出芽短梗霉菌PA-2侵染對藜葉片代謝的影響

高漢峰，楊 瑩，陳紅雨，程 亮，郭青云

（青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院/青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西寧作物有害生物科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站，西寧 810016）

雜草是影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要生物因子之一。藜Chenopodiumalbum在全世界分布有250個(gè)種和亞種[1]，危害世界不同地區(qū)25種農(nóng)作物[2]。藜干擾目的作物生長，惡化環(huán)境，污染農(nóng)產(chǎn)品，傳播病蟲害，阻礙機(jī)械播種和收獲，是影響作物產(chǎn)量和品質(zhì)的主要生物逆境之一[3]。化學(xué)除草劑是目前防治藜最有效、最經(jīng)濟(jì)的方法之一，但隨著使用量和使用年數(shù)的增加，化學(xué)除草劑面臨諸如抗藥性、環(huán)境污染等問題[4]，而生物防治由于對人畜和非目標(biāo)生物安全，環(huán)境兼容性良好，產(chǎn)生抗性幾率低，易于保護(hù)生物多樣性，來源廣等優(yōu)點(diǎn)，從而為病蟲草害防控提供了一條新的途徑。出芽短梗霉菌PA-2是課題組從感病楊樹葉片上分離到的一株真菌，前期對該菌株的致病性、寄主專一性和培養(yǎng)條件進(jìn)行了測試，發(fā)現(xiàn)該菌對藜的防除效果較好，達(dá)到 78.46%，顯示出該菌有潛力發(fā)展成為防治藜的生物除草劑[5]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，植物病原真菌Ascochyta caulina對藜具有很好的除草效果[6,7]，從該真菌中提取的天冬毒素和反式-4-氨基-D-脯氨酸在溫室條件下均顯示出對藜的高效除草活性，造成藜葉片和莖桿嚴(yán)重壞死，從而導(dǎo)致藜死亡。Evidente等[8]研究發(fā)現(xiàn)Phomachenopodiicola產(chǎn)生的藜蘆皂苷、呋喃和異香豆素均對藜葉片有明顯的致萎作用。出芽短梗霉菌是一類和酵母菌相關(guān)的真菌，應(yīng)用于多個(gè)研究領(lǐng)域，其中包括生物防治[7,8]。對于其生物防治方面大多集中在對病原菌的抑菌效果方面，其抑菌機(jī)制大多是與病原菌爭奪空間和養(yǎng)分的結(jié)果[9-11]。關(guān)于出芽短梗霉菌在侵染藜方面的報(bào)道主要集中在植物受侵染后植株形態(tài)變化及體內(nèi)防御酶變化[12,13]。但這些研究尚未涉及藜在受到PA-2侵染時(shí)機(jī)體內(nèi)哪些代謝通路被改變，而代謝組學(xué)的研究介于基因、蛋白和細(xì)胞、組織之間，植物代謝產(chǎn)物的分析更能反應(yīng)植物的生理狀態(tài)，有助于探究在侵染時(shí)代謝通路的變化情況。但是，關(guān)于藜受病原菌侵染代謝組學(xué)的研究卻鮮見報(bào)道。本研究選擇闊葉雜草藜為研究對象，利用色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS）進(jìn)行代謝組學(xué)分析，以期揭示PA-2侵染藜的代謝機(jī)制，為PA-2生物除草制劑商品化奠定理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)在青海省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所培養(yǎng)室中進(jìn)行。發(fā)酵液的制備參照文獻(xiàn)[14]進(jìn)行，即首先將本實(shí)驗(yàn)室保存的出芽短梗霉菌PA-2接種于PDA培養(yǎng)基中，于28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d，然后用打孔器（Φ=8 mm）在菌落邊緣取菌餅接種于裝有50 mL種子液（葡萄糖20.0 g/L、蛋白胨20.0 g/L、酵母浸粉10.0 g/L）的250 mL的錐形瓶內(nèi)，每個(gè)錐形瓶接種1個(gè)菌餅，然后于25 ℃、180 r/min的搖床上培養(yǎng)3 d后制成發(fā)酵液。

