單寧酸對(duì)青海田鼠食物攝入量與小腸結(jié)構(gòu)的影響

鐘 亮，余義博，朱紅娟，曲家鵬

（1. 中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所，青海 西寧 810008；2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3. 青海省動(dòng)物生態(tài)基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810008）

食物選擇是指動(dòng)物對(duì)其棲息地中的食物種類做出選擇的行為，與動(dòng)物自身生理狀態(tài)及環(huán)境中食物的可利用量密切相關(guān)[1]。影響食物選擇的因素主要包括：1)食物中營(yíng)養(yǎng)成分含量[1]；2)動(dòng)物的自身消化道結(jié)構(gòu)、集群類型及大小、性別、生理狀況等[2]；3)植物資源的季節(jié)性、地理位置分布以及生態(tài)環(huán)境的變化[3]；4)食物的氣味和味道[4]；5)植物次生代謝產(chǎn)物[5]。

食草動(dòng)物和植物的采食-反采食協(xié)同進(jìn)化形成了相互協(xié)調(diào)、相互制約的適應(yīng)關(guān)系[1,6]。在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中，植物對(duì)食草動(dòng)物形成了防御系統(tǒng)，即物理和化學(xué)防御[7-8]，使動(dòng)物的取食和消化代謝受到阻礙，從而讓動(dòng)物在食物選擇上受到一定限制[1]。物理防御主要是利用植物自身的結(jié)構(gòu)，比如針、刺、棘等，使食草動(dòng)物不易獲取其莖葉、果實(shí)等；而化學(xué)防御主要是指植物包含的次生代謝產(chǎn)物等抑制動(dòng)物的食物攝入量、生長(zhǎng)發(fā)育等[8-9]。

植物次生代謝產(chǎn)物是植物與環(huán)境在長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化過程中形成的[10]，根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同，次生代謝產(chǎn)物可分為酚類、萜類和含氮有機(jī)物等[11]。單寧酸是最常見的植物次生代謝產(chǎn)物之一，廣泛存在于植物中[11]。單寧酸味澀，能夠減少食草動(dòng)物對(duì)植物的取食量[12]。單寧酸還能夠影響動(dòng)物的形態(tài)、生理及行為等，取食較多的次生代謝產(chǎn)物后，動(dòng)物會(huì)產(chǎn)生惡心嘔吐感[13]。單寧酸可與動(dòng)物消化道內(nèi)的蛋白質(zhì)或酶結(jié)合形成絡(luò)合物，降低消化酶的活性，使腸道微生物菌群失調(diào)，降低動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收[14-15]。單寧酸到達(dá)單胃動(dòng)物的下胃腸道時(shí)，還可能改變腸上皮細(xì)胞的功能狀態(tài)，導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)吸收和利用受損[16]。

小腸是動(dòng)物消化吸收功能的基礎(chǔ)，其結(jié)構(gòu)對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收有重要作用。動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)狀況反過來也影響小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能，特別是小腸的絨毛長(zhǎng)度(villus length, V)、隱窩深度(crypt depth, C)、腸粘膜厚度以及絨毛表面積等[17-18]。小腸絨毛長(zhǎng)度與細(xì)胞數(shù)量顯著相關(guān)，絨毛短時(shí)，成熟細(xì)胞少，小腸對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分吸收能力差；隱窩深度反映了細(xì)胞生成率，隱窩變淺，細(xì)胞成熟率升高，分泌功能加強(qiáng)。小腸絨毛長(zhǎng)度/隱窩深度(V/C)與小腸的功能狀態(tài)相關(guān)，比值下降，表明小腸消化吸收功能減弱；比值升高，則小腸消化吸收功能增強(qiáng)，生長(zhǎng)加快[19]。李茜和侯海鋒[20]的研究表明，單寧酸可影響小腸形態(tài)，使肉雞空腸的絨毛變長(zhǎng)，隱窩深度下降，V/C 比值增大。

