長鏈非編碼RNA THOR在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及作用機(jī)制研究

蒲文杰，鐘曉武,，徐磊，高川力，李青容，程吉兵，周錫，楊密淵，郭曉蘭,

(川北醫(yī)學(xué)院，1.附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科；2檢驗(yàn)系；3.轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心，四川 南充 637000)

食管癌(esophageal carcinoma，EC)是全球第8大惡性腫瘤，也是第6大腫瘤死亡原因[1]。2018年全世界新增確診食管癌患者約572 034人，死于約508 585人，其中近一半發(fā)生在中國，且主要以食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)的病理類型出現(xiàn)，其相關(guān)死亡率位居惡性腫瘤致死的第四位，是造成人類死亡的主要原因之一[2-4]。近年來，雖然外科手術(shù)、放療、化療、免疫治療等治療方法不斷改進(jìn)，但由于EC發(fā)病隱匿且缺乏有效用于EC早期診斷的分子生物標(biāo)記物，導(dǎo)致EC早期診斷困難，約50%的EC患者在疾病后期或晚期接受診斷時已出現(xiàn)轉(zhuǎn)移[5]。

長鏈非編碼 RNA(long non-coding RNA，LncRNA)是一類長度大于200個核苷酸的非編碼RNA，是基因組轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中不具有編碼蛋白質(zhì)的基因序列，廣泛存在于所有真核生物的細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中，且在不同組織中表達(dá)具有特異性[6]。已有研究表明LncRNA可通過多種形式參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控，如染色質(zhì)修飾、染色體沉默、基因組印記等多種生物學(xué)功能，進(jìn)而參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡、細(xì)胞周期、細(xì)胞代謝等生命活動過程[7-10]。LncRNA的多功能的生物學(xué)特征，決定了其異常表達(dá)將與各類疾病特別是惡性腫瘤密切相關(guān)。睪丸相關(guān)的高保守的致癌長非編碼RNA (testis-associated highly-conserved oncogenic long non-coding RNA，LncRNA THOR)屬于基因間型的LncRNA，具有序列保守的特性且主要表達(dá)于正常睪丸和腫瘤組織中。研究發(fā)現(xiàn)LncRNA THOR能夠促進(jìn)腎癌細(xì)胞和骨肉瘤細(xì)胞在體內(nèi)外的增殖生長。還能通過提高鼻咽癌細(xì)胞干性，降低鼻咽癌細(xì)胞對順鉑的敏感性[11-13]。LncRNA THOR還可以直接與胰島素樣生長因子2 mRNA 結(jié)合蛋白1 (insulin-like growth factor 2 mRNA binding protein 1，IGF2BP1)結(jié)合，并調(diào)控胰島素樣生長因子2 (insulin-like growth factor 2，IGF2)、膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因同系物1(gliom-associated oncogene homolog 1，GLI-1)與MYC等下游靶基因，最終影響腫瘤發(fā)生的進(jìn)展。然而，LncRNA THOR在ESCC中表達(dá)情況及其可能的作用機(jī)制尚未有報道。本研究旨在分析ESCC中LncRNA THOR的表達(dá)情況，并且進(jìn)一步探討其在ESCC中的潛在功能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織 收集川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胸外科食管癌病例20例，所有病例均由經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師確診，組織標(biāo)本經(jīng)手術(shù)離體30 min內(nèi)剪取適量腫瘤中心組織，同時剪取距離切緣5 cm的癌旁正常食管上皮組織，立即浸在裝有RNAlater solution 的EP管中放入冰盒中運(yùn)輸，置于-80 ℃保存。該項研究符合《赫爾辛基宣言》，在獲得倫理審查委員會批準(zhǔn)及每一位患者知情同意的前提下進(jìn)行組織標(biāo)本及患者信息的收集。

1.1.2 細(xì)胞株 人食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系TE1、EC109、KYSE150以及正常食管鱗狀上皮細(xì)HET-1A由川北醫(yī)學(xué)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心提供。

1.2 方法

1.2.1 UALCAN分析 UALCAN (http://ualcan.path.uab.edu/index.html)是一個基于癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫，具備在線分析目的基因表達(dá)、相關(guān)性、預(yù)后分析和挖掘等功能的網(wǎng)站。首先登陸UALCAN，點(diǎn)擊TCGA analysis，輸入Gene names為LncRNA THOR，在TCGA dataset選擇Esophageal carcinoma，然后點(diǎn)擊Expression，分析LncRNA THOR在TCGA數(shù)據(jù)庫中食管癌不同亞組中的表達(dá)情況。