在溫室中，放置10個(gè)內(nèi)徑20 cm的盆缽。每盆移入3～4葉期的藜幼苗5株，待移入的幼苗長至8片葉時(shí)，將PA-2發(fā)酵液稀釋至孢子濃度為 106～108孢子/mL，接種量為每盆20 mL，接種5盆作為試驗(yàn)組，另外5盆每盆接種20 mL無菌水作為對照，保持相對濕度在60%左右，溫度為20 ℃。接種24 h后發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組藜葉片明顯萎焉，采集處理組和對照組的藜葉片，將采集的葉片立即放入液氮中冷凍并放入-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)儀器與試劑

超高效液相（美國Agilent公司UHPLC1290型）、質(zhì)譜儀（美國Thermo Fisher Scientific公司Q Exactive Focus型）、微量離心機(jī)（美國Thermo Fisher Scientific公司Heraeus Fresco17型）、電子天平（德國Sartorius公司BSA124S-CW型）、研磨機(jī)（上海凈信公司JXFSTPRP-24）、超純水機(jī)（德國Merck Millipore公司Ming che D24 UV型）、色譜柱（美國Warers公司ACQUITY UPLC HSS T3型；2.1×100 mm，1.8 m）。甲醇、乙腈、乙酸銨、甲酸均購自德國CNW公司，2-氯-L-苯丙氨酸（上海恒柏生物科技公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理 將50 mg樣品放入EP管中。加入1000 μL萃取溶劑后（乙腈-甲醇-水，2:2:1，含內(nèi)標(biāo)），將樣品渦旋30 s，以45 Hz條件勻化4 min，然后在冰水浴中超聲提取5 min。勻漿重復(fù)超聲提取3次，然后在-20 ℃ 孵育1 h后，在4 ℃、12000 r/min離心15 min。取100 μL上清液于2 mL進(jìn)樣小瓶中，進(jìn)行UHPLC-QE Orbitrap/MS分析。

1.3.2 液質(zhì)聯(lián)用條件 采用液相色譜-質(zhì)譜儀聯(lián)用對代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離檢測。色譜條件：流動(dòng)相：A=0.1%甲酸＋5 mmol/L乙酸銨的水，B=乙腈。洗脫梯度設(shè)置為：0 min，1% B；1 min，1% B；8 min，99% B；10 min，99% B；10.1 min，1% B；12 min，1% B。流速為0.5 mL/min。進(jìn)樣量2 μL。質(zhì)譜條件：使用電噴霧離子源（ESI），鞘氣壓力為310 kPa，輔助氣體流速為5 L/min，毛細(xì)管溫度為320 ℃，全質(zhì)譜儀（MS）分辨率為70000 FWHM，MS/MS分辨率為17500 FWHM，碰撞能量梯度為20、40、60 eV，噴霧電壓為分別為3.8 kV（陽離子模式）及-3.1 kV（陰離子模式）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

1.4.1 數(shù)據(jù)處理與注釋 使用ProteoWizard軟件將來自于MS原始數(shù)據(jù)（.raw）文件轉(zhuǎn)換為mzML格式，并通過R軟件XCMS（3.2版）處理數(shù)據(jù)，處理過程包括保留時(shí)間對齊，峰檢測和峰匹配。然后按照以下標(biāo)準(zhǔn)過濾數(shù)據(jù)：樣本編號包含一個(gè)代謝物少于一個(gè)組中所有樣本數(shù)量的50%（質(zhì)控也被視為一個(gè)組）。隨后將每個(gè)樣品標(biāo)準(zhǔn)化為內(nèi)標(biāo)[15]。默認(rèn)情況下，將值替換為數(shù)據(jù)集中找到的最小值的一半[16]。預(yù)處理結(jié)果生成了一個(gè)數(shù)據(jù)矩陣，其中包括保留時(shí)間（RT），質(zhì)荷比（m/z）值和峰強(qiáng)度。使用 OSI-SMMS（1.0版，大連化工數(shù)據(jù)解決方案信息技術(shù)有限公司）進(jìn)行峰注釋后利用基迪奧生物科技有限公司自建數(shù)據(jù)庫MS/MS進(jìn)行處理。差異代謝產(chǎn)物分析采用主成分分析法和正交偏最小二乘判別分析法。

