五味子多糖對卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖、自噬及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡的影響

苗昊，楊建立，張松青，燕喃

吉林市中心醫(yī)院婦科三療區(qū)，吉林吉林 132001

卵巢癌在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中發(fā)病率為第3 位，病死率卻高居首位，中國人群每年卵巢癌新發(fā)病例為52 971 例，且逐年增加，每年死亡達(dá)30 886例[1]。卵巢癌早期臨床癥狀不明顯，發(fā)現(xiàn)時多為晚期，目前多以手術(shù)、 化學(xué)治療為主，但效果并不理想，因此，尋找有效抑制卵巢癌發(fā)生及發(fā)展藥物是目前亟待解決的問題。

最新研究發(fā)現(xiàn)，五味子多糖對腫瘤細(xì)胞有明顯的抑制作用，但其具體抗癌機(jī)制尚未完全清楚[2]。腫瘤細(xì)胞長期在缺氧情況下仍能瘋狂生長，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞自噬便是其生存能力極強(qiáng)的重要因素[3]。該研究擬培養(yǎng)卵巢癌SKOV3 細(xì)胞并與不同劑量五味子多糖共同培養(yǎng)，探討五味子多糖對卵巢癌SKOV3 細(xì)胞增殖、自噬及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

在10%滅活胎牛血清的MEM 培養(yǎng)液中加入SKOV3 細(xì)胞(37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng))，待細(xì)胞長至瓶底80%左右，用0.25%胰酶消化后留取對數(shù)生長期細(xì)胞作為該研究的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。將細(xì)胞分為對照組（正常培養(yǎng) SKOV3 細(xì)胞）、五味子多糖組（SKOV3 細(xì)胞+分別加入 2.5、5、10 μg/L 五味子多糖進(jìn)行培養(yǎng) 72 h）。

1.2 檢測各組細(xì)胞增殖抑制率

在96 孔板中加入高、中、低劑量組SKOV3 細(xì)胞100 μg，在每孔內(nèi)加入 10 μg 的 CCK-8 試劑，置入培養(yǎng)箱（37 ℃ 5% CO2飽和濕度培養(yǎng)）內(nèi)培養(yǎng) 1～3 d，每組設(shè)6 個復(fù)孔，培養(yǎng)4 h 后酶標(biāo)儀調(diào)定波長為450 nm進(jìn)行檢測。

1.3 TUNEL 法檢測各組卵巢癌SKOV3 細(xì)胞凋亡情況

將各組培養(yǎng)72 h 卵巢癌SKOV3 細(xì)胞在無菌條件下從培養(yǎng)基吸出，經(jīng)過0.1% Trition X-100 透化后，加入 3%H2O2200 μL，漂洗 3 次×5 min，加入蛋白酶K 工作靜置20 min，再次漂洗后加入TUNEL 反應(yīng)液，于 37 ℃恒溫箱中避光孵育 1 h；PBS 清洗 3 次后加入DAPI，應(yīng)用PBS 再次漂洗3 次，最后封片劑封片。顯微鏡下觀察細(xì)胞，綠色為凋亡細(xì)胞，藍(lán)色為存活細(xì)胞，凋亡指數(shù)計算：凋亡指數(shù)（AI）＝各視野陽性細(xì)胞數(shù)/視野所有細(xì)胞總數(shù)×100.00%。

1.4 Western blot 檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及自噬標(biāo)記蛋白表達(dá)

提取培養(yǎng)72 h 成對數(shù)生長的SKOV3 細(xì)胞并進(jìn)行蛋白測定，制備細(xì)胞蛋白樣本后各抽取50 μg 加入10%的SDS-PAGE 電泳中，干法轉(zhuǎn)膜90 min 后，將加入到5%脫脂牛奶中封閉2 h，再加入anti-GRP78（1：800）、anti-CHOP（1∶1 000）、anti-Beclin-1（1:800）、anti- LC3Ⅰ（1:1 000）及 anti-LC3Ⅱ（1:1 000），4℃孵育6 h，TBST 漂洗后，加入二抗 anti-rabbit（1∶1 000）溫孵育2 h，ECL 化學(xué)發(fā)光顯像。

1.5 統(tǒng)計方法

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以（±s）表示，采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SKOV3 細(xì)胞的增殖抑制率

與對照組相比，五味子多糖組（2.5、5、10 μg/L）培養(yǎng)24 h、48 h 及72 h 時增殖抑制率升高，且呈劑量依賴型，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組SKOV3 細(xì)胞的增殖抑制率對比（±s）

表1 各組SKOV3 細(xì)胞的增殖抑制率對比（±s）

組別 劑量（μg/L）五味子多糖組(n=6)增殖率抑制（%）24 h 48 h 72 h 10 5 2.5對照組(n=6)F 值P 值27.58±3.64 17.94±2.29 7.68±1.37 3.46±0.11 26.33＜0.01 34.16±3.48 25.57±2.63 13.29±2.06 3.94±0.74 33.45＜0.01 44.49±4.31 31.68±3.31 22.81±2.63 4.15±0.58 38.75＜0.01

2.2 細(xì)胞凋亡結(jié)果

TUNEL 結(jié)果顯示，與對照組 AI（4.55±0.68）相比，五味子多糖低劑量組（12.01±1.48）、中劑量組（19.82±2.55）、高劑量組（26.38±3.24）細(xì)胞 AI 指數(shù)均明顯升高，且AI 隨劑量的增高而增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=26.49，P＜0.05）。

