參透基因定位方法和流程

北京

基因定位就是確定基因在細(xì)胞中的位置，本文將按照三個(gè)步驟進(jìn)行基因定位：第一步，將基因定位在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核（X 染色體、Y 染色體、常染色體）；第二步，將基因定位在具體染色體；第三步，將基因定位在染色體的具體位置。筆者利用已知的形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、DNA 分子標(biāo)記等技術(shù)，采用經(jīng)典遺傳學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、分子遺傳學(xué)的相關(guān)方法，結(jié)合具體題目，對(duì)基因定位進(jìn)行深度解析。

1.定位在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核（X 染色體、Y 染色體、常染色體）

一般可采用家系調(diào)查、發(fā)病率調(diào)查（關(guān)注♀、♂差異）、正反交實(shí)驗(yàn)等經(jīng)典遺傳學(xué)方法進(jìn)行基因定位，需注意人類不可設(shè)計(jì)正反交實(shí)驗(yàn)，但可尋找正反交案例，如表1。

表1

2.定位在具體染色體

一般可利用已知的形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、DNA分子標(biāo)記等技術(shù)進(jìn)行基因定位，觀察待測(cè)基因與已知標(biāo)記是否存在連鎖關(guān)系，從而將其定位于具體染色體。

2.1 形態(tài)學(xué)標(biāo)記

形態(tài)學(xué)標(biāo)記即已知基因?qū)?yīng)的性狀，一般肉眼可見(jiàn)。待測(cè)基因與已知基因遺傳時(shí)若遵循基因自由組合定律，則待測(cè)基因與已知基因位于非同源染色體上；若遵循連鎖互換定律，則待測(cè)基因與已知基因位于一對(duì)同源染色體上。此方法的特點(diǎn)：數(shù)量少、周期長(zhǎng)、多態(tài)性少、受環(huán)境影響等。

【例1】P1 為新發(fā)現(xiàn)的黃瓜果實(shí)苦味純合品系，將其與P3（隱性純合）雜交得F1，F(xiàn)1測(cè)交結(jié)果如表2，已知控制果皮光澤、果皮綠色深淺、刺瘤密稀性狀的基因，分別位于黃瓜的4、6、7 號(hào)染色體上，推測(cè)控制P1 果實(shí)苦味的基因位于____號(hào)染色體上。

表2

【參考答案】7

【解析】①②測(cè)交結(jié)果遵循基因自由組合定律，所以苦味基因不位于4、6 號(hào)染色體上；③測(cè)交結(jié)果符合連鎖互換定律，所以苦味基因位于7 號(hào)染色體上。

2.2 細(xì)胞學(xué)標(biāo)記

細(xì)胞學(xué)標(biāo)記一般要用顯微鏡觀察。借助已知的染色體變異，包括染色體數(shù)目變異的單體、三體、細(xì)胞融合技術(shù)；染色體結(jié)構(gòu)變異的缺失、易位等。若待測(cè)基因與其存在連鎖關(guān)系，即可確定基因位于該號(hào)染色體上。此方法的特點(diǎn)：幾乎不受環(huán)境影響、數(shù)量少、材料獲取困難、費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、有些標(biāo)記對(duì)生物有害等。

2.2.1 利用染色體數(shù)目變異——單體

已知某隱性突變基因（a）位于常染色體上，現(xiàn)有某號(hào)染色體單體的顯性個(gè)體，利用其探究a 基因是否在該號(hào)染色體上。過(guò)程如圖1 所示：

圖1

若F1顯性性狀∶隱性性狀=1 ∶1，可推知該基因位于單體所在的該號(hào)染色體上；若F1全部是顯性性狀，可推知該基因不在該號(hào)染色體上。

2.2.2 利用染色體數(shù)目變異——三體

已知某隱性突變基因（a）位于常染色體上，現(xiàn)有某號(hào)染色體三體的顯性個(gè)體，利用其探究a 基因是否在該號(hào)染色體上。過(guò)程如圖2 所示：

