麝香保心丸對小鼠動脈粥樣硬化的作用及機制研究

劉盛祥，黃宇鵬，金紅艷，楊國康

過去幾十年，盡管醫(yī)療技術(shù)取得了長足的發(fā)展，但心血管疾病仍舊是威脅人類健康的主要殺手，其病死率超過全球總死亡率的30%。動脈粥樣硬化是一類慢性炎性反應(yīng)性疾病，主要表現(xiàn)為大量的脂質(zhì)沉積于血管內(nèi)壁，是心血管疾病尤其是動脈粥樣硬化性心臟病的主要發(fā)病機制。麝香保心丸是一類傳統(tǒng)的中藥復(fù)方制劑，主要由麝香、蘇合香、牛黃、人參提取物、肉桂和冰片等中藥提取而成[1]。多項研究表明，麝香保心丸可通過促進血管新生、調(diào)節(jié)細胞凋亡及延緩脂質(zhì)沉積為心血管系統(tǒng)提供保護作用[2-5]。動脈粥樣硬化的發(fā)生與多種致病因素相關(guān)，包括炎性反應(yīng)及脂質(zhì)沉積等[6]，而麝香保心丸能夠通過抑制這些致病因素延緩動脈粥樣硬化的發(fā)生，因此，能夠有效治療動脈粥樣硬化。 現(xiàn)探究麝香保心丸是否具有抗動脈粥樣硬化作用及其在載脂蛋白E敲除小鼠中的作用機制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)動物：SPF級ApoE-/-Vital雄性C57小鼠60只，8周齡，購于River實驗動物技術(shù)有限公司；飼養(yǎng)在(22±2)℃的房間內(nèi)，均可自由獲取水和食物，并給予明暗各12 h的光照條件。(2)藥品與試劑：麝香保心丸(上海和記藥業(yè)公司)；脂蛋白檢測試劑盒(南京建成生物科技有限公司)；TB Green Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒(日本Takara公司)。(3)儀器設(shè)備：Image-Pro Plus 6.0(美國Media Cybernetics公司)；高速冷凍離心機(美國Sigma公司)；酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)；熒光顯微鏡、包埋機(德國Leica公司)；切片機(上海斯歐醫(yī)療器械有限公司)；電泳儀(美國Bio-Rad公司)；凝膠成像系統(tǒng)(法國Vilber Lourmat公司)。

1.2 造模方法 2019年9月—2020年8月于武漢科技大學(xué)實驗動物中心進行實驗。本實驗按照中國衛(wèi)生研究院實驗動物管理及使用指南進行，并得到武漢科技大學(xué)實驗動物管理及使用委員會批準。按參考文獻[7]報道的方法，造模小鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)(富含21%脂肪和0.15%膽固醇)，連續(xù)喂養(yǎng)8周。造模小鼠的2項指標(biāo)總膽固醇(TC)及低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)均大于正常小鼠的50%視為造模成功。小鼠造模成功后，隨機數(shù)字表法分為干預(yù)組及對照組，每組30只。干預(yù)組予以麝香保心丸25 mg/kg灌胃(將麝香保心丸25 mg研沫加入生理鹽水1 ml配制成25 mg/ml溶液，根據(jù)小鼠體質(zhì)量計算所需的溶液體積)，每日1次，連續(xù)12周[8]。對照組予以等體積生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)12周。干預(yù)期間各組仍給予高脂飼料喂養(yǎng)。

1.3 檢測指標(biāo)及方法 末次給藥后小鼠均禁食24 h，于每只小鼠活體眼球取血至少0.2 ml，離心取血清，凍存?zhèn)溆?；然后小鼠頸椎脫臼法處死后開腹，切取主動脈竇、分離胸主動脈，盡可能除去血管周圍脂肪組織，4%多聚甲醛固定24 h以上。

1.3.1 主動脈樹斑塊大小檢測：將4%多聚甲醛固定好的胸主動脈用PBS浸洗2次，用解剖剪沿血管壁將血管縱向剖開，浸入油紅O染液中，37℃染色60 min后取出，用75%乙醇分化至管腔內(nèi)脂肪斑塊呈橘紅色或鮮紅色，其他部位近無色，然后用蒸餾水洗2次，將染色好的大體組織在白色濾紙和泡沫板上展開固定好，選擇良好的光線條件下，調(diào)整好焦距進行拍照，用Image J軟件分析測定血管斑塊面積百分比。

1.3.2 主動脈竇斑塊大小檢測：將固定好的主動脈竇部，15%、30%蔗糖梯度脫水，OCT包埋，液氮速凍，制成8 μm切片，油紅O染色，Image J軟件分析測定斑塊面積百分比。