2.3 卵巢癌 SKOV3 細(xì)胞 GRP78、CHOP、Beclin-1、LC3Ⅰ及LC3Ⅱ的表達(dá)

與對照組相比，五味子多糖組 （2.5、5、10 μg/L）GRP78、CHOP 表達(dá)及 LC3Ⅰ/ LC3Ⅱ值升高，Beclin-1表達(dá)降低，且呈劑量依賴型，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1、表2。

圖1 五味子多糖對 SKOV3 細(xì)胞 GRP78、CHOP、Beclin-1、 LC3Ⅰ及LC3Ⅱ影響電泳圖

表2 五味子多糖對SKOV3 細(xì)胞GRP78、CHOP、Beclin-1 及LC3Ⅰ/LC3Ⅱ的影響（±s）

表2 五味子多糖對SKOV3 細(xì)胞GRP78、CHOP、Beclin-1 及LC3Ⅰ/LC3Ⅱ的影響（±s）

組別 劑量（μg/L）GRP78CHOP Beclin-1 LC3Ⅰ/LC3Ⅱ五味子多糖組(n=6)2.5 5 10對照組(n=6)F 值P 值0.29±0.03 0.38±0.02 0.49±0.05 0.76±0.08 9.63<0.01 0.36±0.07 0.41±0.06 0.61±0.06 0.93±0.12 11.24<0.01 1.53±0.11 1.32±0.16 1.13±0.09 0.96±0.07 15.62<0.01 1.26±0.09 1.53±0.24 2.09±0.33 2.64±0.27 24.75<0.01

3 討論

五味子多糖是中藥五味子的提取物之一，具有多重生物學(xué)作用，已有研究證實(shí)，五味子多糖可有效抑制SKOV3 細(xì)胞增殖，當(dāng)五味子多糖體外培養(yǎng)10 μg/L時，SKOV3 細(xì)胞增殖抑制率為42%，并通過線粒體途徑促使凋亡[4]。該該研究通過CCk-8 法亦得出五味子多糖可明顯抑制SKOV3 細(xì)胞增殖，五味子多糖體外培養(yǎng) 10 μg/L 時，SKOV3 細(xì)胞增殖抑制率為 （44.49±4.31）%。結(jié)果基本相同對照組凋亡 AI 僅為 （4.55±0.68），而五味子多糖10 μg/L，在該研究后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中證實(shí)，五味子多糖可明顯促進(jìn)SKOV3 細(xì)胞凋亡，經(jīng)TUNLE 染色，對組 AI 高達(dá)（26.38±3.24）。該研究與其他研究不同之處在于，該次對各組細(xì)胞進(jìn)行了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡標(biāo)志物GRP78CHOP 及細(xì)胞自噬標(biāo)記物Beclin-1、 LC3Ⅰ及LC3Ⅱ蛋白進(jìn)行檢測。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是真核細(xì)胞均有的保護(hù)性機(jī)制，GRP78 蛋白可分解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中累積的錯誤折疊蛋白或未折疊蛋白，使其重新折疊為細(xì)胞所需蛋白，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激超過一定強(qiáng)度時，則可能激活CHOP 蛋白，直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時提高細(xì)胞自噬激活程度，促進(jìn)自噬體包裹損傷的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及錯誤折疊蛋白質(zhì)，使其降解為可用物質(zhì)，重新進(jìn)行細(xì)胞增殖[5-6]。LC3 是目前研究認(rèn)為對自噬特異性高的蛋白分子，當(dāng)自噬發(fā)生時，LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)化，激活細(xì)胞自噬系統(tǒng)[7-8]。Beclin-l也是自噬標(biāo)志蛋白，其與Vps34 形成復(fù)合體，促使磷脂酰肌醇磷酸化，從而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬[9]。

既往有學(xué)者[10]研究五味子多糖誘導(dǎo)SKOV3 細(xì)胞凋亡機(jī)制，僅對凋亡標(biāo)志蛋白Caspase-3 及Bcl-2/Bax 進(jìn)行檢測，研究并不深入，該研究則從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及自噬角度說明五味子多糖有效抑制SKOV3 細(xì)胞增殖的具體機(jī)制。該研究結(jié)果顯示，SKOV3 細(xì)胞自身GRP78、CHOP、Beclin-1、 LC3Ⅰ及 LC3Ⅱ均存在一定表達(dá)量，說明卵巢癌SKOV3 細(xì)胞在正常培養(yǎng)下，仍可發(fā)生一定程度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡及自噬，而當(dāng)SKOV3 細(xì)胞培養(yǎng)過程中，添加五味子多糖后，GRP78、CHOP 蛋白表達(dá)增加，說明五味子多糖可使SKOV3 細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡程度加重； 與此同時，Beclin-1 蛋白表達(dá)減少，并且LC3Ⅰ/ LC3Ⅱ值升高，LC3Ⅰ減少向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)化，說明五味子多糖與SKOV3細(xì)胞共同培養(yǎng)，可抑制腫瘤細(xì)胞自噬程度。由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果推斷，五味子多糖可能通過抑制腫瘤細(xì)胞自噬，減少對存在未折疊蛋白內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分解，進(jìn)而加重內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬程度，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡，從而抑制卵巢癌SKOV3 細(xì)胞增殖。

綜上所述，五味子多糖可能通過抑制卵巢癌SKOV3 細(xì)胞自噬，增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡敏感性，從而起到抑制SKOV3 細(xì)胞增殖的作用。五味子多糖有可能成為未來臨床治療卵巢癌的輔助用藥，減少卵巢癌患者復(fù)發(fā)程度。