1.4.2 多元統(tǒng)計(jì)分析 主成分分析 PCA是一種統(tǒng)計(jì)過程，可將成千上萬個(gè)相關(guān)代謝物變量轉(zhuǎn)換為一組線性不相關(guān)變量的值，這些變量稱為主成分，采用R軟件包（http://www.r-project.org/）對兩組樣本進(jìn)行無監(jiān)督降維方法主成分分析，可對樣本進(jìn)行初步的可視化分析。

由于 PCA是一種缺乏監(jiān)督的分組方法。用該方法分組時(shí)，當(dāng)組內(nèi)樣品間的差異大于組間的差異時(shí)，該方法就顯得不夠清晰[17]。OPLS-DA是PLS-DA的擴(kuò)展，它在PLS中包含了正交信號校正（OSC）濾波器模型。OPLS的基本概念是將X的系統(tǒng)變化分為兩部分，一是與Y相關(guān)，另一種與Y不相關(guān)（正交）。僅Y預(yù)測變化用于對數(shù)據(jù)建模。同樣使用 R軟件包（http://www.r-project.org/）對兩組樣本比較。OPLS-DA模型已通過200次排列檢驗(yàn)[18]。一般以Q2作為預(yù)測模型是否可接受的參數(shù)；當(dāng)Q2＞0.4時(shí)，認(rèn)為預(yù)測模型可接受；當(dāng)Q2＞0.9時(shí)，則認(rèn)為是好的預(yù)測模型。

OPLS-DA模型的投影（VIP）得分被用于區(qū)分兩組的代謝物。VIP的閾值設(shè)置為1。此外，T檢驗(yàn)還用作篩選差異代謝物的單變量分析。那些t檢驗(yàn)的P＜0.05且VIP≥1被認(rèn)為是兩處理之間的差異代謝產(chǎn)物組。

KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因和基因組百科全書）是一個(gè)重要的與代謝通路相關(guān)的數(shù)據(jù)庫。它是將代謝物映射到KEGG代謝途徑以進(jìn)行途徑分析和富集分析[19]。其計(jì)算公式如下：

其中N是在KEGG可以注釋的所有代謝物數(shù)量，n是N中不同代謝物數(shù)量，M是能夠注釋到特定途徑的全部代謝物數(shù)量，m是M中不同代謝物的數(shù)量。P值通過錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率FDR矯正，以FDR≤0.05為閾值，滿足該條件的途徑被定義為差異代謝物中顯著富集的通路。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜的穩(wěn)定性

質(zhì)量控制（QC）樣品為混合來自所有樣品的等份上清液制備獲得。陰、陽離子條件下質(zhì)控樣本的峰強(qiáng)度以及保留時(shí)間基本重疊在一起，這表明試驗(yàn)過程誤差較小，儀器的可靠性較高。

2.2 主成分分析（PCA）

為判別PA-2侵染后對藜葉片代謝物累積差異，首先選擇主成分的方法進(jìn)行分析。PCA分析表明（圖1），在陽離子模式下（圖1A），PC1（第一成分）為75.1%，PC2（第二成分）為7.4%，兩個(gè)主要成分共解釋了原始數(shù)據(jù)的82.5%；在陰離子的模式下（圖1B），PC1（第一成分）為53%，PC2（第二成分）13.7%，兩個(gè)主要成分共解釋了原始數(shù)據(jù)的 66.7%。兩種模式下，各點(diǎn)的分布表明對照組和處理組之間差異明顯（P＜0.01）。由圖1可知，對照樣品均位于PC1負(fù)半軸，處理組均位于PC1正半軸，二者被明顯分開，說明兩個(gè)藜葉片在代謝物組成上有明顯不同。