圖2

若F2顯性性狀∶隱性性狀=5 ∶1，可推知該基因位于三體所在的該號(hào)染色體上；

若F2顯性性狀∶隱性性狀=1 ∶1，可推知該基因不在該號(hào)染色體上。

2.2.3 利用染色體數(shù)目變異——細(xì)胞融合技術(shù)

已知人鼠細(xì)胞融合過(guò)程中，鼠細(xì)胞會(huì)完整保留，人細(xì)胞染色體會(huì)隨機(jī)丟失，利用含有不同數(shù)量和類型人染色體的雜種細(xì)胞，表達(dá)出不同的人類基因產(chǎn)物，如表3 所示（+代表有，-代表無(wú)）。

表3

推知：a 基因位于1 號(hào)染色體，b 基因位于2 號(hào)染色體，c 基因位于1 號(hào)染色體，d 基因位于2 號(hào)染色體。

2.2.4 利用染色體結(jié)構(gòu)變異——缺失

誘變處理顯性純合子的花粉使其發(fā)生染色體片段缺失，然后為隱性純合子母本授粉。

圖3

對(duì)F1表現(xiàn)為隱性性狀的個(gè)體進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒定，觀察其發(fā)生缺失染色體為幾號(hào)染色體，即可推測(cè)控制該性狀的基因位于該號(hào)染色體缺失區(qū)段。

2.2.5 利用染色體結(jié)構(gòu)變異——易位

A 品系相互易位涉及基因連鎖群Ⅱ和Ⅸ，B 品系相互易位涉及基因連鎖群Ⅱ和Ⅻ，前者涉及染色體 7 和染色體9，后者涉及染色體9 和染色體11。

可知:基因連鎖群Ⅱ?qū)儆谌旧w9，基因連鎖群Ⅸ屬于染色體7，基因連鎖群Ⅻ屬于染色體11。

2.3 DNA 分子標(biāo)記

DNA 分子標(biāo)記即已知的可遺傳并可檢測(cè)的DNA 序列?？捎肞CR 技術(shù)、DNA 分子雜交技術(shù)或DNA 測(cè)序技術(shù)等來(lái)檢測(cè)。此方法的特點(diǎn)：直接以DNA 形式呈現(xiàn)，不受環(huán)境影響；數(shù)量多；多態(tài)性高；多呈共顯性；可鑒定基因型；遵循遺傳規(guī)律；需要技術(shù)支持。此方法主要用于基因定位、遺傳圖譜制作、親緣關(guān)系鑒定、基因型分析等方面。

2.3.1 基于PCR 技術(shù)的DNA 分子標(biāo)記

短串聯(lián)重復(fù)序列（SSR），如圖4 所示，其內(nèi)側(cè)為1-6bp核苷酸串聯(lián)重復(fù)序列；兩側(cè)序列高度保守（設(shè)計(jì)引物），特點(diǎn)為可PCR 擴(kuò)增；種類多、分布廣；有多態(tài)性、共顯性。

圖4

【例2】圖4 發(fā)現(xiàn)某人類罕見(jiàn)遺傳病，對(duì)其進(jìn)行深入研究，請(qǐng)回答下列問(wèn)題：

（1）通過(guò)對(duì)患者進(jìn)行_____調(diào)查得到圖5 所示圖譜，據(jù)圖5 可初步斷定該病為_(kāi)____性遺傳病，致病基因位于_____染色體上。

圖5

（2）為確定該病在幾號(hào)染色體上，提取家系成員的血細(xì)胞DNA，利用多組“微衛(wèi)星DNA”分子標(biāo)記進(jìn)行鑒定，其中利用________技術(shù)擴(kuò)增5 號(hào)染色體上的M 分子標(biāo)記結(jié)果如圖5（與系譜圖成員上下對(duì)應(yīng)），根據(jù)圖6 中信息選擇一組合適的引物：______ 。

圖6

（3）根據(jù)圖5 分析，除Ⅲ8 外所有患者均有_____（填“M1”“M2”“M3”或“M4”）類型的分子標(biāo)記，說(shuō)明致病基因與其高度連鎖，所以該致病基因位于______號(hào)染色體上。

