慢性鼻病中乏氧誘導(dǎo)因子-1與5-脂加氧酶的表達及意義

王 嘉，高亞娜，田東倩，楊澤垠，魏英粉，邸 斌

鼻息肉、變應(yīng)性鼻炎和慢性鼻炎是常見的鼻腔黏膜炎癥性疾病，由于病史冗長，統(tǒng)稱為慢性鼻病。其中變應(yīng)性鼻炎是由IgE介導(dǎo)的非感染性炎癥，雖然不同國家發(fā)病率統(tǒng)計結(jié)果不一，但近年來該病的發(fā)病率一直呈現(xiàn)上升趨勢[1]。目前該病以藥物治療為主，但部分患者療效欠佳。而近十余年歐美主要的鼻科協(xié)會連續(xù)發(fā)表鼻炎、鼻息肉診療指南[2-3]，表明人們對于手術(shù)治療鼻息肉及鼻炎的熱情逐漸消退，診療思維回歸理性，逐步意識到個體化差異及個體化治療的重要性。故慢性鼻病發(fā)病機制復(fù)雜，單純依靠手術(shù)無法解決問題，治療方案仍需進一步完善，這就提示在研究中仍需從基本的發(fā)病機制入手，探尋新的細胞或炎性因子通路。乏氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)是細胞在乏氧狀態(tài)下高表達的一種蛋白，由α、β兩個亞基組成二聚體結(jié)構(gòu)，其中α亞基決定HIF-1的活性[4-5]。由于HIF-1最初是在乏氧狀態(tài)下處理肝癌細胞時發(fā)現(xiàn)的，故此后對其研究大多集中在腫瘤方面[6-7]。近來研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1在炎性疾病中同樣扮演重要角色[8]。5-脂加氧酶(5-LOX)是白三烯(LT)合成的限速酶，由于LT是公認的強效炎性因子，所以5-LOX在炎癥中的作用亦受到廣泛的重視。在以往的研究中，尚無HIF-1、5-LOX與慢性鼻病的相關(guān)報道。本文目的是通過檢測慢性鼻病病理組織和正常鼻黏膜組織中HIF-1、5-LOX表達情況，分析二者與慢性鼻病之間的關(guān)系，期望能探尋新的治療靶點。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年1月—2020年6月在中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九八〇醫(yī)院因鼻息肉行鼻息肉切除手術(shù)、因變應(yīng)性鼻炎行翼管神經(jīng)切斷術(shù)，以及因慢性鼻炎行鼻甲部分切除術(shù)的各25例作為試驗組，試驗組再根據(jù)疾病不同分為鼻息肉組、變應(yīng)性鼻炎組和慢性鼻炎組，其中鼻息肉組男14例，女11例；年齡25～75歲，中位數(shù)49歲；病程1～31(18.0±6.5)年；變應(yīng)性鼻炎組男15例，女10例；年齡20～45歲，中位數(shù)31歲；病程1～14(8.0±5.7)年；慢性鼻炎組男13例，女12例；年齡30～55歲，中位數(shù)48歲；病程1～23(13.0±4.3)年。術(shù)前1個月內(nèi)未使用鼻噴糖皮質(zhì)激素、抗生素等藥物治療，排除各類型哮喘、纖毛不動綜合征等疾病。選取同期30例因鼻源性頭疼及鼻中隔骨折行單純鼻中隔矯正的多余正常鼻黏膜組織作為對照組，其中男20例，女10例；年齡為19～42歲，中位數(shù)29歲；病程1～8(4.0±2.9)年。

1.2檢測方法 收集各組鼻黏膜組織，標本置于4%甲醛中固定后，脫水、浸蠟、包埋制成蠟塊備用。制備成組織切片，HE染色后用顯微鏡觀察鼻息肉的炎性細胞浸潤及形態(tài)學變化。免疫組織化學檢測HIF-1及5-LOX的表達，操作嚴格按照試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)說明書進行。

1.3結(jié)果判定 顯微鏡觀察HIF-1、5-LOX陽性染色細胞的分布和蛋白的表達情況。每個標本隨機選取3張切片，每張切片在400倍光鏡下隨機選擇5個視野對陽性細胞計數(shù)(胞內(nèi)有棕黃色顆粒的為陽性細胞)，取平均值為該標本的陽性細胞數(shù)。同時選取試驗組中3張切片用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗(兔抗人HIF-1、5-LOX抗體)做陰性對照以排除非特異染色的干擾。

2 結(jié)果

2.1鼻黏膜HE染色 試驗組中鼻息肉組織均由極度水腫的疏松結(jié)締組織構(gòu)成，表面覆蓋呼吸上皮，腺體組織增生明顯，間質(zhì)中有大量炎性細胞浸潤。見圖1a。變應(yīng)性鼻炎鼻黏膜水腫，纖毛結(jié)構(gòu)大量脫落，纖毛柱狀上皮增生，小血管增生，黏膜上皮下固有層大量嗜酸粒細胞、淋巴細胞浸潤。見圖1b。慢性鼻炎鼻黏膜上皮變薄或脫落，有些病理可見鱗狀上皮化生，組織間質(zhì)內(nèi)可見纖維組織增生，腺體增生，炎性細胞浸潤。見圖1c。對照組正常鼻黏膜無上述炎癥表現(xiàn)，鼻黏膜纖毛整齊，上皮完整，無明顯的炎性細胞浸潤。見圖1d。