圖1 PA-2侵染下差異代謝產(chǎn)物的PCA分析Fig.1 Score plots of two-dimensional PCA analysis of different metabolites under PA-2 infection

2.3 正交偏最小二乘法分析（OPLS-DA）模型的分析結(jié)果

2.3.1 OPLS-DA分析 在陽離子條件下R2X=0.597，R2Y=0.99，Q2=0.869，這些數(shù)據(jù)表明用59.7%變量可以解釋99.0%的組間差異，具有86.9%的預(yù)測能力；在陰離子條件下R2X=0.516，R2Y=0.979，Q2=0.887，表明用51.6%變量可以解釋97.9%的組間差異，具有88.7%的預(yù)測能力，無論陽、陰離子均具有較高的解釋率以及預(yù)測能力，說明本研究中所建立的OPLS-DA模型預(yù)測能力較強(qiáng)[20]，能夠有效解釋兩個(gè)樣品間的代謝差異（圖2）。

2.3.2 OPLS-DA模型的置換驗(yàn)證 對OPLS-DA模型的置換檢驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，Q2Y以及R2Y都沒有超過所對應(yīng)的臨界線，說明OPLS-DA模型不存在過擬合現(xiàn)象，模型穩(wěn)定性較好，達(dá)到了優(yōu)秀的模型標(biāo)準(zhǔn)，可以較好地解釋兩組樣本之間的差異。

圖2 陽、陰離子條件下的OPLS-DA模型置換檢驗(yàn)結(jié)果Fig.2 The result of OPLS-DA model permutation test under cation and anion conditions

2.4 兩組樣本間差異代謝物的確定

Loading-plot圖中距離中心點(diǎn)越遠(yuǎn)的點(diǎn)顯示了造成對照組和處理組的最大差異代謝產(chǎn)物。圖3所示，在陽離子條件下總共有9個(gè)差異化合物，其中5個(gè)未得到注釋，其余4個(gè)分別為奈替米星（Netilmicin，POS00403）、腺苷（Adenosine，POS00030）、腺嘌呤（Adenine，POS00001）、甜菜堿（Betaine，POS00005）；而在陰離子條件下總共有 12個(gè)差異化合物，其中 7個(gè)未得到注釋，其余5個(gè)分別為甘露醇（Mannitol，NEG00028）、焦谷氨酸（Pyroglutamic acid，NEG00008）、葡萄糖內(nèi)酯（Gluconolactone，NEG00118）、異尿苷（Idoxuridine，NEG08115）、腺嘌呤（Adenine，NEG00009）。

圖3 陽、陰離子條件下Loading-plot圖Fig.3 Loading-plot graph under cation and anion conditions

以O(shè)PLS-DA模型的VIP得分（VIP≥1），并結(jié)合t檢驗(yàn)（t-test）的結(jié)果P值（P＜0.05）來尋找兩組樣本間的差異性代謝物。在陽、陰離子條件下差異代謝物分別為998和894個(gè)，其中在陽離子條件下上調(diào)代謝物有800個(gè)，而下調(diào)代謝物有198個(gè)；在陰離子條件下上調(diào)代謝物有669個(gè)，下調(diào)的代謝物有225個(gè)。兩組樣品共篩選出185種差異代謝產(chǎn)物，其中明確的代謝物有30種（陽離子模式下有13種，陰離子模式下有21種，其中4種為二者共有）（表1）。由表1可以看出，與對照組相比，處理組的大部分差異代謝物都上調(diào)（Log2＞0），其中Log2變化倍數(shù)大于5.0的有利比妥（Ribitol）、橙皮素（Hesperetin）、次黃嘌呤（Hypoxanthine）、?；敲撗跄懰幔═aurodeoxycholic acid）、L-酪氨酸（L-Tyrosine），其中次黃嘌呤（Hypoxanthine）和L-酪氨酸（L-Tyrosine）的Log2變化倍數(shù)達(dá)到24.59和24.99；只有2種代謝物出現(xiàn)下調(diào)（Log2＜0），分別為 D-谷氨酰胺（D-Glutamine）和 L-谷氨酰胺（L-Glutamine），下調(diào)倍數(shù)不大。