1.2.2 RNA提取 提取細(xì)胞/組織總RNA 時，先預(yù)冷PBS清洗2～3遍，加入1 mL Trizol裂解細(xì)胞15 min，待貼壁細(xì)胞完全脫落后，移至2 mL EP管。使用美國Thermo Fisher公司核酸濃度檢測儀檢測RNA濃度和吸光度(A值)，再應(yīng)用德國Roche公司Transcriptor FirstStrand cDNA Synthesis試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2.3 qRT-PCR 首先通過生工生物工程(上海)股份有限公司合成目的基因LncRNA THOR、GLI-1、MYC和內(nèi)參基因GAPDH的基因引物序列，見表1。再利用qRT-PCR將獲取的組織、細(xì)胞cDNA分別進(jìn)行mRNA檢測。擴(kuò)增反應(yīng)總體積為20 μL，包括Fast SYBR Green Master mix 10 μL，上、下游引物各0.2 μL，cDNA模板1 μL，加入滅菌滅酶ddH2O至總體積20 μL，每個樣本上3個復(fù)孔。qRT-PCR反應(yīng)結(jié)果數(shù)據(jù)采用德國Roche公司Light Cycler 96系統(tǒng)分析，按照公式2-ΔΔCT計算組織和細(xì)胞中目的基因的mRNA相對表達(dá)量。

表1 LncRNA THOR、GLI-1、MYC和內(nèi)參基因GAPDH的基因引物序列

1.2.4 siRNA實(shí)驗(yàn) 兩條不同LncRNA THOR siRNA序列，5′-CUACAUGGGUAAUCAAUAU-3′(si-LncRNA THOR-1)，5′-CUAUGGUGUGUGAACAUUA-3′(si-LncRNA THOR-2)及其對照序列購于生工生物工程(上海)股份有限公司，Viafect轉(zhuǎn)染試劑購于Promega公司。將處于對數(shù)期增殖的食管癌細(xì)胞按3×106個/孔均勻平鋪在六孔板，細(xì)胞生長密度達(dá)到50%時，開始進(jìn)行轉(zhuǎn)染。更換為不含胎牛血清和雙抗的DMEM培養(yǎng)基，把si-NC(對照)、si-LncRNA THOR-1、si-LncRNA THOR-2和Viafect轉(zhuǎn)染試劑，加入食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系TE1中，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.2.5 CCK-8實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)生長期食管癌TE1細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶-EDTA消化液消化后制成單細(xì)胞懸液，計數(shù)細(xì)胞，調(diào)整濃度為5×104/mL，96孔板每孔接種100 μL細(xì)胞懸液，設(shè)置4個平行組，每組設(shè)3個復(fù)孔和一個空白孔(只加100 μL培養(yǎng)基)，待細(xì)胞貼壁后，繼續(xù)培養(yǎng)0 h、12 h、24 h、48 h。每個時間點(diǎn)取出一組細(xì)胞，每孔加入10 μL CCK8試劑，細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h后放入酶標(biāo)儀于450 nm波長處測定吸光度值(A)，以時間(h)為橫坐標(biāo)，A為縱坐標(biāo)繪制生長曲線，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 劃痕試驗(yàn) 轉(zhuǎn)染細(xì)胞傳代至6孔板內(nèi)，用含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞單層融合度達(dá)90%左右時用10 μL槍頭垂直桌面在六孔板孔內(nèi)劃井字，完成后用PBS洗去孔內(nèi)的懸浮細(xì)胞，選取劃痕整齊的部位拍照，并標(biāo)記拍照點(diǎn)，用含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，劃痕12 h、24 h、48 h后，觀察選取位置劃痕寬度變化并拍照保存。

1.2.7 Western blot 使用RIPA試劑裂解轉(zhuǎn)染成功后的腫瘤細(xì)胞，冰上孵育至完全裂解，4 ℃、12 000 rpm，離心30 min，采用BCA法蛋白濃度測定試劑盒(美國Thermo Fisher公司)檢測蛋白濃度。配置10%凝膠，按照總蛋白40 μg，總體積10 μL上樣，恒壓80 V電泳至濃縮膠和分離膠交界處時，調(diào)整電壓至120 V繼續(xù)電泳至樣本遷移至凝膠末端處。在250 mA恒流下轉(zhuǎn)膜90 min，5%脫脂奶粉室溫封閉60 min，PBST洗PVDF膜3次，5 min/次，按說明書稀釋一抗GLI-1(兔源，貨號：ET1702-85)、MYC(鼠源，貨號：EM1902-38)，抗體購自杭州華安生物技術(shù)有限公司。將PVDF膜平整放置于孵育盒中，4 ℃振揺過夜。PBST洗PVDF膜3次，5 min/次，孵育對應(yīng)的兔源/鼠源二抗(杭州華安生物技術(shù)有限公司)60 min后避光顯影。

1.3 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 LncRNA THOR與EC患者臨床數(shù)據(jù)的相關(guān)性分析

