衰老相關(guān)長(zhǎng)鏈非編碼RNA PINT通過(guò)表觀遺傳學(xué)修飾影響年齡相關(guān)性白內(nèi)障的發(fā)生發(fā)展

李 渤,朱曉宇,王 挺,宋少劼,杭春玖

(揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院 眼科,江蘇 揚(yáng)州,225000)

年齡相關(guān)性白內(nèi)障(ARC)為世界首位致盲性眼病，是一種衰老相關(guān)的慢性病，其發(fā)病率隨年齡增長(zhǎng)而增加[1-2]。目前，對(duì)ARC發(fā)生發(fā)展的具體分子機(jī)制仍然缺乏較全面的了解。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)是長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA,可在基因的轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后和翻譯后等水平調(diào)控其表達(dá)，在多種生理學(xué)和病理學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[3]。研究[4]發(fā)現(xiàn)大量LncRNA參與細(xì)胞衰老及相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控，影響關(guān)鍵細(xì)胞周期過(guò)程，如細(xì)胞增殖、分化、靜止、衰老等。這類衰老相關(guān)LncRNA通過(guò)表觀遺傳調(diào)控、細(xì)胞增殖、端粒穩(wěn)定性、蛋白質(zhì)內(nèi)穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞間通訊、干細(xì)胞池等調(diào)控衰老[5]。本研究探討衰老相關(guān)LncRNA PINT對(duì)ARC發(fā)生發(fā)展的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

病例組(ARC組)：在揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院眼科被診斷為ARC、接受白內(nèi)障小切口手法碎核白內(nèi)障手術(shù)患者。收集中度皮質(zhì)性ARC、重度皮質(zhì)性ARC、中度核性ARC、重度核性ARC各10眼。納入標(biāo)準(zhǔn): 患者年齡50～79歲; 最佳矯正視力低于0.5; 排除標(biāo)準(zhǔn): 先天性、糖尿病性、外傷性、并發(fā)性、藥物及中毒性白內(nèi)障等患者。所有參加研究的患者均無(wú)高血壓病、糖尿病、自身免疫性疾病及其他氧化損傷性相關(guān)疾病。

對(duì)照組: ① 在揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院眼科被診斷為玻璃體視網(wǎng)膜疾病(如特發(fā)性黃斑前膜、特發(fā)性黃斑裂孔等)，因年齡和手術(shù)等因素需要在玻璃體切除手術(shù)中同時(shí)行透明晶狀體摘除者，共10眼。② 揚(yáng)州市紅十字眼庫(kù)捐獻(xiàn)的新鮮眼球。納入標(biāo)準(zhǔn)[6]: 年齡50～79歲; 晶狀體透明。排除標(biāo)準(zhǔn): 高血壓病、糖尿病、自身免疫病及其他氧化損傷性相關(guān)疾病者。研究對(duì)象簽署知情同意書(shū)。③ 人晶狀體上皮細(xì)胞株SRA01/04(Thermo Fisher Scientific 公司)。上述研究方案嚴(yán)格遵循赫爾辛基宣言，且經(jīng)揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR

使用TRIzol試劑(Invitrogen,Carlsbad,CA,United States)從ARC和對(duì)照組細(xì)胞中提取總RNA,然后使用PrimeScript RT Master Mix(Takara,中國(guó)大連)、Power SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems,Irvine,CA,United States)在ABI 7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)上進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR分析。選用actin beta作為內(nèi)參，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和處理

人晶狀體上皮細(xì)胞株SRA01/04起源于人晶狀體上皮細(xì)胞，將其培養(yǎng)在DMEM中，含有10%胎牛血清(FBS),青霉素(100單位/mL)和鏈霉素(100 μg/mL)。所有細(xì)胞在37 ℃,95%空氣和5%二氧化碳的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。氧化損傷組：當(dāng)生長(zhǎng)至80%～90%時(shí)，將細(xì)胞暴露于過(guò)氧化氫(H2O2)(Sigma-Aldrich Corp.,St Louis,MO,USA)中，進(jìn)行氧化損傷。將細(xì)胞在含2%FBS的DMEM中孵育過(guò)夜，然后在無(wú)血清DMEM中孵育30 min。用H2O2(100和200μmol/L)處理24 h后，收集細(xì)胞進(jìn)行不同的測(cè)定。衰老組：當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%時(shí)，將細(xì)胞暴露于小劑量H2O2進(jìn)行衰老處理。將細(xì)胞在含2% FBS的DMEM中孵育過(guò)夜，然后在無(wú)血清DMEM中孵育30 min,并用50 μmol/L H2O2培養(yǎng)至7、14、21 d。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，收取所有細(xì)胞并用于不同的檢測(cè)。平行培養(yǎng)的對(duì)照細(xì)胞在類似的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，不進(jìn)行處理，作為所有實(shí)驗(yàn)的對(duì)照。