鼠類對(duì)含有單寧酸的食物具有一定的選擇能力[21]。在野外環(huán)境下，嚙齒動(dòng)物會(huì)更喜食單寧酸含量高的食物[22]，但也有研究發(fā)現(xiàn)，有些鼠類會(huì)更喜食單寧酸含量低的食物。如對(duì)東方田鼠(Microtus fortis)以及棕色田鼠(Lasiopodomys mandarinus)喂食含有不同濃度單寧酸的食物，兩種動(dòng)物都會(huì)優(yōu)先選擇進(jìn)食單寧酸含量低的食物[23-24]，因此不同嚙齒動(dòng)物對(duì)含不同濃度單寧酸食物的選擇可能存在差異。

植物群落豐富度越高，動(dòng)物的食物譜越廣，除了選擇取食含較低單寧酸的植物，還能夠通過攝入含不同次生代謝產(chǎn)物的植物來減少單寧酸對(duì)其的影響[25]。隨著海拔升高，草甸植物群落多樣性降低[26]，食草動(dòng)物對(duì)食物的可選擇性降低。同時(shí)，在高寒草甸生態(tài)系統(tǒng)中，多種植物單寧酸濃度隨著海拔升高而增加[27]。因此本研究選擇生活在高海拔地區(qū)的青海田鼠(Lasiopodomys fuscus)來探究單寧酸對(duì)其體重的影響以及青海田鼠對(duì)單寧酸的適應(yīng)性。

青海田鼠是倉鼠科(Circetidae)田鼠屬動(dòng)物，主要分布在青海、四川等地，棲息在海拔3 700～4 800 m的高寒草甸和草原[28]。通常青海田鼠很少取食含有較高單寧酸等次生代謝產(chǎn)物的植物[29]，但在食物匱乏的情況下，青海田鼠會(huì)攝食含高單寧酸的植物[30]。為探討高原小哺乳動(dòng)物對(duì)單寧酸(TA)的適應(yīng)機(jī)制，本研究以青海田鼠為研究對(duì)象，制備不同TA 含量的飼料，分析單寧酸對(duì)鼠類的體重和腸道結(jié)構(gòu)的影響，為探討單寧酸在高原動(dòng)植物相互關(guān)系中的作用提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

2017 年8 月，在果洛州瑪沁縣青珍鄉(xiāng)(34°12′05′ N，100°05′16′′ E，海拔4 326 m)高寒草甸采用籠捕法捕獲24 只健康、成年雄性青海田鼠。帶回實(shí)驗(yàn)室后，單籠飼養(yǎng)于中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所動(dòng)物 飼養(yǎng)房?jī)?nèi)的450 mm × 289 mm × 180 mm 塑料籠內(nèi)，適應(yīng)7 d，籠內(nèi)鋪有木屑，提供足量的水和食物。

1.2 試驗(yàn)食物

將北京科澳協(xié)力飼料有限公司生產(chǎn)的大小鼠生長(zhǎng)全價(jià)顆粒飼料粉碎后，分別添加0、3%、6%含量的單寧酸(購自上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司)[29]，再使用飼料顆粒機(jī)加工成顆粒狀飼料，放置于低溫干燥處。

1.3 飼喂試驗(yàn)

2019 年8 月25 日至10 月25 日，參考李俊年等[31]以及張賓[32]的方法，將體重相似的青海田鼠隨機(jī)分成3 組，每組8 只，分別用0 (對(duì)照組，CK)、3%和6%TA 處理的飼料連續(xù)喂食。在飼喂期間保持室內(nèi)溫度保持在(20 ± 3) ℃，定期清理糞便和墊料，避免交叉污染。分別在第7 天、第14 天、第28 天、第48 天和第60 天稱量青海田鼠的食物攝入量和體重變化。

