帕金森病患者血清中miRNA-153和miRNA-223的表達(dá)研究

單巖東，曾曉云，羅志秀，伍俊伊，周 潔，毛正盛

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其發(fā)病率隨年齡增長而增加，在65歲以上人群中的發(fā)病率可達(dá)2%[1]。PD的病理特征是中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元的選擇性變性丟失[2]，其癥狀包括典型的運(yùn)動癥狀(震顫、強(qiáng)直、姿勢步態(tài)異常和運(yùn)動遲緩)和非運(yùn)動癥狀(嗅覺減退、睡眠障礙、感覺異常等)。有研究估算了過去的25 y間PD的診斷準(zhǔn)確率，為80%[3]。但是有研究指出，在PD的早期階段(H-Y分級1級)，PD病程在5 y內(nèi)的診斷準(zhǔn)確率為53%，而病程在3 y內(nèi)的診斷準(zhǔn)確率僅為26%[4]。目前，PD的診斷主要依賴于臨床醫(yī)師對其臨床癥狀和體征的評估，而缺乏敏感性和特異性都較好的臨床診斷標(biāo)記物。

目前認(rèn)為PD是遺傳易感性與環(huán)境因素相互作用的結(jié)果，其中遺傳因素對PD的發(fā)病起著重要作用。MicroRNA(miRNA)是一種非蛋白質(zhì)編碼RNA，在正常和疾病狀態(tài)的各個過程中均具有重要的調(diào)節(jié)作用[5]。由于miRNA在疾病進(jìn)展中的異常表達(dá)，因此 miRNA可以作為診斷PD以及其他疾病的生物標(biāo)記物[6，7]。多個研究證實(shí)了miRNA-153和miRNA-223與PD病理改變之間的密切聯(lián)系[8～10]。本研究將定量檢測miRNA-153和miRNA-223在PD患者血清中的表達(dá)，評價其診斷PD的效能，以期為PD的診斷提供生物學(xué)標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選擇2018年1月至2019年6月在武漢市第四醫(yī)院住院的PD患者35例為研究對象(PD組)，其中男性16例，女性19例，平均年齡(65.12±10.37)歲。另選取同期本院體檢中心的健康體檢者40例為對照組，其中男性18例，女性22例，平均年齡(63.71±9.89)歲。兩組受試者的年齡、性別無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。所有受試者簽署知情同意書，本研究經(jīng)我院倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 PD納入標(biāo)準(zhǔn) 由兩名神經(jīng)科醫(yī)生根據(jù)英國PD腦庫的診斷標(biāo)準(zhǔn)診斷為原發(fā)性PD。

1.3 PD排除標(biāo)準(zhǔn) ①繼發(fā)性PD；②帕金森綜合征；③PD陽性家族史者；④患有腦血管疾病及其他全身系統(tǒng)嚴(yán)重疾病者。

1.4 收集血清樣本 抽取PD患者和健康體檢者的空腹肘靜脈血5 ml，置入含EDTA-K2抗凝劑的真空采血管中，靜置30 min，然后放入離心機(jī)，3000轉(zhuǎn)10 min，取上清液置于離心管中，放入-80 ℃冰箱保存。

1.5 RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄 按照血清RNA提取試劑盒(北京天根公司)說明書操作提取血清標(biāo)本中的總RNA，后用紫外分光光度計檢測吸光度值，選取比值在1.8～2.0的RNA樣本，放入-80℃冰箱。將上述RNA樣本采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Revertra Ace qRT-PCR Master Mix)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，置入-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6 實(shí)時定量PCR(qRT-PCR)檢測miR-153和miR-223的表達(dá) 根據(jù)GenBank中的基因序列號，用Primer Primer 5.0軟件設(shè)計引物(上海生工合成)，U6作為內(nèi)參。miR-153的上游引物序列：5’-TCAATGCCTATCAATTATGC-3’，下游引物序列：5’-CTAACGTACGATTCCATAGG-3’；miR-223的上游引物序列：5’-ATTCTGTACCGTATCGGCC-3’，下游引物序列：5’-TACCGGTACTATCCTAGAA-3’；U6的上游引物序列：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物序列：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。PCR反應(yīng)在ABI 7500 Fast熒光定量PCR儀(美國ABI公司)上進(jìn)行，程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 45 s，共40個循環(huán)。實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)運(yùn)用公式2-ΔΔCt進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 miRNA-153和miRNA-223在PD組和健康對照組血清中的表達(dá) 本研究中，PD組血清中miRNA-153的相對表達(dá)水平(1.87±0.64)明顯低于對照組(2.76±0.71)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.71；P<0.01)(見圖1A)；PD組血清miRNA-223的相對表達(dá)水平(1.62±0.64)與健康對照組(2.72±0.89)相比，也明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.07；P<0.01)(見圖1B)。