（4）據(jù)圖5 分析Ⅱ3、Ⅱ4 基因型（用A、a 表示）和相應(yīng)分子標(biāo)記并標(biāo)在圖7 相應(yīng)位置。

圖7

（5）據(jù)圖5 推斷Ⅲ8基因型為_(kāi)_____，若電泳圖顯示其有M3M4 分子標(biāo)記，分析其產(chǎn)生的可能原因________。

【參考答案】（1）家系 顯 常 （2）PCR b、c （3）M2 5 （4）Aa aa

圖8

（5）Aa Ⅱ3減數(shù)分裂形成配子時(shí)同源染色體非姐妹染色單體發(fā)生交叉互換產(chǎn)生AM3 雌配子，與Ⅱ4的aM4雄配子結(jié)合，形成受精卵發(fā)育成Ⅲ8個(gè)體

【解析】（1）因?yàn)樵摬楹币?jiàn)遺傳病所以針對(duì)患者進(jìn)行家系調(diào)查；由于Ⅱ1、Ⅱ4不攜帶致病基因且連代遺傳，所以該病為顯性遺傳病；Ⅱ2為男性患者而Ⅲ1為女性正常人，所以不可能為伴X 染色體顯性遺傳，推知致病基因位于常染色體。（2）DNA 擴(kuò)增需用PCR 技術(shù)進(jìn)行,引物結(jié)合在兩側(cè)保守序列的3'端。（3）據(jù)圖5 分析，所有患者都有M2 標(biāo)記，可知致病基因與其高度連鎖位于5 號(hào)染色體。（4）電泳點(diǎn)樣孔在上方，所以越接近點(diǎn)樣孔分子標(biāo)記越大，即重復(fù)次數(shù)越多，反之越小，所以分子標(biāo)記如圖7，Ⅱ3、Ⅱ4的基因型分別是Aa、aa，M2 與A 連鎖，所以確定基因相應(yīng)位置（如圖8）。（5）Ⅲ8基因型為Aa，分子標(biāo)記卻是M3M4，說(shuō)明Ⅱ3的A 沒(méi)有與M2 一起進(jìn)入配子，所以原因是Ⅱ3減數(shù)分裂形成配子時(shí)同源染色體非姐妹染色單體發(fā)生交叉互換產(chǎn)生AM3 雌配子，與Ⅱ4的aM4 雄配子結(jié)合，形成受精卵發(fā)育成Ⅲ8個(gè)體。

2.3.2 基于DNA 分子雜交技術(shù)的DNA 分子標(biāo)記

限制酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)（RFLP），如圖9 所示，RE限制酶可將DNA 切出不同長(zhǎng)度的片段，DNA 堿基改變導(dǎo)致其酶切位點(diǎn)改變，限制酶切片段結(jié)合特定探針可作為分子標(biāo)記。待測(cè)基因與該分子標(biāo)記緊密連鎖，進(jìn)行基因定位。

圖9

【例3】成人型多囊腎病具有明顯的家族性，一般在35 歲以后逐漸發(fā)病，α-珠蛋白-3'HVR 探針是該病早期診斷的常用方法。研究人員利用α-珠蛋白-3'HVR 探針及電泳等相關(guān)技術(shù)對(duì)某患者家族的1～7 號(hào)成員進(jìn)行DNA檢測(cè)，結(jié)果如圖11 所示。請(qǐng)回答問(wèn)題：

圖10 成人型多囊腎病遺傳系譜

圖11 α-珠蛋白-3'HVR 探針檢測(cè)的電泳結(jié)果

（1）研究發(fā)現(xiàn)該家族的成人型多囊腎病由顯性基因控制，據(jù)圖10 分析，該病的致病基因位于______（填“常”“X”或“Y”）染色體。

（2）人的16 號(hào)染色體上α-珠蛋白基因的3′端容易發(fā)生突變，α-珠蛋白-3′HVR 探針能夠根據(jù)___________原則檢測(cè)該區(qū)突變片段的差異，綜合圖10、圖11 結(jié)果分析，患者都具有的α-珠蛋白基因片段是_________kbp。