利用UALCAN數(shù)據(jù)庫在線分析LncRNA THOR的表達(dá)情況，分別從EC的LncRNA THOR在不同樣本類型、腫瘤分期、腫瘤分級、性別、年齡、體重、種族、吸煙、腫瘤亞型等幾個方面進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果如圖1所示：LncRNA THOR在EC患者的表達(dá)顯著高于正常人，腫瘤分期為II和 III期，腫瘤分級為II和III級，年齡段為40～80歲，種族為高加索人和亞洲人的食管腺癌(esophageal adenocarcinoma，EAC)和ESCC男性患者也顯著高表達(dá)。

2.2 LncRNA THOR在ESCC癌組織和細(xì)胞的表達(dá)都升高

通過qRT-PCR檢測20例ESCC癌組織和癌旁組織的LncRNA THOR 表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ESCC癌組織中LncRNA THOR 表達(dá)水平對比癌旁組織顯著升高(P<0.05)(圖2)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與TCGA的數(shù)據(jù)一致都印證LncRNA THOR在ESCC中高表達(dá)，暗示LncRNA THOR可能是ESCC的促癌基因。

通過qRT-PCR檢測ESCC細(xì)胞系TE1、 EC109和 KYSE150和正常食管上皮細(xì)胞HET-1A中 LncRNA THOR 的表達(dá)情況，結(jié)果顯示TE1和EC109中LncRNA THOR 表達(dá)水平對比HET-1A明顯上調(diào)(P<0.05)(圖3)。

2.3 siRNA-LncRNA THOR敲降TE1細(xì)胞中LncRNA THOR的表達(dá)水平

將化學(xué)合成2個靶點(diǎn)siRNA (siRNA-LncRNA THOR-1和siRNA-LncRNA THOR-2) 轉(zhuǎn)染TE1細(xì)胞后，LncRNA THOR的表達(dá)量均降低(P<0.01) (圖4)。結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建LncRNA THOR敲降的TE1細(xì)胞。

2.4 敲降LncRNA THOR抑制TE1細(xì)胞增殖及遷移

為了探究LncRNA THOR對TE1細(xì)胞的影響，在TE1細(xì)胞中敲降LncRNA THOR以檢測其對TE1 細(xì)胞的影響。si-LncRNA THOR-1和si-LncRNA THOR-2轉(zhuǎn)染TE1細(xì)胞后，通過CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞增殖受到抑制(圖5)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。劃痕實(shí)驗(yàn)顯示(圖6)，與無意義對照組(si-NC)相比，2個靶點(diǎn)(si-LncRNA THOR-1、si-LncRNA THOR-2)進(jìn)行轉(zhuǎn)染的TE1細(xì)胞在12 h、24 h、48 h幾個時間位點(diǎn)均表現(xiàn)為遷移能力明顯受到抑制。結(jié)果表明，敲降LncRNA THOR能夠抑制TE1細(xì)胞增殖及遷移能力。

2.5 敲降LncRNA THOR下調(diào)TE1細(xì)胞中GIL-1和MYC mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平

siRNA-LncRNA THOR-1和siRNA-LncRNA THOR-2轉(zhuǎn)染TE1細(xì)胞后，與無意義轉(zhuǎn)染對照細(xì)胞(si-NC)相比， GLI-1和MYC mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平均下降(P<0.05)(圖7-圖8)。結(jié)果表明，敲降LncRNA THOR能夠顯著下調(diào) TE1 細(xì)胞中GLI-1和MYC的mRNA及蛋白的表達(dá)水平。

3 討論

ESCC是一種常見的惡性腫瘤，其發(fā)病隱匿，早期診斷困難是食管癌發(fā)病率居高不下的主要原因；而晚期發(fā)現(xiàn)的食管癌患者往往已經(jīng)失去手術(shù)治療的最佳時機(jī)，放化療的預(yù)后均令人堪憂，導(dǎo)致死亡率極難下降。因此，需要尋找ESCC的早期診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。研究表明，ESCC的發(fā)生發(fā)展與lncRNA密切相關(guān)，許多l(xiāng)ncRNA參與了ESCC的疾病進(jìn)程。Yao等[14]報道發(fā)現(xiàn)MALAT-1的上調(diào)與ESCC患者的生存率降低有關(guān)。抑制MALAT-1可影響ESCC細(xì)胞凋亡、遷移/侵襲、集落形成和細(xì)胞周期阻滯等。HOTAIR通過誘導(dǎo)啟動子區(qū)組蛋白H3K27甲基化，從而降低WIF-1的表達(dá)，激活Wnt/catenin信號通路參與ESCC 細(xì)胞的增殖和侵襲[15]。LncRNA THOR是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種非常保守的長非編碼RNA，具有睪丸組織特異性，并廣泛存在于人類多種腫瘤組織中。已經(jīng)有研究報道LncRNA THOR能夠在基因水平調(diào)控多個腫瘤的增殖，LncRNA THOR在腎細(xì)胞癌、胃癌、舌鱗狀細(xì)胞癌、肝癌等多種腫瘤中呈現(xiàn)異常高表達(dá)，并在其發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。然而，LncRNA THOR與ESCC之間的關(guān)系尚未研究。為了探究LncRNA THOR和ESCC之間的關(guān)系，本研究首先檢測了LncRNA THOR在ESCC中的表達(dá)情況，再利用siRNA敲降LncRNA THOR后檢測ESCC細(xì)胞生物學(xué)功能的變化。