表1 在陽離子和陰離子條件下識別代謝物的倍數(shù)變化Table 1 Fold changes of metabolites recognized under cationic and anionic conditions

2.5 差異性代謝產(chǎn)物通路分析

對出芽短梗霉菌PA-2侵染的藜葉片和對照組所鑒定到的差異代謝物進(jìn)行KEGG代謝通路的富集分析結(jié)果如圖4所示。差異代謝產(chǎn)物共注釋到5條主要的通路，分別為代謝過程、遺傳信息過程、環(huán)境信息過程、細(xì)胞過程、人類疾?。黄渲写x過程為差異代謝產(chǎn)物注釋的主要通路，它里面富集前三的代謝過程分別為全局和概述地圖、氨基酸代謝、碳水化合物代謝，能夠注釋到這3個(gè)差異代謝物分別為126（33.5%）、35（9.3%）和34（9.0%）種。如表2所示，全局和概述地圖內(nèi)以嘌呤代謝、次生代謝產(chǎn)物的生物合成及代謝途徑為主要的差異代謝物注釋途徑；氨基酸代謝途徑內(nèi)變化倍數(shù)較大的氨基酸分別為 L-酪氨酸、琥珀酸半醛、酮亮氨酸；碳水化合物代謝途徑內(nèi)變化倍數(shù)較大物質(zhì)有甘露醇、利比妥、myo-肌醇。

表2 差異代謝物參與的代謝途徑明細(xì)Table 2 List of metabolic pathways involved in different metabolites

圖4 差異代謝物KEGG注釋通路圖Fig.4 Differential metabolite KEGG annotation pathway diagram

2.6 不同代謝通路兩組樣本的代謝差異

2.6.1 兩組樣本全局和概述地圖內(nèi)的代謝產(chǎn)物變化 如表3所示，PA-2侵染下兩組樣本在全局和概述地圖內(nèi)以嘌呤代謝中的次黃嘌呤（Hypoxanthine）、次生代謝產(chǎn)物中的PE [20:5(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)/22:5(7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)]、代謝途徑中的皮質(zhì)酮（Corticosterone）等物質(zhì)的Log2差異倍數(shù)變化最大，分別達(dá)到了24.6、5.78和5.35倍，且三者與對照相比差異顯著（P＜0.05）。大部分差異代謝物上調(diào)，只有少部分下調(diào)。這些下調(diào)的差異代謝物多與細(xì)胞內(nèi)的膜結(jié)構(gòu)相關(guān)，如PC [18:3(6Z,9Z,12Z)/18:1(11Z)]下調(diào)1.23倍，PC [20:2(11Z,14Z)/14:0]下調(diào)1.49倍，PC [20:3(8Z,11Z,14Z)/14:0]下調(diào)0.66倍，PE [16:0/18:2(9Z,12Z)]下調(diào)0.56倍。這些結(jié)果說明，PA-2侵染后可能干擾嘌呤代謝和生物膜結(jié)構(gòu)。

表3 兩組樣本全局和概述地圖產(chǎn)物變化倍數(shù)Table 3 The fold change of global and overview maps of the two samples

2.6.2 兩組樣本氨基酸代謝產(chǎn)物變化 由表4可知，在PA-2侵染下，藜葉片在陰、陽離子模式下共檢測出29種差異的氨基酸代謝產(chǎn)物，其中4種氨基酸及其衍生物極顯著下調(diào)，分別是谷氨酰胺、L-天冬氨酸、2-氨基丙烯酸、甜菜堿；大部分氨基酸都是顯著上調(diào)，其中以L-酪氨酸、琥珀酸半醛、酮亮氨酸Log2變化倍數(shù)最大。這些結(jié)果說明，PA-2侵染后可能影響藜葉片內(nèi)的氨基酸代謝。