采用Robbins[33]的公式計(jì)算試驗(yàn)個(gè)體對(duì)TA 食物的攝入量，即：

食物攝入量 = 投入食物量 ? 剩余食物量。

1.4 樣品處理

在試驗(yàn)第61 天將所有青海田鼠麻醉處死，取十二指腸、空腸、回腸中段的3～4 cm 腸管，迅速放置于10%中性福爾馬林溶液中固定，用于制作組織切片，測(cè)定小腸絨毛長(zhǎng)度和隱窩深度。

1.5 測(cè)定指標(biāo)

取下的腸道組織固定48 h 后，經(jīng)過水洗、脫水、透明、浸蠟、包埋處理后，進(jìn)行切片，經(jīng)蘇木精-伊紅(HE)染色，在顯微鏡下觀察小腸結(jié)構(gòu)，使用Motic Med 6.0 圖像軟件拍照，在視野下測(cè)量5 個(gè)最長(zhǎng)腸絨毛處的絨毛長(zhǎng)度和隱窩深度。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用混合線性效應(yīng)模型分析單寧酸對(duì)青海田鼠體重變化或食物攝入量的影響，以處理前到處理后(0 ? 60 d)青海田鼠的體重或食物攝入量作為響應(yīng)變量，單寧酸的濃度和時(shí)間作為固定效應(yīng)，個(gè)體差異作為隨機(jī)效應(yīng)(隨機(jī)截距)。模型分析的目標(biāo)：1)響應(yīng)變量隨時(shí)間的變化有無顯著差異；2)響應(yīng)變量隨時(shí)間的變化在各組有無顯著差異。模型選擇的依據(jù)是響應(yīng)變量體重與時(shí)間的變化趨勢(shì)：若響應(yīng)變量與時(shí)間的變化趨勢(shì)是直線型，則時(shí)間變量設(shè)為連續(xù)性變量；若響應(yīng)變量與時(shí)間的變化趨勢(shì)是無規(guī)律型，則時(shí)間變量設(shè)為分類型變量。將單寧酸的濃度0、3%和6%設(shè)為x1、x2和x3，響應(yīng)變量為y；進(jìn)食后若時(shí)間為連續(xù)型變量，將第 0 ? 60天表示為 t；若時(shí)間為分類型變量，將第 0、7、14、28、48、60 天分別表示為t1、t2、t3、t4、t5、t6。

根據(jù)以上假設(shè)，參考趙晉芳的研究[34]，構(gòu)建7 個(gè)模型，分別為：

式中：模型Ⅰ為空模型；模型Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ中的時(shí)間參數(shù)為連續(xù)型數(shù)據(jù)；模型Ⅳ、Ⅶ中的時(shí)間參數(shù)為分類型數(shù)據(jù)。

將模型Ⅰ至模型Ⅶ進(jìn)行比較，使用對(duì)數(shù)似然比評(píng)估模型，通過AIC 信息準(zhǔn)則進(jìn)行模型選擇，根據(jù)ΔAIC 值進(jìn)行排序，篩選出最優(yōu)模型[34-35]。

采用單因素方差分析探討單寧酸對(duì)小腸絨毛長(zhǎng)度和隱窩深度的影響。使用R 3.4.3 中的lmer 程序包進(jìn)行混合線性模型分析和模型選擇，使用emmeans程序包進(jìn)行單個(gè)時(shí)間點(diǎn)的組間比較。