圖1 試驗組和對照組不同鼻黏膜組織的結(jié)構(gòu)形態(tài)變化(HE ×400)

2.2免疫組織化學法 試驗組中HIF-1、5-LOX蛋白的陽性表達均為棕黃色顆粒，HIF-1、5-LOX大量表達于病理組織中上皮細胞、血管內(nèi)皮細胞的細胞質(zhì)及細胞核。對照組偶見陽性染色的棕黃色顆粒。見圖2和3。

圖2 試驗組和對照組不同鼻黏膜組織中乏氧誘導(dǎo)因子-1表達情況(SP ×400)

圖3 試驗組和對照組不同鼻黏膜組織中5-脂加氧酶表達情況(SP ×400)

2.3HIF-1、5-LOX表達情況 試驗組中鼻黏膜組織HIF-1、5-LOX陽性表達明顯高于對照組(P<0.05)。見表1。鼻息肉組、變應(yīng)性鼻炎組和慢性鼻炎組HIF-1、5-LOX陽性表達均明顯高于對照組(鼻息肉組：t=20.18、P=0.02，t=23.77、P=0.02；變應(yīng)性鼻炎組：t=17.03、P=0.03，t=18.21、P=0.04；慢性鼻炎組：t=15.99、P=0.04，t=15.62、P=0.04)；且鼻息肉組、變應(yīng)性鼻炎組及慢性鼻炎組HIF-1、5-LOX陽性表達逐漸降低，變應(yīng)性鼻炎組及慢性鼻炎組HIF-1、5-LOX陽性表達明顯低于鼻息肉組(變應(yīng)性鼻炎組：t=16.21、P=0.04，t=15.34、P=0.04；慢性鼻炎組：t=15.45、P=0.04，t=14.52、P=0.03)，且慢性鼻炎組明顯低于變應(yīng)性鼻炎組(t=14.78、P=0.04，t=13.78、P=0.04)。見表2。

2.4HIF-1與5-LOX陽性表達的相關(guān)性 各試驗組鼻黏膜組織中HIF-1與5-LOX陽性表達正相關(guān)(鼻息肉組：r=0.70，P=0.02；變應(yīng)性鼻炎組：r=0.78，P=0.02；慢性鼻炎組：r=0.70，P=0.03)。對照組HIF-1與5-LOX陽性表達無相關(guān)性(r=0.10，P=0.37)。見圖4。

表1 試驗組與對照組鼻黏膜組織HIF-1、5-LOX陽性表達比較個)

表2 4組鼻黏膜組織HIF-1、5-LOX陽性表達比較個)

圖4 試驗組和對照組HIF-1與5-LOX陽性表達的相關(guān)性

3 討論

鼻息肉發(fā)病機制復(fù)雜，這也表明了目前該疾病治療的困境和難點[9]。鼻息肉最顯著的病理特點就是間質(zhì)極度水腫，這在本研究結(jié)果中已有體現(xiàn)。組織間質(zhì)的水腫提示局部組織處于乏氧狀態(tài)，HIF-1是細胞在乏氧狀態(tài)時高表達的一種蛋白。HIF-1可調(diào)節(jié)下游因子的表達，如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)等，這些因子可增加血管通透性，使炎性細胞滲出，導(dǎo)致局部組織水腫，進而加重局部的乏氧程度，而這一變化可能導(dǎo)致鼻息肉形成[10]。研究表明，鼻息肉組織中HIF-1處于高表達狀態(tài)[11]，這與本研究結(jié)果一致。在臨床中發(fā)現(xiàn)鼻息肉多見于中鼻甲及中鼻道，這可能與中鼻甲血供不如下鼻甲豐富，且中鼻道結(jié)構(gòu)復(fù)雜，空間狹窄，稍有黏膜腫脹即可加重乏氧程度有關(guān)[12-13]。近些年，5-LOX在炎癥中的作用逐漸引起人們的重視，除了其本身可以促進炎癥外，更多是通過生成LT參與到炎癥反應(yīng)中[14-15]。還有研究表明，鼻息肉中LT及其受體含量較正常鼻黏膜明顯升高。反過來，有證據(jù)表明LT受體拮抗劑或5-LOX抑制劑在治療鼻息肉方面亦取得良好效果[16]。