表4 兩組樣本氨基酸代謝產(chǎn)物的變化倍數(shù)Table 4 The fold change of amino acid metabolites of the two samples

2.6.3 兩組樣本碳水化合物代謝產(chǎn)物變化 由表5可知，PA-2侵染下，藜葉片大部分參與碳水化合物的產(chǎn)物都上調(diào)了，只有一種 L-谷氨酰胺極顯著下調(diào)。這些顯著上調(diào)的碳水化合物代謝產(chǎn)物中以甘露醇、利比妥、琥珀酸半醛3種Log2變化倍數(shù)大于5倍。這些結(jié)果表明，PA-2可能通過影響植物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和能量代謝而使藜死亡。

表5 兩組樣本碳水化合物代謝產(chǎn)物變化倍數(shù)Table 5 The fold change of carbohydrate metabolites of the two samples

3 討論

代謝組學(xué)是一個(gè)連接基因、蛋白與表型的方法，這幾年在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用較為成功，這為其在農(nóng)業(yè)各領(lǐng)域的研究提供了理論依據(jù)[21]。曾秘等[22]發(fā)現(xiàn)大部分真菌除草劑的有效成分為繁殖體，其代謝產(chǎn)物可以降低雜草生化和物理防御能力。嘌呤代謝是植物體內(nèi)一個(gè)重要的中間代謝過程，它可以連接很多過程，像核苷酸代謝、能量代謝、葉酸合成、氨基酸代謝等。嘌呤代謝失衡會(huì)引起核酸合成受阻細(xì)胞分裂減慢、直接能源ATP供應(yīng)不足、各種蛋白質(zhì)合成受阻，這些因素都會(huì)引起細(xì)胞啟動(dòng)程序性死亡信號。本研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜的組成成分磷脂酰類物質(zhì)在PA-2處理后急劇下調(diào)，這可能與該真菌破壞了藜細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)有關(guān)。這與羅淑芬等[23]通過對腺嘌呤衍生物——6-芐基腺嘌呤使蓮蓬保持較高的 ATP能荷狀態(tài)、防治活性氧積累，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的結(jié)論一致。研究表明葉酸參與植物葉綠素合成[24]。嘌呤代謝紊亂則會(huì)影響葉酸合成，進(jìn)而影響葉綠素的生物合成，因此推測PA-2有些代謝物可能作用于葉綠體抑制光合色素合成和阻斷能量傳遞過程。植物次級代謝產(chǎn)物包括萜類、酚類、含氮化合物等，它不是植物生長發(fā)育所必需的物質(zhì)，但對植物的生長發(fā)育必不可少，它們具有保護(hù)生物膜、抗氧化、組成核酸及酶等重要的生理作用[25,26]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PA-2侵染后，藜葉片次級代謝產(chǎn)物合成受到影響，可能使生物膜穩(wěn)定性下降、氧毒性、核酸代謝及生化反應(yīng)過程受阻等。

氨基酸是生物體內(nèi)所有蛋白質(zhì)的基本組成單位，自然界的氨基酸一般以L型存在，氨基酸代謝正常是植物完成其生命活動(dòng)的保障[28]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PA-2侵染下，藜葉片內(nèi)多達(dá)29種的氨基酸代謝產(chǎn)物變化，這與李光錦在褐腐菌Moniliniafructicola侵染下中華壽桃Prunuspersica內(nèi)差異蛋白質(zhì)變化較多的結(jié)果一致[29]、也與肖龍等[30]研究輪紋病病原菌Botryosphaeriadothidea脅迫下蘋果Malusdomestica差異蛋白達(dá)21個(gè)的結(jié)果相似。在植物中，酪氨酸通過莽草酸途徑從頭合成，同時(shí)也產(chǎn)生其他兩個(gè)芳香族氨基酸-苯丙氨酸和色氨酸[31]。研究表明苯丙氨酸是植物苯丙烷類代謝途徑的關(guān)鍵物質(zhì)，與植物抗病具有重要相關(guān)性[32]。色氨酸代謝途徑的下游次生代謝物不僅具有抗菌作用，而且與植物的防御反應(yīng)密切相關(guān)[33]。本研究酪氨酸在處理組Log2顯著上調(diào)25倍，可能引起苯丙氨酸和色氨酸減少，更利于PA-2侵染有關(guān)。最后，氨基酸代謝涉及植物體內(nèi)多種代謝，它的紊亂又影響其他代謝，這些可能共同參與PA-2的侵染。