1.4 質(zhì)粒構(gòu)建、慢病毒包裝和轉(zhuǎn)染

使用pCDNA3.1載體(Genechem Technology Co.,Shanghai,China)。過(guò)表達(dá)LINC-PINT: 通過(guò)PCR生成LINC-PINT序列并克隆到pcDNA3.1載體中。慢病毒包裝：將pcDNA、pcDNA-LINC-PINT、si-NC、si-LINC-PINT分別轉(zhuǎn)染進(jìn)人晶狀體上皮細(xì)胞株SRA01/04中，轉(zhuǎn)染6 h后，更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h,檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染成功后，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 細(xì)胞增殖能力測(cè)定

利用CCK8檢測(cè)試劑盒(Dojindo Laboratories,Kumamoto,Japan)檢測(cè)各組細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖情況，分別向處理或未處理的細(xì)胞中加入10 μL CCK8試劑,37 ℃避光孵育3 h,酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的吸光度(OD值)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 抗氧化能力檢測(cè)

總抗氧化能力(T-AOC)檢測(cè)試劑盒(FRAP法)測(cè)定總抗氧化水平。在酸性環(huán)境下，還原鐵-三吡啶三吖嗪(Fe3+-TPTZ)產(chǎn)生亞鐵離子(Fe2+)形式的能力反映了總抗氧化能力。收集100～200萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，加入1.0 mL預(yù)冷的提取液，超聲充分破碎細(xì)胞并釋放其中的抗氧化物,4 ℃、10 000次/min,離心5 min,取上清液。樣品的抗氧化能力以達(dá)到同樣吸光度變化值所需的標(biāo)準(zhǔn)液離子濃度表示。

1.7 染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)技術(shù)

ChIP測(cè)定: 使用EZ-Magna ChIP A/G試劑盒(Millipore),應(yīng)用抗EZH2(Active Motif)和抗H3K27me3(Active Motif)。將SRA01/04細(xì)胞與1%甲醛交聯(lián)8 min,然后勻漿。使用Branson Digital Sonifier(Model 450; Branson Ultrasonics Corporation,CT,USA)的微尖探針將勻漿在2級(jí)超聲處理4次，每次15 s,每次脈沖之間在冰上間隔40 s,產(chǎn)生長(zhǎng)度為200～800堿基對(duì)(bp)的DNA片段。ChIP分析：將等量處理過(guò)的染色質(zhì)添加到含有針對(duì)目標(biāo)蛋白的固定化抗體或陰性對(duì)照正常兔IgG抗體的微孔中。在65 ℃溫育90 min以逆轉(zhuǎn)交聯(lián)并洗脫DNA后，使用快速旋轉(zhuǎn)柱進(jìn)行DNA純化，然后進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

采用IBM SPSS Statistics 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有結(jié)果數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。2組之間的差異采用非配對(duì)的Student′st檢驗(yàn)或方差分析進(jìn)行比較。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 LINC-PINT在ARC中的表達(dá)

使用高通量RNA序列分析、確定ARC組和對(duì)照組晶狀體上皮細(xì)胞之間的差異表達(dá)。ARC組LINC-PINT的表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。LINC-PINT的表達(dá)水平與ARC分級(jí)呈正相關(guān)。見(jiàn)圖1。

與對(duì)照組比較, ?P<0.05。圖1 ARC組與對(duì)照組中LINC-PINT的表達(dá)

2.2 衰老相關(guān)LncRNA與氧化損傷/衰老的關(guān)系

在晶狀體上皮細(xì)胞中，氧化損傷組和衰老組中LINC-PINT表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且分別呈現(xiàn)為劑量依賴性或時(shí)間依賴性的正相關(guān)，見(jiàn)圖2、圖3。