本研究顯示變應(yīng)性鼻炎鼻黏膜有大量免疫細胞浸潤，而細胞代謝需要消耗氧氣，這提示在變應(yīng)性鼻炎發(fā)病過程中鼻黏膜處于乏氧狀態(tài)。HIF-1可以提高細胞乏氧時的耐受力，而且該蛋白在變應(yīng)性疾病中的作用已引起研究人員的重視[17-18]。有研究證實，變應(yīng)性鼻炎鼻腔灌洗液中HIF-1含量明顯增多[19]，與本試驗結(jié)果一致。此外，HIF-1在變應(yīng)性鼻炎中還可能發(fā)揮以下作用：①促進新生血管形成：變應(yīng)性鼻炎發(fā)病時鼻黏膜為高度水腫，組織內(nèi)氧含量下降，HIF-1可促進VEGF生成，而VEGF可促使新的血管生成，改善組織乏氧狀態(tài)，需要注意的是，新生的血管管壁尚不完善，通透性高，滲出多反而可能加重組織水腫及乏氧狀態(tài)。②調(diào)控相關(guān)免疫細胞代謝狀態(tài)，增加細胞對乏氧狀態(tài)的耐受：乏氧狀態(tài)下，相關(guān)免疫細胞有氧代謝受到抑制，無氧代謝得到加強，通過葡萄糖無氧酵解獲取能量。③促進免疫細胞游走及釋放相關(guān)細胞因子：HIF-1可調(diào)控的下游靶基因眾多，其中轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)是其重要一項。TGF-β1可通過上調(diào)5-LOX參與變應(yīng)性鼻炎的發(fā)病過程，而且TGF-β1也參與了鼻黏膜組織重塑，對疾病的發(fā)展有促進作用。同樣，5-LOX通過合成LT，在變應(yīng)性鼻炎的發(fā)病中起到重要作用[20]，此外LT還在過敏反應(yīng)遲發(fā)相中起到了重要作用。

慢性鼻炎的病因目前尚不明確，常見的局部因素有細菌、病毒等感染，全身因素包括內(nèi)分泌障礙、咽喉反流等。這導(dǎo)致該病療效欠佳。相關(guān)文獻表明，慢性鼻炎的超微結(jié)構(gòu)特點是炎性細胞浸潤、纖維組織增生及血管擴張或增生[21]。增多的炎性細胞消耗局部組織大量氧氣后導(dǎo)致鼻黏膜處于乏氧狀態(tài)，激活細胞內(nèi)HIF-1，產(chǎn)生一系列生物學效應(yīng)[22-26]，比如：①促進細胞代謝由氧化磷酸化轉(zhuǎn)為無氧糖酵解，雖然保證細胞代謝所需基本能量，但也使得鼻腔內(nèi)酸堿度發(fā)生變化，導(dǎo)致黏膜進一步病理改變；②誘導(dǎo)炎性細胞局部聚集，并增強炎性細胞對病原微生物的抵抗作用；③促進局部組織纖維化的發(fā)生發(fā)展。同時，有研究表明高壓氧治療后牙周組織炎癥減輕，炎性細胞明顯減少[27]。乏氧狀態(tài)下，細胞外Ca2+流向細胞內(nèi)，使細胞內(nèi)Ca2+濃度提高，進而激活5-LOX[28]。除了產(chǎn)生LT這種強效炎性因子外，5-LOX還可能通過其他途徑參與炎癥反應(yīng)[29-31]，比如：①5-LOX抑制劑能有效降低人滑膜成纖維細胞中白細胞介素-6等炎性因子的含量；②5-LOX可以誘導(dǎo)靶細胞合成白細胞介素，加重炎癥反應(yīng)；③動物腸炎模型表明腸黏膜中5-LOX表達增高，而5-LOX抑制劑可減輕炎癥反應(yīng)，敲除5-LOX基因的動物腸炎模型，腸道反應(yīng)明顯減輕。

綜上所述，HIF-1、5-LOX均與鼻息肉、變應(yīng)性鼻炎及慢性鼻炎關(guān)系密切。而本研究中各試驗組病理組織中HIF-1與5-LOX均為高表達，且二者存在正相關(guān)性，這與大部分文獻報道結(jié)果相吻合。鼻息肉組、變應(yīng)性鼻炎組和慢性鼻炎組中HIF-1與5-LOX表達依次降低，且有統(tǒng)計學意義，可能是因為鼻息肉多為不可逆的水腫組織，因此該組HIF-1與5-LOX表達最高；變應(yīng)性鼻炎為反復(fù)發(fā)作的過敏性炎癥，發(fā)作間期組織可恢復(fù)正常；而慢性鼻炎鼻黏膜多呈現(xiàn)充血狀態(tài)，乏氧狀態(tài)有所改善，因此HIF-1與5-LOX表達最低。本質(zhì)上HIF-1與5-LOX還是通過影響炎性細胞來參與疾病的發(fā)生發(fā)展過程，這其中可能還存在著更為復(fù)雜的信號通路，因此HIF-1與5-LOX可看成是一個上游靶點，也許可以作為慢性鼻病的一個新的研究方向和治療思路。