2 結(jié)果

2.1 模型選擇

模型選擇結(jié)果(表1)表明，單寧酸對(duì)青海田鼠體重的影響選擇模型Ⅶ；單寧酸對(duì)青海田鼠食物攝入量的影響選擇模型Ⅶ。

2.2 單寧酸對(duì)青海田鼠體重變化的影響

混合線性效應(yīng)模型結(jié)果表明 (表2)，在單寧酸作用下，青海田鼠的體重隨著時(shí)間有顯著變化 (F =2.235，P = 0.015)，并且各組青海田鼠的體重隨著時(shí)間變化也有顯著差異 (F = 62.943，P ＜ 0.001)。試驗(yàn)開始時(shí)，各組間體重?zé)o顯著差異 (P ＞ 0.05)；第7 天時(shí)，3% TA 處 理 組 的 體 重 顯 著 高 于 對(duì) 照 組 (P ＜0.05)，6% TA 處理組的青海田鼠的體重與對(duì)照組無顯著差異，表明剛開始時(shí)6% TA 對(duì)青海田鼠體重增加無抑制作用，3% TA 對(duì)體重增加產(chǎn)生促進(jìn)作用；第14 天和第42 天時(shí)，3 組青海田鼠體重接近；第60 天時(shí)，6% TA 處理組的體重顯著高于對(duì)照組，表明青海田鼠對(duì)6% TA 在一段時(shí)間之后產(chǎn)生了適應(yīng)性，6% TA 對(duì)其體重增加具有促進(jìn)作用。

2.3 單寧酸對(duì)青海田鼠食物攝入量的影響

混合線性效應(yīng)模型結(jié)果表明(表3)，在0、3%和6% TA 的處理下，青海田鼠的食物攝入量隨著時(shí)間有顯著變化(F = 5.949，P ＜ 0.001)；各組青海田鼠的食物攝入量，隨著時(shí)間的變化也有顯著差異(F =8.726，P = 0.003 67)。第7 天時(shí)，3% TA 處理組和對(duì)照組的青海田鼠食物攝入量分別下降了33.3%和24.2%，6% TA 處理組上升了63.6%，對(duì)照組與3% TA 處理組的食物攝入量差異顯著(P ＜ 0.05)，表明剛開始進(jìn)食時(shí)，3% TA 對(duì)青海田鼠的食物攝入產(chǎn)生抑制作用；第14 天時(shí)，對(duì)照組與6% TA 處理組的青海田鼠的食物攝入量上升，3% TA 處理組的食物攝入量下降，3 個(gè)處理組間食物攝入量無顯著差異 (P ＞ 0.05)，但在第14 天之后，3%和6% TA 處理組的青海田鼠食物攝入量呈上升趨勢(shì)；第28 天至第60 天，3%處理組食物攝入量顯著高于對(duì)照組，表明在第14 天后青海田鼠對(duì)3% TA 產(chǎn)生適應(yīng)性，TA 促進(jìn)青海田鼠食物攝入量增加。

表1 混合線性效應(yīng)模型選擇結(jié)果Table 1 Mixed linear effect model selection results

表2 單寧酸對(duì)青海田鼠體重變化的影響Table 2 Effects of tannic acid (TA) on body weight of Lasiopodomys fuscus g

表3 單寧酸對(duì)青海田鼠食物攝入量的影響Table 3 Effects of tannic acid (TA) on food intake of Lasiopodomys fuscus g

2.4 單寧酸對(duì)青海田鼠小腸絨毛和隱窩深度的影響

不同TA 處理組青海田鼠小腸絨毛長(zhǎng)度有明顯差異(表4)。6% TA 處理組青海田鼠的小腸絨毛長(zhǎng)度顯著長(zhǎng)于對(duì)照組和3% TA 處理組(P ＜ 0.05)，3% TA處理組青海田鼠的小腸絨毛亦顯著長(zhǎng)于對(duì)照組(P ＜0.05)，表明TA 對(duì)青海田鼠小腸絨毛生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。對(duì)照組的隱窩深度顯著低于3% TA 和 6%TA 處理組(P ＜ 0.001)，3% TA 處理組的隱窩深度與6% TA 處理組無顯著差異，表明TA 在一定程度上促進(jìn)青海田鼠小腸隱窩深度的生長(zhǎng)。絨毛長(zhǎng)度/隱窩深度比(V/C)在3 組處理組中無顯著差異 (P ＞ 0.05)。