已有的研究發(fā)現(xiàn)腎細(xì)胞癌組織標(biāo)本中LncRNA THOR異常高表達(dá)，同樣的發(fā)現(xiàn)LncRNA THOR在腎細(xì)胞癌細(xì)胞高表達(dá)[12]。體內(nèi)外研究均證實(shí)，靶向沉默LncRNA THOR可以抑制腎癌細(xì)胞的生長、增殖和存活，而過表達(dá)LncRNA THOR則可以增強(qiáng)細(xì)胞的活力和增殖能力。Song等[16]研究發(fā)現(xiàn)LncRNA THOR在胃癌中存在高表達(dá)的情況。Yang等[17]檢測到舌鱗狀細(xì)胞癌中LncRNA THOR表達(dá)上調(diào)。體內(nèi)外研究均證實(shí)，敲低LncRNA THOR可以抑制舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的生長、減少克隆形成和誘導(dǎo)G0/G1阻滯，而過表達(dá)LncRNA THOR可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)G0/G1期細(xì)胞數(shù)量增加。Cheng[18]等通過qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，LncRNA THOR在肝癌組織中的表達(dá)水平相對比正常肝組織呈顯著上調(diào)，且LncRNA THOR的表達(dá)水平與肝癌復(fù)發(fā)率和術(shù)后生存時間密切相關(guān)。該研究進(jìn)一步證實(shí)，沉默LncRNA THOR可顯著抑制肝癌細(xì)胞的生長、增殖、克隆形成、轉(zhuǎn)移、侵襲等能力。然而，LncRNA THOR的異常表達(dá)在ESCC發(fā)生發(fā)展中的具體機(jī)制尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)在ESCC癌組織和ESCC細(xì)胞系TE1和EC109、中LncRNA THOR表達(dá)顯著上調(diào)，提示LncRNA THOR可能參與ESCC的發(fā)生發(fā)展過程。 在ESCC細(xì)胞系TE1中敲減LncRNA THOR后，通過CCK8和劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖和遷移能力都受到抑制，表明LncRNA THOR能夠參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和遷移能力，進(jìn)而參與ESCC的遷移和侵襲過程。

LncRNA THOR能夠與IGF2BP1結(jié)合，并調(diào)控其依賴基因IGF2 、GLI-1、MYC等，最終影響腫瘤發(fā)生的進(jìn)展。敲除腎癌細(xì)胞中的LncRNA THOR可以顯著下調(diào)IGF2BP1依賴基因IGF2、GLI-1和MYC的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平。而過表達(dá)LncRNA THOR則可以上調(diào)IGF2BP1依賴基因的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平。因此，在腎癌細(xì)胞中，LncRNA THOR通過對IGF2BP1相關(guān)依賴基因調(diào)控，進(jìn)一步影響腎癌細(xì)胞的細(xì)胞生物學(xué)表現(xiàn)[12]。LncRNA THOR和IGF2BP1在舌鱗狀細(xì)胞癌組織中均表達(dá)上調(diào)，且在mRNA水平上表達(dá)呈正相關(guān)。LncRNA THOR通過與IGF2BP1相互作用調(diào)節(jié)IGF2的表達(dá)，影響下游信號通路MEK-ERK，進(jìn)而調(diào)控舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖[17]。本研究發(fā)現(xiàn)沉默LncRNA THOR后，TE1細(xì)胞中GLI-1和MYC的的 mRNA 及蛋白的表達(dá)水平都顯著降低，提示LncRNA THOR可能通過IGF2BP1相互作用調(diào)控GLI-1和MYC的表達(dá)水平，參與ESCC細(xì)胞的細(xì)胞增殖和遷移等，從而調(diào)控ESCC發(fā)展進(jìn)展。

綜上所述，LncRNA THOR在ESCC中異常高表達(dá)，且可能通過IGF2BP1相互作用調(diào)控GLI-1和MYC的表達(dá)，進(jìn)而參與ESCC的增殖與遷移過程，但具體調(diào)控機(jī)制尚需要體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究證實(shí)。本研究同時發(fā)現(xiàn)LncRNA THOR在ESCC中扮演著促癌基因的作用，暗示其可能成為ESCC潛在早期診斷分子標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)。