特發(fā)性膜性腎病患者血清抗PLA2R抗體和抗THSD7A抗體的表達(dá)及診斷價(jià)值

姜傳學(xué)，李龍海，王 建，宋東旭，董 葆

膜性腎病即膜性腎小球腎炎，是指免疫復(fù)合物在腎小球毛細(xì)血管中過度沉積導(dǎo)致的腎病綜合征，臨床表現(xiàn)為高脂血癥、水腫、低蛋白血癥、蛋白尿等[1]。膜性腎病可分為特發(fā)性膜性腎病(idiopathic membranous nephropathy, IMN)與繼發(fā)性膜性腎病(secondary membranous nephropathy, SMN)，其中IMN是自身抗體介導(dǎo)，補(bǔ)體、腎小球足細(xì)胞膜成分等參與的自身免疫性疾病，具有器官特異性[2]。自從Heyman腎炎模型確認(rèn)以來，膜性腎病的重要靶抗原逐漸受到臨床的廣泛關(guān)注，目前認(rèn)為M型磷脂酶A2受體(phospholipase A2 receptor, PLA2R)及1型血小板反應(yīng)蛋白7A域(thrombospondin type-1 domain-containing 7A, THSD7A)是導(dǎo)致膜性腎病發(fā)生的兩大致病靶抗原[3]。本研究分析IMN患者血清抗PLA2R抗體及抗THSD7A抗體表達(dá)水平，旨在評(píng)價(jià)兩種抗體的表達(dá)在IMN診斷及病情評(píng)估中的臨床價(jià)值，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性分析2017年7月—2019年12月阜陽市第二人民醫(yī)院腎內(nèi)科住院行腎穿刺活檢的初次治療腎病患者217例，其中IMN 97例，非膜性腎病120例。IMN組男54例，女43例；年齡36～79(51.73±12.46)歲；病程8～58(32.10±0.25)個(gè)月。非膜性腎病組男69例，女51例；年齡35～79(51.99±12.35)歲；病程9～60(32.22±0.31)個(gè)月；包括IgA腎病45例，局灶節(jié)段性腎小球硬化癥18例，微小病變腎病17例，系膜增生性腎小球腎炎18例，足細(xì)胞病12例，過敏性紫癜性腎炎4例，糖尿病腎病6例。兩組的性別、年齡、病程比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2納入與排除標(biāo)準(zhǔn) ①納入標(biāo)準(zhǔn)：均為行腎穿刺活檢初次治療患者；活檢前未使用過糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑；臨床資料完整。②排除標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)臨床癥狀、體征、實(shí)驗(yàn)室檢查、腎活檢病理診斷為SMN患者，如繼發(fā)于自身免疫性疾病或慢性感染的腎??；合并惡性腫瘤；具有明確的毒性物質(zhì)與藥物接觸史，包括硫普羅寧、鉛中毒、汞中毒、鎘中毒等。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本收集：所有患者檢測當(dāng)日取空腹靜脈血4 ml，置于無菌抗凝試管中，3500 r/min轉(zhuǎn)速條件下離心15 min，取上清液，置于冰箱中貯存待測；同時(shí)開始留取24 h尿行尿蛋白定量檢測。血清白蛋白水平測定采用溴甲酚綠比色法，尿蛋白定量檢測采用比濁法，尿β2-微球蛋白、尿免疫球蛋白G、尿α1-微球蛋白檢測采用酶聯(lián)免疫吸附法。

1.3.2血清抗PLA2R抗體測定：采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測，試劑盒購自德國歐蒙，試劑盒抗PLA2R抗體檢測范圍：2～1500 RU/ml，≤20 RU/ml代表陰性表達(dá)。具體步驟：樣本緩沖液按照1∶100的比例稀釋，向反應(yīng)微孔分別加入標(biāo)準(zhǔn)品、陰性對(duì)照、陽性對(duì)照、稀釋后的樣本各100 μl，18～25℃條件下溫育30 min，用稀釋后的清洗液清洗反應(yīng)微孔3次，注意清洗時(shí)微孔中緩沖液保留時(shí)間至少為60 s，倒置微孔板，吸水紙上拍打去除殘存的清洗液。微孔中加入100 μl酶結(jié)合物，18～25℃條件下溫育30 min，再次清洗。微孔中加入100 μl色原/底物液、18～25℃溫度條件下避光溫育15 min。依照上述步驟中相同的順序和速度滴加100 μl終止液至微孔中。設(shè)定好酶標(biāo)儀參數(shù)，450 nm/630 nm比色。