A B

2.2 血清miRNA-153、miRNA-223和miRNA153+miRNA-223對PD的診斷價值 根據(jù)ROC分析所示，血清miRNA-153作為診斷PD的AUC為0.8279，其敏感性和特異性分別為72.65%和81.24%；miRNA-223作為診斷PD的AUC為0.8404，敏感性和特異性分別為75.03%和77.14%；血清miRNA-153+miRNA-223作為診斷PD的AUC為0.8589，敏感性和特異性分別為77.34%和82.51%。血清miRNA-153和miRNA-223單獨(dú)診斷PD的AUC的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；血清miRNA-153+miRNA-223聯(lián)合檢測與分別單獨(dú)應(yīng)用血清miRNA-153、miRNA-223診斷PD的AUC相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，(P>0.05)(見表1、圖2)。

圖2 血清miRNA-153、miRNA-223以及miRNA-153+miRNA-223診斷PD的ROC

表1 血清miRNA-153和miRNA-223的診斷價值分析

2.3 PD組血清miRNA-153、miRNA-223的相對表達(dá)與H-Y分級的相關(guān)性分析 根據(jù)分析所示，PD組血清miRNA-153的相對表達(dá)(1.87±0.64)與H-Y分級(3.07±0.99)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.4504，P<0.01)；PD組血清miRNA-223的相對表達(dá)(1.62±0.64)與H-Y分級(3.07±0.99)無明顯相關(guān)性(r=-0.2289，P>0.1)(見圖3)。

圖3 PD組血清miRNA-153、miRNA-223相對表達(dá)水平與H-Y分級相關(guān)性分析的散點(diǎn)圖

3 討 論

PD是一種慢性、進(jìn)展性的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，目前尚無法治愈。明確診斷是PD在臨床方面的一大難題，尤其是在疾病的早期階段。因此臨床急需準(zhǔn)確可靠的PD診斷臨床標(biāo)記物。PD的病理特征是中腦黑質(zhì)致密部和紋狀體中的多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性退化，并形成纖維狀內(nèi)含物：路易體和路易神經(jīng)突。α-突觸核蛋白是路易體和路易神經(jīng)突含有的一種重要物質(zhì)，其大小為14 kDa，多位于突觸前末端和核膜中，主要作用為參與N-乙基馬來酰亞胺敏感因子受體介導(dǎo)的胞吐作用和突觸小泡的轉(zhuǎn)運(yùn)[11]。基因或環(huán)境的改變極易引起α-突觸核蛋白發(fā)生錯誤折疊，蛋白質(zhì)出現(xiàn)寡聚體，纖維性蛋白質(zhì)逐漸增多，可溶性改變，繼而路易小體出現(xiàn)，最終導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元受損。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)miRNA-153和miRNA-223通過調(diào)控α-突觸核蛋白，進(jìn)而與PD的發(fā)病及疾病的進(jìn)展產(chǎn)生密切聯(lián)系[8，9]。Annamaria等的研究發(fā)現(xiàn)[10]，PD患者的血清miRNA-223表達(dá)明顯下調(diào)。也有團(tuán)隊(duì)對PD患者腦脊液miRNA-153的表達(dá)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)腦脊液miRNA-153的表達(dá)明顯上調(diào)[12]；而在另一項(xiàng)研究中，PD患者血清miRNA-153的表達(dá)明顯下調(diào)[13]。Marisa等對PD患者唾液中miRNA-153和miRNA-223的表達(dá)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)miRNA-153和miRNA-223的表達(dá)均明顯下調(diào)[14]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照人群相比，PD患者血清miRNA-153和miRNA-223的表達(dá)均明顯下調(diào)；血清miRNA-153和miRNA-223作為診斷PD的AUC分別為0.8279和0.8404，而且敏感性和特異性均良好，因此可作為診斷PD的生物學(xué)標(biāo)記物。血清miRNA-153和miRNA-223單獨(dú)診斷PD的價值無明顯差異；而且血清miRNA-153聯(lián)合miRNA-223診斷PD的價值無明顯提升。

本研究還分析了PD患者血清miRNA-153和miRNA-223的相對表達(dá)與PD患者H-Y分級的相關(guān)性。我們發(fā)現(xiàn)，PD患者血清miRNA-153的相對表達(dá)與H-Y分級之間具有明顯的相關(guān)性，呈負(fù)相關(guān)；而PD患者血清miRNA-223的相對表達(dá)與H-Y分級無相關(guān)性。因此，血清miRNA-153的相對表達(dá)有可能成為評價PD病程進(jìn)展的一項(xiàng)指標(biāo)。

綜上所述，PD患者血清miRNA-153和miRNA-223的相對表達(dá)均明顯下調(diào)，可作為診斷PD的生物學(xué)標(biāo)志物；PD患者血清miRNA-153與H-Y分級呈負(fù)相關(guān)，可用于評估PD的病程進(jìn)展情況。但是，本研究還存在著很多局限性：樣本量較少；對照組為健康人群，進(jìn)一步的臨床應(yīng)用尚需納入與其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病(非PD所致的運(yùn)動障礙性疾病和變性疾病)；血清miRNA-153的表達(dá)是否能準(zhǔn)確評價PD的病程進(jìn)展等。這都需要進(jìn)一步的深入研究。