碳水化合物是植物經(jīng)過光合作用產(chǎn)生的，它分為結(jié)構(gòu)性碳水化合物（Structural carbohydrates）和非結(jié)構(gòu)性碳水化合物（Non-structural carbohydrates），前者與植物能量供應(yīng)有關(guān)，后者參與植物生存策略[34]。本試驗(yàn)中與能量代謝有關(guān)的碳水化合物都顯著變化，這與張彩霞等[35]研究蘋果在輪紋病侵入過程中，篩選的差異蛋白中有很多參與能量代謝的結(jié)果一致。綜合上述，藜葉片內(nèi)能量供應(yīng)可能受到影響。而這些研究結(jié)果與趙麗娟等[27]在研究霜霉病菌對藜同科植物藜麥葉片代謝影響的研究結(jié)果一致，即霜霉病菌Peronosporafarinosaf.sp.chenopodii侵染引起藜科植物藜麥Chenopodiumquinoa葉片內(nèi)糖代謝、核酸代謝、氨基酸代謝、三羧酸循環(huán)等代謝途徑中的相關(guān)代謝物異常變化，進(jìn)而影響藜麥生長。

甜菜堿（Betaine）屬于生物堿類，它作為滲透保護(hù)物質(zhì)與脯氨酸以及可溶性糖共同調(diào)節(jié)植物滲透[36,37]。甘露醇是由植物內(nèi)甘露醇脫氫酶（MTD）限制的，而甘露醇也是一種抗逆物質(zhì)，它在植物抗致病微生物發(fā)揮作用，同樣它也和甜菜堿參與滲透調(diào)節(jié)。這兩種物質(zhì)作為標(biāo)志性差異化合物都參與滲透調(diào)節(jié)。出芽短梗霉菌作為殺菌劑通過與病原菌競爭空間與養(yǎng)分達(dá)到殺菌作用[9-11]。甜菜堿和甘露醇在出芽短梗霉菌侵染下極顯著上調(diào)可作為生物標(biāo)志物，而這與趙麗娟等[27]研究霜霉病菌侵染下藜科植物藜麥葉片極顯著上調(diào)物質(zhì)為琥珀酸半醛、異亮氨酸、絲氨酸等結(jié)果相悖，推測可能因?yàn)槎哐芯窟x用篩選差異化合物的標(biāo)準(zhǔn)和模型不同。本研究中甜菜堿和甘露醇的標(biāo)志性出現(xiàn)，推測PA-2也可能與植物細(xì)胞爭奪養(yǎng)分而使藜過度失水而死亡。細(xì)胞生長無非與碳水化合物代謝、能量代謝、核苷酸代謝等行為相關(guān)，這3條途徑是細(xì)胞生長的核心代謝途徑[38]。本研究發(fā)現(xiàn)在PA-2侵染下，藜葉片內(nèi)這3條代謝途徑均被影響。盡管代謝組分析能夠使我們?nèi)媪私獬鲅慷坦Ｃ咕秩鞠罗既~片代謝物變化，但其也具有不少缺點(diǎn)，如生物標(biāo)志物驗(yàn)證困難、對代謝物定性能力有限以及缺乏完整的解析代謝物生物學(xué)功能的數(shù)據(jù)庫[21]。為了更好地了解出芽短梗霉菌PA-2對藜的生防機(jī)制，通過不同組學(xué)結(jié)果的聯(lián)合分析，多組學(xué)間驗(yàn)證互補(bǔ)，將是下一步研究的重點(diǎn)。