1.3.3血清抗THSD7A抗體測定：采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測，試劑盒來自美國BioLegend，試劑盒抗THSD7A抗體濃度范圍3～200 pg/ml，<3 pg/ml代表陰性表達(dá)。具體步驟：將稀釋的50 μl標(biāo)準(zhǔn)品、陰性對(duì)照、陽性對(duì)照、血清樣本分別加入反應(yīng)微孔；以覆膜覆蓋，在37℃溫度條件下溫育30 min。以稀釋后清洗緩沖液清洗反應(yīng)微孔5次，注意清洗時(shí)微孔中緩沖液保留時(shí)間至少為60 s，倒置微孔板，吸水紙上拍打去除殘存的清洗液。除對(duì)照孔外，向每個(gè)反應(yīng)微孔中加入50 μl酶結(jié)合物，以覆膜覆蓋，在37℃溫度條件下溫育30 min，再次清洗。向每個(gè)反應(yīng)微孔加入50 μl酶結(jié)合物A和酶結(jié)合物B，震動(dòng)30 s，37℃條件下溫育30 min。向每個(gè)反應(yīng)微孔中加入50 μl終止液。在37℃溫度條件下溫育30 min，設(shè)定好酶標(biāo)儀參數(shù)，450 nm/630 nm比色。

1.4IMN診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]光鏡下顯示腎小球基底膜出現(xiàn)帶狀空泡變性，馬松三色法染色可見上皮下出現(xiàn)嗜復(fù)紅蛋白的沉積，且隨著患者疾病的進(jìn)展，腎小球基底膜彌漫呈現(xiàn)進(jìn)一步增厚，并伴有系膜細(xì)胞以及基質(zhì)中度彌漫增生，毛細(xì)血管腔狹窄。最后腎小球基底膜鏈環(huán)狀，系膜基質(zhì)增加，被擠壓的毛細(xì)血管袢閉塞，腎小球結(jié)節(jié)硬化，呈現(xiàn)球性或節(jié)段性硬化。

1.5臨床分期 依照Ehrenreieh和Churg標(biāo)準(zhǔn)[5]：①Ⅰ期：腎小球足突融合，腎小球基底膜呈現(xiàn)輕度增厚，上皮細(xì)胞下出現(xiàn)沉積的小塊電子致密物。②Ⅱ期：基底膜明顯彌漫增厚，上皮細(xì)胞下出現(xiàn)沉積的大塊電子致密物，且有反應(yīng)性增生形成的釘突相連。③Ⅲ期：增生的腎小球基底膜環(huán)繞包裹電子致密物，且其中一部分被吸收，表現(xiàn)為大小、形狀、密度不同的致密物和電鏡透亮區(qū)。④Ⅳ期：腎小球基底膜明顯增厚，由于電子致密物被吸收，變得與腎小球基底膜的密度接近，而觀察不到。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料以率(%)表示，比較行χ2檢驗(yàn)；通過受試者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲線分析血清抗PLA2R抗體及抗THSD7A抗體表達(dá)對(duì)IMN的診斷效能；采用多因素Logistic回歸分析血清抗PLA2R抗體及抗THSD7A抗體陽性表達(dá)的影響因素。α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1血清抗PLA2R抗體及抗THSD7A抗體表達(dá)比較 IMN組抗PLA2R抗體陽性表達(dá)59例(60.82%)，非膜性腎病組10例(8.33%)；IMN組陽性表達(dá)率高于非膜性腎病組(P<0.01)。IMN組抗THSD7A抗體陽性表達(dá)11例(11.34%)，非膜性腎病組無陽性表達(dá)；IMN組陽性表達(dá)率高于非膜性腎病組(P<0.01)。見表1。

表1 兩組腎病患者血清抗PLA2R抗體及抗THSD7A抗體表達(dá)比較[例(%)]

