舒芬太尼聯(lián)合酮咯酸氨丁三醇對(duì)大鼠創(chuàng)面愈合及瘢痕的影響

管釗銘 ，吳曉煬 ，劉俊江 ，劉巖 ，于淼 ，徐松齡

1.牡丹江醫(yī)學(xué)院第一臨床醫(yī)學(xué)院，黑龍江牡丹江 157011；2.牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院麻醉科，黑龍江牡丹江 157011

目前，隨著鎮(zhèn)痛藥物和鎮(zhèn)痛技術(shù)的不斷更新，術(shù)后鎮(zhèn)痛已被廣泛應(yīng)用[1]。有效的術(shù)后鎮(zhèn)痛不但可以減輕患者痛苦，還有利于創(chuàng)面愈合，而創(chuàng)面愈合必然伴隨著瘢痕組織的形成。在創(chuàng)面愈合的過程中，一旦膠原纖維生成異常，就會(huì)形成病理性瘢痕，可能會(huì)對(duì)患者機(jī)體功能方面帶來影響。作為目前臨床上常用的鎮(zhèn)痛藥物，舒芬太尼和酮咯酸氨丁三醇可用于術(shù)后鎮(zhèn)痛，并且舒芬太尼聯(lián)合酮咯酸氨丁三醇有利于創(chuàng)面愈合[2]。該課題在 2019 年 10 月—2020 年 1 月期間選取64 只SPF 級(jí)雄性SD 大鼠研究舒芬太尼和酮咯酸氨丁三醇對(duì)SD 大鼠血液中白介素 (Interleukin,IL)IL-1和IL-10，創(chuàng)面周圍組織粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)的表達(dá)以及對(duì)創(chuàng)面愈合情況和瘢痕組織的影響。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF 級(jí)雄性 SD 大鼠 64 只，體重(380±20)g。大鼠IL-1、IL-10、GM-CSF ELISA 檢測(cè)試劑盒和 BCA 蛋白定量試劑盒。枸櫞酸舒芬太尼注射液 (國藥準(zhǔn)字H20054171)、 酮咯酸氨丁三醇注射液 (國藥準(zhǔn)字H20193142)。

1.2 方法

1.2.1 分組 SD 大鼠隨機(jī)分為4 組，分別為：酮咯酸氨丁三醇組(T 組)、舒芬太尼組(S 組)、酮咯酸氨丁三醇+舒芬太尼組(T+S 組)、空白對(duì)照組(C 組)。

1.2.2 模型制備 用 0.6%戊巴比妥鈉 (國藥準(zhǔn)字H31021725)以0.1 mL/10 g 進(jìn)行腹腔麻醉，麻醉后剪去其頸背部體毛，以脊柱為中線做一約1 cm×1 cm 大小的皮膚全層缺損。

1.2.3 給藥方法 T 組大鼠注射酮咯酸氨丁三醇(國藥準(zhǔn)字 H20193142)3.5 mg/（kg·12 h），S 組大鼠注射舒芬太尼 (國藥準(zhǔn)字 H20054171)1.5 μg/（kg·12 h），T+S組大鼠注射酮咯酸氨丁三醇 (國藥準(zhǔn)字H20193142)3.5 mg/（kg·12 h）和舒芬太尼(國藥準(zhǔn)字 H20054171)1.5 μg/（kg·12 h），C 組大鼠注射 0.9%氯化鈉注射液，各組差量用生理鹽水補(bǔ)齊。從大鼠鼠尾靜脈進(jìn)行給藥，每12 小時(shí)給藥1 次，每日定時(shí)給藥，直至創(chuàng)面愈合。

1.2.4 標(biāo)本處理 在第 3、7、10 天，每組隨機(jī)取 4 只大鼠抽取外周靜脈血，離心取血清液，用ELISA 檢測(cè)大鼠血清中IL-1 和IL-10 的含量。剪取創(chuàng)緣5 mm×5 mm皮膚組織，分成2 份，一份用 ELISA 法測(cè)定GM-CSF的表達(dá)；另一份用于制作蘇木精-伊紅染色(HE 染色)病理切片。每組最終剩余大鼠用來觀察創(chuàng)面愈合時(shí)間和瘢痕面積。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 IL-1、IL-10 和 GM-CSF 的表達(dá) 在第 3、7、10 天，檢測(cè)血清中IL-1、IL-10 的濃度和組織中GMCSF 的濃度。為了避免取材誤差，使用BCA 蛋白法檢測(cè)各組織的蛋白濃度，應(yīng)用GM-CSF 的濃度/蛋白濃度的比值來觀察GM-CSF 的表達(dá)[3]。

1.3.2 創(chuàng)面愈合時(shí)間和愈合后瘢痕面積 記錄各組大鼠創(chuàng)面愈合時(shí)間和愈合后瘢痕組織的面積。

1.3.3 HE 染色 各組大鼠皮膚放置在4%的甲醛溶液固定48 h，取出后進(jìn)行脫水，石蠟包埋，切片，進(jìn)行HE 染色。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料的表達(dá)方式為（±s），兩組間比較采用 t 檢驗(yàn),多組間比較采用F 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠血清中IL-1 的表達(dá)

在第 3、7、10 天，T+S 組的 IL-1 的濃度低于 C 組和 S 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 4 組大鼠血清 IL-1 含量比較[（±s），pg/mL]

表1 4 組大鼠血清 IL-1 含量比較[（±s），pg/mL]

注：與 C 組比較，aP＜0.05；與 T 組比較，bP＜0.05；與 S 組比較，cP＜0.05

組別 第3 天 第7 天 第10 天C 組(n=4)T 組(n=4)S 組(n=4)T+S 組(n=4)F 值P 值132.67±9.56 132.81±13.45 140.43±11.65（104.56±16.63）abc 5.831 0.011 150.51±9.11（130.10±10.24）a 137.91±13.78（114.15±8.70）ac 8.162 0.003 156.75±4.71（128.91±9.11）a（145.56±14.28）b 114.90±6.07）ac 15.656<0.001

