[13]。與本研究結(jié)果一致，小米70%乙醇提取物對(duì)糖尿病大鼠的糖脂代謝具有一定的調(diào)節(jié)作用，并且生、熟小米的差距較大。其中生小米70%乙醇提取物的降糖效果顯著高于熟小米70%乙醇提取物。生小米70%乙醇提取物雖然不會(huì)降低大鼠血清中TG、TC 含量，但可顯著提高HDL 含量。為進(jìn)一步確定小米中的降糖活性成分，利用不同極性溶劑對(duì)粗提物進(jìn)行分級(jí)萃取，得到4 種溶劑萃取物。通過(guò)抗氧化活性及酶抑制作用進(jìn)一步比較，發(fā)現(xiàn)具有較高抗氧化活性的水提物，對(duì)α-淀粉酶反而有促進(jìn)作用。這可能是由于水提物中的某類物質(zhì)改變了催化α-淀粉酶所需的3 個(gè)酸性氨基酸殘基從而促進(jìn)了α-淀粉酶。有待進(jìn)一步確定水提物中的成分及與α-淀粉酶的作用，才能更好地解釋促進(jìn)作用機(jī)制?？寡趸钚院艿偷恼和樘崛∥镉休^好的酶抑制作用，說(shuō)明降糖效果的高低與抗氧化活性并無(wú)必然關(guān)系，小米中主要起降糖作用的物質(zhì)集中在極性較低的溶劑中。熟化后，正己烷萃取物的DPPH 及總抗氧化能力均降低，但是酶抑制作用沒(méi)有改變，說(shuō)明起降糖效果的物質(zhì)為非熱敏性組分。而正己烷萃取物中主要富集脂肪酸類物質(zhì)，小米中脂肪酸含量為2.54%～5.85%，大部分品種在4.00%左右，高于大米和小麥，并且脂肪酸結(jié)構(gòu)合理。脂肪酸組成中，油酸、亞麻酸、亞油酸含量在75.00%以上，其中亞油酸為主要脂肪酸。有研究表明亞油酸可降低血脂及改善血糖。而熟小米70%乙醇提取物的降糖效果低于生小米70%乙醇提取物，可能是由于其中水溶性成分負(fù)面作用的增強(qiáng)。有待對(duì)小米降糖組分篩選及降糖機(jī)制進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

生、熟小米提取物的抗氧化及降糖能力存在差異。其中生小米70%乙醇提取物可顯著改善糖尿病大鼠的糖代謝異常，而熟小米70%乙醇提取物沒(méi)有此效果。除乙酸乙酯提取物外，熟化降低了小米萃取物的總抗氧化活性；但提高了70%乙醇提取物及正丁醇萃取物的DPPH 清除能力?？寡趸^低的低極性溶劑正己烷及乙酸乙酯萃取物有較好的α-淀粉酶抑制作用，并且降糖物質(zhì)為非熱敏性。