2.2血清抗PLA2R抗體及抗THSD7A抗體表達(dá)對(duì)IMN診斷效能分析 血清抗PLA2R抗體診斷IMN的準(zhǔn)確度、靈敏度、特異度分別為77.88%、60.82%、91.67%；血清抗THSD7A抗體診斷IMN的準(zhǔn)確度、靈敏度、特異度分別為60.37%、11.34%、100.00%。血清抗THSD7A抗體診斷特異度高于抗PLA2R抗體(χ2=10.435，P=0.001)，準(zhǔn)確度、靈敏度低于抗PLA2R抗體(χ2=15.589、51.495，P均<0.001)。見圖1。

圖1 血清抗PLA2R抗體及抗THSD7A抗體表達(dá)對(duì)IMN診斷效能分析

2.3不同抗體表達(dá)IMN患者相關(guān)病理和生化指標(biāo)比較 不同腎小管間質(zhì)損傷、血清白蛋白、尿免疫球蛋白G、尿β2-微球蛋白、尿α1-微球蛋白水平患者抗PLA2R抗體、抗THSD7A抗體陽性表達(dá)結(jié)果與陰性表達(dá)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。見表2。

2.4影響IMN患者血清抗PLA2R抗體、抗THSD7A抗體表達(dá)的多因素分析 將上述單因素分析中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)納入多因素Logistic回歸模型，分別以抗PLA2R抗體、抗THSD7A抗體表達(dá)結(jié)果作為因變量，以上述差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)作為自變量，并賦值：腎小管間質(zhì)損傷(<25%=0，≥25%=1)、血清白蛋白(<25 g/L=0，≥25 g/L=1)、尿免疫球蛋白G(<24.98 mg/L=0，≥24.98 mg/L=1)、尿β2-微球蛋白(<1.17 mg/L=0，≥1.17 mg/L=1)、尿α1-微球蛋白(<40.35 mg/L=0，≥40.35 mg/L=1)。結(jié)果顯示，腎小管間質(zhì)損傷≥25%、血清白蛋白<25 g/L、尿免疫球蛋白G≥24.98 mg/L、尿β2-微球蛋白≥1.17 mg/L、尿α1-微球蛋白≥40.35 mg/L是IMN患者血清抗PLA2R抗體、抗THSD7A抗體表達(dá)的影響因素(P<0.05，P<0.01)。見表3和表4。

3 討論

IMN是一種原因不明的自身免疫性疾病，既往研究認(rèn)為，腎小球足細(xì)胞出現(xiàn)致病性抗原，原位免疫復(fù)合物的形成，進(jìn)一步激活補(bǔ)體系統(tǒng)，使得基底膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，濾過屏障受損[6-7]。

表2 不同抗體表達(dá)IMN患者相關(guān)病理和生化指標(biāo)比較(例)

表3 影響IMN患者血清抗PLA2R抗體表達(dá)的多因素Logistic回歸分析

表4 影響IMN患者血清抗THSD7A抗體表達(dá)的多因素Logistic回歸分析

隨著對(duì)IMN靶抗原研究的進(jìn)展，PLA2R、THSD7A等靶抗原逐漸被人們認(rèn)識(shí)。PLA2R可分為N型和M型，人體M型PLA2R主要在腎組織中表達(dá)，屬于C型外源性凝集素家族，屬于Ⅰ型跨膜蛋白，病理狀態(tài)下參與炎癥與急性腎損傷過程[8]。Li等[9]研究100例IMN患者抗PLA2R抗體陽性表達(dá)情況，結(jié)果顯示有52例檢測出抗PLA2R抗體，陽性表達(dá)率為52%，而在SMN、腫瘤相關(guān)性腎病等其他類型中未檢出。THSD7A為IMN免疫復(fù)合物沉積導(dǎo)致的分子損傷病理機(jī)制提供了新的分子生物學(xué)基礎(chǔ)[10]。THSD7A在嚙齒類動(dòng)物足細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)，特異性定位于足細(xì)胞胞體、足突、隔膜裂孔等，集中表達(dá)于人腎足細(xì)胞膜表面的跨膜蛋白，由胞外部分、跨膜域、胞內(nèi)尾部組成[11]。IMN是與足細(xì)胞相關(guān)的自身免疫性疾病，在一定條件下其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而暴露抗原表位，誘導(dǎo)自身抗體形成，補(bǔ)體系統(tǒng)的激活誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷和凋亡，形成蛋白尿，抗THSD7A抗體水平與IMN疾病活動(dòng)存在關(guān)系[12]。