（3）被檢測(cè)的α-珠蛋白基因與成人型多囊腎病基因高度連鎖，可以推斷該致病基因位于___號(hào)染色體上，且在染色體的位置上距離__________基因比較接近。

【參考答案】（1）常 （2）堿基互補(bǔ)配對(duì) 7.0（3）16 α-珠蛋白

【解析】（1）已知該病為顯性，由1 號(hào)為正常人而4 號(hào)為患者可推知該病的致病基因不位于X 染色體，而是位于常染色體。（2）探針檢測(cè)根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，電泳圖中所有患者均有7.0 kbp。（3）α-珠蛋白基因與成人型多囊腎病基因高度連鎖，所以致病基因位于16號(hào)染色體，因高度連鎖所以距離α-珠蛋白基因比較接近。

2.3.3 基于測(cè)序技術(shù)的DNA 分子標(biāo)記

單核苷酸多態(tài)性（SNP）主要是用以寡核苷酸雜交為基礎(chǔ)的DNA 芯片技術(shù)，直接以序列變異作為標(biāo)記（如圖12），是目前使用最廣泛的標(biāo)記。

圖12

【例4】SNP 是基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異引起的DNA 序列多態(tài)性?？蒲腥藛T利用SNP 對(duì)擬南芥抗鹽突變體的抗鹽基因進(jìn)行定位。

（1）SNP 在擬南芥基因組中廣泛存在，在不同DNA分子及同一DNA 分子的不同部位存在大量SNP 位點(diǎn)，某些SNP 在個(gè)體間差異穩(wěn)定，可作為DNA 上特定位置的遺傳______。

（2）研究者用化學(xué)誘變劑處理野生型擬南芥，處理后的擬南芥自交得到的子代中抗鹽∶不抗鹽=1 ∶3，據(jù)此判斷抗鹽為_(kāi)______性狀。

（3）為進(jìn)一步得到除抗鹽突變外，其他基因均與野生型相同的抗鹽突變體（記為m），可采用下面的雜交育種方案。

步驟一：抗鹽突變體與野生型雜交；

步驟二：_____________________；

步驟三：_____________________；

步驟四：多次重復(fù)步驟一～步驟三。

（4）為確定抗鹽基因在Ⅱ號(hào)還是Ⅲ號(hào)染色體上，研究者用抗鹽突變體m 與另一野生型植株B 雜交，用分別位于兩對(duì)染色體上的SNP1 和SNP2（如圖13）進(jìn)行基因定位。

圖13

①將m 和B 進(jìn)行雜交，得到的F1植株自交。將F1植株所結(jié)種子播種于________的選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到F2抗鹽植株。

②分別檢測(cè)F2抗鹽植株個(gè)體的SNP1 和SNP2，若全部個(gè)體的SNP1 檢測(cè)結(jié)果為_(kāi)_______，SNP2 檢測(cè)結(jié)果SNP2m 和SNP2B 的比例約為_(kāi)_______，則抗鹽基因在Ⅱ號(hào)染色體上，且與SNP1m 不發(fā)生交叉互換。

【參考答案】（1）標(biāo)記 （2）隱性 （3）得到的F1自交 篩選抗鹽突變體 （4）①含（一定濃度）鹽 ②均為SNP1m1 ∶1

【解析】（1）據(jù)題意SNP 可作為遺傳標(biāo)記。（2）據(jù)性狀分離比可判斷抗鹽為隱性性狀。（3）據(jù)題意，雜交育種的目的為得到除抗鹽基因突變外，其他基因均與野生型相同的抗鹽突變體。（4）據(jù)題抗鹽基因位于Ⅱ號(hào)染色體，突變體具有抗鹽隱性性狀，所以F2所有抗鹽個(gè)體抗鹽基因均與SNP1m標(biāo)記連鎖，與Ⅲ號(hào)染色體的SNP2 存在自由組合關(guān)系，所以SNP2m和SNP2B的比例約為1 ∶1。