與0 μmol/L H2O2比較, ?P<0.05。圖2 不同H2O2處理氧化損傷組LINC-PINT水平

與對(duì)照組比較, ?P<0.05。圖3 衰老組與對(duì)照組中的LINC-PINT水平

2.3 建立過(guò)表達(dá)/敲低模型

將pcDNA、pcDNA-LINC-PINT、si-NC、si-LINC-PINT分別轉(zhuǎn)染進(jìn)人晶狀體上皮細(xì)胞SRA01/04中，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞中相關(guān)基因的表達(dá)量變化，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)入pcDNA-LINC-PINT后，靶基因CCNA2、CDK1、PCNA表達(dá)減少; 轉(zhuǎn)入si-LINC-PINT后，靶基因CCNA2、CDK1、PCNA表達(dá)增加，見(jiàn)圖4。同時(shí),LINC-PINT改變抗氧化損傷能力，見(jiàn)圖5。CCK8顯示在LINC-PINT過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中細(xì)胞增殖被抑制，見(jiàn)圖6。

2.4 衰老相關(guān)LncRNA與轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控機(jī)制

在模擬物和LINC-PINT過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中進(jìn)行ChIP,測(cè)定表觀遺傳修飾物與LINC-PINT靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域之間的相互作用。LINC-PINT與EZH2相互作用。LINC-PINT將EZH2招募到CDK1、CCNA2和PCNA基因的啟動(dòng)子上，導(dǎo)致H3K27三甲基化和靶基因的表觀遺傳學(xué)沉默。見(jiàn)圖7。

pcDNA-LINC-PINT與pcDNA比較, si-LINC-PINT與si-NC比較, ?P<0.05。圖4 LINC-PINT調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)

與對(duì)照組和si-NC比較, ?P<0.05。圖5 LINC-PINT改變抗氧化損傷能力

與對(duì)照組和pcDNA比較, ?P<0.05。圖6 過(guò)表達(dá)LINC-PINT組與對(duì)照組的細(xì)胞增殖情況

3 討 論

LncRNA PINT是由p53誘導(dǎo)的核LncRNA,直接與PRC2相互作用，且是PRC2特異靶基因中的組蛋白H3K27甲基化所必需的。研究[7]表明,LINC-PINT的功能依賴于PRC2的表達(dá)水平，并通過(guò)與PRC2相互作用調(diào)控轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和p53細(xì)胞通路中的蛋白質(zhì)表達(dá)水平，而這些通路與氧化損傷、衰老和衰老相關(guān)性疾病有關(guān)。p53及其下游p21蛋白是重要的細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，廣泛參與了細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等多種生理及病理過(guò)程。研究[4,8]表明,LncRNA是p53/p21信號(hào)通路的重要組成部分，而調(diào)控表觀遺傳學(xué)變異的LncRNA PINT在p53/p21信號(hào)通路中扮演著重要的角色。p53能通過(guò)誘導(dǎo)LncRNA PINT的表達(dá)，與PRC2相互作用，從而終止基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)控p53信號(hào)通路中蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程，從而影響機(jī)體的衰老以及衰老相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展。

與Mock比較, ?P<0.05。圖7 表觀遺傳修飾因子與LINC-PINT靶基因啟動(dòng)子區(qū)域之間的相互作用

ARC與表觀遺傳因素密不可分。研究[9-10]報(bào)道,LncRNA與許多眼病相關(guān)，如青光眼、后發(fā)性白內(nèi)障、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變、眼部腫瘤等。其中有報(bào)道[11]表明LncRNA PAUPAR通過(guò)調(diào)控組蛋白H3K4的去甲基化進(jìn)而抑制葡萄膜黑色素瘤的發(fā)生。作者的前期研究[12-13]提示，在人晶狀體上皮細(xì)胞株SRA01/04中，高濃度短時(shí)間的氧化損傷可誘導(dǎo)氧化損傷模型，而低濃度長(zhǎng)時(shí)間的氧化損傷可誘導(dǎo)衰老模型。ARC的衰老發(fā)病機(jī)制與氧化損傷機(jī)制緊密相扣，氧化損傷相關(guān)的表觀遺傳學(xué)改變與ARC密切相關(guān)[14]。因此，衰老相關(guān)LncRNA可能通過(guò)參與表觀遺傳學(xué)調(diào)控影響細(xì)胞衰老，進(jìn)而引起ARC。

本研究初步闡明了LncRNA PINT可能通過(guò)p53/p21通路調(diào)控相關(guān)基因的表觀遺傳改變，參與ARC的發(fā)生發(fā)展，揭示了衰老相關(guān)LncRNA在ARC發(fā)病機(jī)制中起到重要作用，可作為ARC防治的新靶點(diǎn)。本研究從表觀遺傳學(xué)水平探討ARC發(fā)病機(jī)制，為ARC防治提供新思路，有助于研發(fā)抗ARC藥物，為進(jìn)一步深入了解白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)理提供了理論基礎(chǔ)和方向。