1.3.3 血脂濃度檢測：取小鼠血液樣本離心提取血清，以南京建成生物科技有限公司的生物試劑盒采用ELISA法檢測TC、TG、HDL-C、LDL-C濃度。

1.3.4 主動脈組織IL-6、TNF-α蛋白表達檢測：小鼠主動脈組織4%多聚甲醛固定，梯度乙醇、二甲苯脫水,石蠟包埋，將主動脈制成4 μm切片，脫蠟處理后pH 9.0 EDTA抗原修復(fù)，PBS水洗，BSA封閉，一抗(1∶100)4℃過夜孵育、二抗(1∶200)室溫孵育，DAPI染核，吸干后抗熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡觀察獲取圖像進行分析。

1.3.5 主動脈組織LXRα、LXRβ、ABCA1和ABCG1蛋白表達檢測：用含有1%蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液裂解主動脈，研磨勻漿后4℃下離心獲得全蛋白質(zhì)；然后采用Western-blot法、使用BCA試劑盒對蛋白進行定量分析。每個樣品取等量的蛋白質(zhì)(20 μg)用10%凝膠進行免疫印跡，然后將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用含5%脫脂牛奶的TBST封閉，在4℃與特定的抗體一起搖床孵育過夜，包括LXRα、LXRβ、ABCA1和ABCG1;次日用TBST將膜洗滌3次，并用對應(yīng)的二抗孵育1 h，用TBST洗滌3次后配制ECL發(fā)光反應(yīng)液，并用凝膠成像系統(tǒng)檢測。

表1 引物序列

1.3.6 主動脈組織IL-6、TNF-α、肝細胞X受體-α(LXRα)、LXRβ、ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白A1(ABCA1)和ABCG1 mRNA表達檢測：以PCR法，使用Trizol試劑盒從主動脈組織中提取總RNA，再通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)為cDNA。使用TB Green Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒測量和分析特定基因的表達，包括IL-6、TNF-α、LXRα、LXRβ、ABCA1和ABCG1， GAPDH作為內(nèi)參。本研究中使用的引物序列見表1。擴增步驟如下：在95 ℃預(yù)變性30 s，然后在95℃變性5 s，接著60℃擴增20 s，持續(xù)40個循環(huán)，然后進行最后的解離，95℃持續(xù)5 s，60℃持續(xù)1 min和95℃持續(xù)0 s。

2 結(jié) 果

2.1 2組動脈粥樣硬化斑塊比較 與對照組比較，干預(yù)組小鼠整個主動脈樹斑塊面積、主動脈竇部斑塊明顯減少(t/P=3.021/0.019、3.238/0.001)，見圖1、2。

2.2 2組血清脂蛋白水平比較 與對照組比較，干預(yù)組血清TC、TG、LDL-C水平明顯降低(t=5.074、6.327、4.492，P均=0.001)，而LDL-C水平升高(t/P=3.138/0.001)，見圖3。

2.3 2組主動脈組織炎性因子比較 與對照組比較，干預(yù)組主動脈組織炎性因子IL-6及TNF-α mRNA表達降低(t/P=3.027/0.017、2.478/0.019)，見圖4。

注：與對照組比較，aP<0.05

注：與對照組比較，aP<0.01

注：與對照組比較，aP<0.01

A.主動脈組織IL-6、TNF-α表達水平(免疫熒光染色，×200)

B.主動脈組織IL-6、TNF-α mRNA表達水平

2.4 2組膽固醇流出途徑關(guān)鍵因子比較 與對照組比較，干預(yù)組中反映膽固醇流出途徑的主要指標(biāo)LXRα、LXRβ、ABCA1及ABCG1 mRNA表達水平均明顯升高(t=5.276、6.137、4.565、5.136，P均=0.001)，上述指標(biāo)蛋白表達亦升高，見圖5。

A.主動脈組織LXRα、LXRβ、ABCA1和ABCG1 mRNA表達水平

B.主動脈組織LXRα、LXRβ、ABCA1和ABCG1蛋白表達

3 討 論

動脈粥樣硬化相關(guān)的心血管疾病具有高病死率的特點，對患者造成巨大的威脅[9]。最初研究表明，動脈粥樣硬化表現(xiàn)為一系列復(fù)雜的病理生理過程，包括炎性反應(yīng)及血管內(nèi)皮下脂質(zhì)的聚集[6]。過去幾十年，麝香保心丸被廣泛用于心血管疾病的治療，本研究發(fā)現(xiàn)，麝香保心丸明顯延緩了載脂蛋白E敲除小鼠動脈粥樣硬化的進展，其作用歸因于炎性反應(yīng)及血管內(nèi)脂質(zhì)沉積的改善。