3.定位在染色體具體位置

3.1 計(jì)算重組率

同源染色體的非姐妹染色單體發(fā)生交叉互換，導(dǎo)致同源染色體上的非等位基因重組，非等位基因距離越近，它們之間發(fā)生交換概率越小，形成重組型配子概率越小，反之則越大，DNA 分子標(biāo)記也遵循該規(guī)律。利用兩點(diǎn)或三點(diǎn)測(cè)驗(yàn)法計(jì)算重組型配子所占比例即可推出基因之間及基因與分子標(biāo)記之間的相對(duì)距離，進(jìn)而繪制出遺傳圖譜，單位cM。

【例5】已知控制玉米籽粒有色（C）/無(wú)色（c）、飽滿（S）/凹陷（s）、非糯（W）/糯性（w）的三對(duì)基因均位于9 號(hào)染色體上，請(qǐng)根據(jù)下列三個(gè)實(shí)驗(yàn)，確定無(wú)色凹陷糯性個(gè)體9 號(hào)染色體上三個(gè)基因的位置關(guān)系。

表4

圖14

【參考答案】

圖15

【解析】Cc-Ss 重組率：4%；Ww-Ss 重組率：20%；Ww-Cc 重組率：24%；所以無(wú)色（c）、凹陷（s）、糯性（w）基因的相對(duì)距離如圖15。

【例6】已知某致病基因A 位于5 號(hào)染色體上，其上還有兩種“微衛(wèi)星DNA”分子標(biāo)記M、N，統(tǒng)計(jì)基因和分子標(biāo)記類型為AaM1M2N1N2 個(gè)體產(chǎn)生配子種類和比例為AM2N2 ∶aM1N1 ∶AM2N1 ∶aM1N2 ∶AM1N2 ∶aM2N1=10 ∶10 ∶3 ∶3 ∶2 ∶2，若只考慮交換一次，請(qǐng)?jiān)趫D16中標(biāo)出AaM1M2N1N2個(gè)體的基因和分子標(biāo)記位置。

圖16

【參考答案】

圖17

【解析】根據(jù)配子種類和比例可知AM2N2 連鎖，aM1N1 連鎖，均位于5 號(hào)染色體上。Aa-M1M2 重組率：4/30；Aa-N1N2 重組率：6/30；M1M2-N1N2 重組率：10/30，所以位置關(guān)系如圖17。

3.2 利用已知序列轉(zhuǎn)座子或T-DNA

利用已知序列的轉(zhuǎn)座子或T-DNA 的隨機(jī)插入，導(dǎo)致基因突變，推知基因功能，根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)引物或探針，可測(cè)得基因位置、獲取基因序列。

【例7】根據(jù)T-DNA 的已知序列，利用PCR 技術(shù)可以擴(kuò)增出被插入的基因片段。其過(guò)程是提取_________植株的DNA，用限制酶處理后，再用___________將獲得的DNA片段連接成環(huán)（如圖18），以此為模板，從圖中A、B、C、D四種單鏈DNA片段中選取______作為引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到的片段將用于獲取該基因的全序列信息。

圖18

【參考答案】突變體 DNA 連接酶 B、C

【解析】只有突變體植株的DNA 被已知T-DNA 插入，所以提取突變體的DNA，用限制酶切割后用DNA 連接酶連接成環(huán)，利用T-DNA 的已知序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增被插入基因的序列，A、C 為順時(shí)針?lè)较?，B、D 為逆時(shí)針?lè)较?，擴(kuò)增被插入基因需B、C 這組引物。

3.3 原位雜交法

原位雜交法為根據(jù)目的基因序列設(shè)計(jì)探針，直接與變性的染色體DNA 按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則雜交，通過(guò)檢測(cè)記錄雜交信號(hào)進(jìn)行基因定位，流程如圖19。

圖19

總之，基因定位的方法很多，本文主要是利用已知的標(biāo)記技術(shù)結(jié)合經(jīng)典遺傳學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、分子遺傳學(xué)的方法進(jìn)行基因定位，最終繪制出遺傳圖譜和物理圖譜。