本研究中IMN患者抗PLA2R抗體陽性率60.82%，低于Tian等[13]研究結(jié)果，這可能是由于本研究抗體測定采用酶聯(lián)免疫吸附法，而上述報(bào)道采用免疫熒光檢測，檢測結(jié)果存在一定的差異。本研究中IMN患者血清抗THSD7A抗體陽性率為11.34%，非膜性腎病患者該抗體無陽性表達(dá)，表明抗THSD7A抗體診斷IMN特異性為100%，高于抗PLA2R抗體，但是抗THSD7A抗體陽性不能排除繼發(fā)性因素，其檢測準(zhǔn)確度與敏感度均低于抗PLA2R抗體。本研究中IMN患者血清抗THSD7A抗體檢出率并不高，與李正東和張任[14]研究結(jié)果一致。分析可能原因?yàn)椋孩俅嬖谄渌锌乖?；②病情平穩(wěn)或處于緩解期，免疫反應(yīng)不活動(dòng)；③實(shí)驗(yàn)人數(shù)或技術(shù)限制；④存在潛在繼發(fā)性因素等。

本研究中腎小管間質(zhì)損傷≥25%是影響抗PLA2R抗體、抗THSD7A抗體表達(dá)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，抗PLA2R抗體、抗THSD7A抗體從炎癥介導(dǎo)與免疫調(diào)節(jié)兩方面參與了腎間質(zhì)纖維化的形成。IMN患者由于促紅細(xì)胞生成素生成障礙，血紅蛋白降低，損傷腎小球?yàn)V過屏障，造成大量蛋白尿、低白蛋白血癥，血清白蛋白含量降低，這些生理病理改變也通過氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、血流動(dòng)力學(xué)改變、細(xì)胞外基質(zhì)沉積等，進(jìn)一步加重腎病病理損傷，血清蛋白和尿蛋白反映膜性腎病患者病情。Zhang等[15]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)鞍啄蛩礁邥r(shí)，抗PLA2R抗體、抗THSD7A抗體滴度較高，治療后，隨著尿蛋白含量降低和血清白蛋白濃度的恢復(fù)，抗PLA2R抗體、抗THSD7A抗體滴度下降甚至消失，Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示抗PLA2R抗體、抗THSD7A抗體滴度與血清白蛋白呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，與尿蛋白水平呈現(xiàn)正相關(guān)。本研究分析影響IMN患者血清抗PLA2R抗體、抗THSD7A抗體表達(dá)的因素，結(jié)果顯示血清白蛋白、尿免疫球蛋白G、尿β2-微球蛋白、尿α1-微球蛋白均是抗PLA2R抗體、抗THSD7A抗體陽性表達(dá)的影響因素，IMN患者蛋白尿的產(chǎn)生主要與腎小球足細(xì)胞和基底膜結(jié)構(gòu)及功能完整性遭到破壞有關(guān)。對(duì)于血清抗PLA2R抗體、抗THSD7A抗體陽性表達(dá)的IMN患者來說，二者的合成分泌，引起機(jī)體免疫學(xué)異常反應(yīng)，導(dǎo)致腎臟病理損傷，引起蛋白尿的形成。根據(jù)電鏡中上皮下免疫復(fù)合物沉積，將膜性腎病病理分為4個(gè)階段，在本研究中，不同病理階段IMN患者的抗PLA2R抗體、抗THSD7A抗體表達(dá)無明顯差異，故抗PLA2R抗體、抗THSD7A抗體表達(dá)與上皮下免疫沉積物的出現(xiàn)之間可能沒有關(guān)聯(lián)。此研究結(jié)果與既往Pozdzik等[16]的研究報(bào)道一致。

綜上所述，血清抗PLA2R抗體、抗THSD7A抗體對(duì)于IMN的診斷具有一定的臨床價(jià)值，血清白蛋白含量較低，尿蛋白含量較高的患者血清上述抗體陽性表達(dá)水平越高。血清抗PLA2R抗體、抗THSD7A抗體表達(dá)在反映患者病情方面具有一定的臨床意義，可作為IMN患者檢測的重要血清學(xué)指標(biāo)。