已有研究表明，動脈血管的炎性反應(yīng)與動脈粥樣硬化的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)[10-11]。當(dāng)促炎細胞因子在動脈管腔暴露時，處于靜止?fàn)顟B(tài)的血管內(nèi)皮細胞就會轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)，產(chǎn)生大量的黏附因子及趨化因子，使血液中的單核細胞結(jié)合到動脈管壁并浸潤到內(nèi)皮下，發(fā)生遷移的單核細胞逐漸分化成巨噬細胞，產(chǎn)生細胞因子加劇血管的炎性反應(yīng)，并促進動脈粥樣硬化的發(fā)生及發(fā)展。IL-6是一種炎性細胞因子，主要由單核/巨噬細胞分泌，通過激活巨噬細胞，促進巨噬細胞攝取低密度脂蛋白并上調(diào)黏附因子，參與動脈粥樣硬化的發(fā)生及發(fā)展，在介導(dǎo)動脈粥樣硬化的炎性反應(yīng)中起著重要作用[12-13]。鑒于IL-6在冠狀動脈疾病發(fā)生及發(fā)展中的重要性，靶向IL-6可能被證明是有效的。本結(jié)果顯示，干預(yù)組采用麝香保心丸治療后IL-6水平顯著低于對照組，提示麝香保心丸可抑制IL-6的表達，這可能是麝香保心丸抗炎抗動脈硬化的機制之一。TNF-α存在于發(fā)生動脈硬化的管壁上，通過上調(diào)內(nèi)皮細胞黏附因子的表達及下調(diào)內(nèi)皮一氧化氮合酶和環(huán)氧合酶-1的表達，從而引起內(nèi)皮功能障礙，最終導(dǎo)致動脈粥樣硬化的發(fā)生[14]。孔令東等[15]發(fā)現(xiàn)，敲除大鼠ApoE基因后TNF-α表達明顯上調(diào)，動脈粥樣硬化斑塊明顯增加，表明TNF-α具有促進動脈粥樣硬化的作用。本研究中發(fā)現(xiàn)，麝香保心丸組TNF-α表達明顯下調(diào)，提示麝香保心丸可以抑制TNF-α的表達，進一步提示麝香保心丸通過影響促炎因子參與動脈粥樣硬化的過程。

大量動物及細胞實驗表明，在動脈粥樣硬化的各個階段血管壁內(nèi)脂質(zhì)沉積是必不可少的病理生理過程，細胞通過促進膽固醇及其他脂質(zhì)從細胞中排除的途徑來緩解過量的脂質(zhì)聚集，泡沫細胞在這些脂質(zhì)代謝途徑中發(fā)揮著重要作用。在泡沫細胞中，巨噬細胞轉(zhuǎn)運蛋白包括ABCA1及ABCG1促進脂質(zhì)的轉(zhuǎn)運[16]。APOA1是HDL的組成部分，ABCA1促進膽固醇流出到脂質(zhì)含量低的APOA1，而ABCG1促進膽固醇流出到成熟的HDL[16]。LXR是一種受配體調(diào)控的核受體，受細胞內(nèi)膽固醇水平的調(diào)節(jié)，當(dāng)LXR激活時，編碼ABCA1及ABCG1的基因在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)。膽固醇衍生物(氧固醇)或類膽固醇分子(去氫甾醇)引起LXR的激活，通過ABCA1及ABCG1促進巨噬細胞膽固醇外排；同時還具有一定的抗炎作用[17]。因此，合成LXR激動劑已被用于治療動脈粥樣硬化。本結(jié)果顯示，麝香保心丸增加了ABCA1、ABCG1及其上游轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子LXR轉(zhuǎn)錄水平的表達，這些結(jié)果表明麝香保心丸通過增加LXR的活性激活膽固醇流出途徑，繼而增加下游轉(zhuǎn)錄因子ABCA1、ABCG1的表達，達到改善脂質(zhì)代謝的目的。

綜上所述，麝香保心丸具有一定的抗動脈粥樣硬化作用，其作用機制可能與抑制炎性反應(yīng)及激活膽固醇逆轉(zhuǎn)運途徑相關(guān)，但其具體的作用靶點還需進一步探討。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

劉盛祥：課題設(shè)計及文章撰寫；黃宇鵬：數(shù)據(jù)獲取及統(tǒng)計分析；金紅艷：收集資料及論文修改；楊國康：課題指導(dǎo)