3 討論與結(jié)論

3.1 單寧酸與青海田鼠食物攝入量

動(dòng)物體重變化與其能量代謝狀況密切相關(guān)。體重的維持和調(diào)節(jié)取決于能量攝入和消耗之間的平衡?；旌暇€性效應(yīng)模型結(jié)果表明，隨著青海田鼠對(duì)單寧酸的適應(yīng)，高濃度的單寧酸對(duì)青海田鼠的體重由抑制轉(zhuǎn)變?yōu)榇龠M(jìn)作用，這與單寧酸對(duì)大林姬鼠(Apodemus speciosus)作用相似[36]。但如表2 所列，盡管不同處理組青海田鼠體重有顯著差異，但總體上青海田鼠體重是增加的。何嵐等[37]研究表明，含3%和6%單寧酸的飼料可顯著抑制東方田鼠體重增長(zhǎng)，與本研究結(jié)果相反。

嚙齒動(dòng)物的食性既受自身的遺傳性影響，也受生存環(huán)境的影響，是自然選擇和環(huán)境適應(yīng)的結(jié)果。顧新州[38]對(duì)高原鼠兔食物選擇的研究結(jié)果顯示，生活在高海拔地區(qū)高原鼠兔的食物選擇會(huì)隨著棲息環(huán)境的變化，產(chǎn)生食性泛化。食性泛化是嚙齒動(dòng)物對(duì)環(huán)境適應(yīng)的結(jié)果，也是其能從不同植物中獲取更多營(yíng)養(yǎng)所采取的策略。高海拔地區(qū)植被稀少，青海田鼠食物匱乏，對(duì)食物的選擇性更低[39]，雖然TA 對(duì)青海田鼠的體重有一定的負(fù)作用，但在能量需求條件下，為適應(yīng)嚴(yán)酷環(huán)境，青海田鼠會(huì)做出改變食物選擇性和食物可利用率的決策。通過攝食的調(diào)節(jié)來協(xié)調(diào)消化、同化水平的變化，補(bǔ)償能量和營(yíng)養(yǎng)的需求，使得青海田鼠能取食含較高濃度TA 的植物。

表4 單寧酸對(duì)青海田鼠絨毛長(zhǎng)度和隱窩深度的影響Table 4 Effects of tannic acid (TA) on the villus length and crypt depth of Lasiopodomys fuscus

單寧類植物次生代謝產(chǎn)物對(duì)動(dòng)物的影響因其活性對(duì)動(dòng)物的生理狀況[16]、植物群落豐富度而不同[26]，動(dòng)物的食物選擇對(duì)單寧酸的適應(yīng)性亦有所不同[25]。試驗(yàn)前期，TA 對(duì)青海田鼠食物攝入量具有一定的抑制作用，隨著時(shí)間的推移，抑制作用逐漸消失；試驗(yàn)后期，青海田鼠適應(yīng)了高濃度TA，TA 對(duì)青海田鼠食物攝入量增加起到促進(jìn)作用。李俊年等[31]對(duì)根田鼠食物攝入量的研究顯示，在3%和6%單寧酸處理下，TA 對(duì)根田鼠食物攝入量產(chǎn)生抑制作用。單寧酸可通過與胃腸道內(nèi)的酶類結(jié)合，抑制酶類的功能，進(jìn)而降低動(dòng)物的食物攝入量[40]。TA 對(duì)青海田鼠食物攝入量的抑制作用下降，可能是由于青海田鼠對(duì)TA 的抑制作用產(chǎn)生了適應(yīng)性[31]，同時(shí)TA 與唾液蛋白結(jié)合[41-42]，其中的脯氨酸能夠降低TA 的作用[43]。高濃度TA 能夠促進(jìn)青海田鼠食物攝入量的增加，可能主要有兩個(gè)原因。一是，植物次生代謝產(chǎn)物可分為兩大類：有毒代謝產(chǎn)物和消耗減少代謝產(chǎn)物，前者導(dǎo)致食物攝入和排便減少，食物消化率增加；后者導(dǎo)致食物攝入和排便增加，食物消化率不變[44]。二是，植物產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物對(duì)取食后的食草動(dòng)物并不完全是負(fù)面作用的[45]。植物產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物不只是由于食草動(dòng)物的取食，還可能是受到紫外線、強(qiáng)光、低溫、病原體入侵等因素誘導(dǎo)產(chǎn)生[46]。生長(zhǎng)在青藏高原的植物，長(zhǎng)期處于極端脅迫的環(huán)境中(如高海拔、低溫、強(qiáng)紫外線輻射等)，其酚類次生代謝物濃度較高[27]，青海田鼠適量采食含單寧酸的食物，有助于清除體內(nèi)的超氧化合物，避免其對(duì)細(xì)胞的損傷。Lin 等[30]研究也認(rèn)為，高原鼢鼠挖掘等活動(dòng)需要大量的能量，只能采食更多含有單寧酸的植物來滿足自身能量的需求。

3.2 單寧酸與動(dòng)物小腸結(jié)構(gòu)

小腸的發(fā)育情況決定了腸道內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物消化吸收，小腸消化吸收功能受到腸絨毛、隱窩深度與黏膜厚度和絨毛表面積等的影響。小腸絨毛長(zhǎng)度與小腸吸收功能相關(guān)，其長(zhǎng)度影響動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育[47]。試驗(yàn)結(jié)果顯示，單寧酸可以促進(jìn)青海田鼠小腸絨毛的生長(zhǎng)。Bozinovic 等[48]研究也證實(shí)南美洲栗鼠(Chinchilla brevicaudata)通過促進(jìn)小腸的增長(zhǎng)，來適應(yīng)添加的TA。小腸隱窩深度與上皮細(xì)胞生成率有關(guān)[49]。當(dāng)外界或動(dòng)物體內(nèi)因素引起小腸上皮細(xì)胞生成率上升、隱窩深度變深，小腸會(huì)產(chǎn)生大量具有分泌功能的上皮細(xì)胞，引起動(dòng)物的腹瀉[50]。本研究中TA 組小腸隱窩深度顯著高于對(duì)照組，表明TA 可加快小腸上皮細(xì)胞生長(zhǎng)速率，增加隱窩深度。TA 到達(dá)動(dòng)物腸道后可能改變腸上皮細(xì)胞的功能狀態(tài)，導(dǎo)致小腸營(yíng)養(yǎng)吸收和利用受損[16]。食物添加縮合單寧酸也會(huì)導(dǎo)致大鼠腸粘液分泌過多和腸上皮細(xì)胞增殖增加[51]。動(dòng)物小腸的吸收功能還和絨毛長(zhǎng)度與隱窩深度的比值(V/C)有關(guān)[50]。V/C 值增加表明小腸吸收消化能力增強(qiáng)；反之亦然。從結(jié)果來看，3 個(gè)處理組的V/C 值無顯著差異，說明TA 并沒有通過改變小腸結(jié)構(gòu)影響其消化吸收能力。陳寶江等[52]研究提出，TA 對(duì)不同動(dòng)物的影響存在顯著差別。茍昌勇等[53]的研究認(rèn)為，TA 可通過增加腸道胰蛋白酶活性增強(qiáng)仔豬養(yǎng)分消化吸收。此外TA 還可以降低小腸食糜pH、增加養(yǎng)分溶解度，提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收[54-55]。TA 對(duì)青海田鼠的促生長(zhǎng)作用機(jī)制尚不清楚，可能是通過影響消化酶、腸道微生物等方式來實(shí)現(xiàn)。

綜上，本研究討論了單寧酸對(duì)青海田鼠食物攝入量與小腸結(jié)構(gòu)的影響，研究結(jié)果表明，單寧酸會(huì)抑制青海田鼠進(jìn)食，隨著時(shí)間推移，抑制作用降低，青海田鼠對(duì)單寧酸產(chǎn)生適應(yīng)性后，單寧酸起到促進(jìn)其進(jìn)食的作用，但這一促進(jìn)作用并不是通過改變小腸結(jié)構(gòu)而實(shí)現(xiàn)的。