2.2 大鼠血清中IL-10 的表達(dá)

在第 7、10 天，T+S 組的 IL-10 的濃度高于 C 組和 T 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 4 組大鼠血清中 IL-10 含量比較[（±s），pg/mL]

表2 4 組大鼠血清中 IL-10 含量比較[（±s），pg/mL]

注：與 C 組比較，aP＜0.05；與 T 組比較，bP＜0.05；與 S 組比較，cP＜0.05

組別 第3 天 第7 天 第10 天C 組(n=4)T 組(n=4)S 組(n=4)T+S 組(n=4)F 值P 值151.73±10.05 154.23±16.57 160.50±9.73 167.11±12.56 1.208 0.349 112.07±10.15 114.27±10.25 112.55±7.40（142.35±10.94）abc 9.063 0.002 154.90±5.39（126.73±13.79）a（162.71±10.25）b（176.70±7.08）ab 18.938<0.001

2.3 大鼠組織中GM-CSF 的表達(dá)

在第 3 天，C 組的 GM-CSF/BCA 的比值低于其他組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 4 組大鼠組織中 GM-CSF/BCA 比值比較（±s）

表3 4 組大鼠組織中 GM-CSF/BCA 比值比較（±s）

注：與 C 組比較，aP＜0.05；與 T 組比較，bP＜0.05；與 S 組比較，cP＜0.05

組別 第3 天 第7 天 第10 天C 組(n=4)T 組(n=4)S 組(n=4)T+S 組(n=4)F 值P 值16.98±0.56（19.09±0.50）a（18.79±0.49）a（18.19±0.61）ab 11.098 0.001 14.73±0.86（16.30±0.93）a（10.92±0.55）ab（13.40±0.75）abc 33.658<0.001 13.18±0.49（10.35±0.34）a（9.72±1.18）a（10.53±0.94）a 14.188<0.001

2.4 創(chuàng)面愈合時(shí)間、瘢痕面積

創(chuàng)面愈合后，C 組愈合時(shí)間高于其他組，T+S 組愈合時(shí)間低于其他組；C 組瘢痕面積大于其他組，T+S組瘢痕面積小于其他組（P＜0.05）。見表4。

表4 4 組SD 大鼠創(chuàng)面愈合所需時(shí)間、瘢痕面積比較（±s）

表4 4 組SD 大鼠創(chuàng)面愈合所需時(shí)間、瘢痕面積比較（±s）

注：與 C 組比較，aP＜0.05；與 T 組比較，bP＜0.05；與 S 組比較，cP＜0.05

組別 創(chuàng)面愈合時(shí)間(d) 瘢痕面積(mm2)C 組(n=4)T 組(n=4)S 組(n=4)T+S 組(n=4)F 值P 值17.05±0.58（15.25±0.96）a（14.75±0.96）a（13.05±0.58）abc 17.867<0.001 25.25±3.78（17.00±1.41）a（17.50±1.29）a（13.25±2.36）abc 17.277<0.001

2.5 HE 染色分析

在第3 天，與C 組相比，其他組成纖維細(xì)胞數(shù)量較多，炎癥細(xì)胞數(shù)量含量較少；在第7 天，各組均發(fā)現(xiàn)新生的毛細(xì)血管，并且T+S 組毛細(xì)血管的數(shù)量略高于其他組；在第10 天和創(chuàng)面愈合時(shí)，各組的成纖維細(xì)胞、 毛細(xì)血管和炎癥細(xì)胞數(shù)量未見明顯差異，見圖1。

3 討論

圖1 各組大鼠在不同時(shí)間段皮膚組織學(xué)的變化(HE 染色，200X)

創(chuàng)面愈合是一個(gè)復(fù)雜過程，包括止血、炎癥、增殖和重塑等階段[4]。在炎癥階段，炎癥細(xì)胞可以通過分泌生長因子和細(xì)胞因子參與創(chuàng)面愈合。GM-CSF 是一種多功能生長因子，若皮膚受到各種創(chuàng)傷時(shí)，GM-CSF的基因表達(dá)增強(qiáng)，參與到創(chuàng)面愈合的多個(gè)階段[5-6]。在重塑階段，成纖維細(xì)胞的數(shù)量會(huì)不斷的升高，在細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)下，膠原與細(xì)胞外基質(zhì)不斷翻轉(zhuǎn)，最終形成瘢痕組織。瘢痕組織的形成是創(chuàng)面愈合的生理病理過程，實(shí)驗(yàn)證實(shí)白介素對(duì)瘢痕組織及創(chuàng)面愈合會(huì)產(chǎn)生一定影響，其中IL-1 可促進(jìn)創(chuàng)面纖維化和瘢痕組織生成[7-8]。與 IL-1 不同，IL-10 是減少創(chuàng)面纖維化的重要因子[9]。酮咯酸氨丁三醇是一種非選擇性COX 非甾體抗炎藥，有實(shí)驗(yàn)證實(shí)[2]，給小鼠腹腔注射酮咯酸氨丁三醇可促進(jìn)切口愈合，這可能與GM-CSF 濃度升高有關(guān)。IL-10 作為一種抗炎因子，酮咯酸氨丁三醇可增加其釋放[10]。舒芬太尼是臨床上常用的阿片類鎮(zhèn)痛藥，最新研究發(fā)現(xiàn)舒芬太尼可促進(jìn)創(chuàng)面愈合，其促進(jìn)創(chuàng)面愈合的機(jī)制可能是因?yàn)槭娣姨釋?duì)IL-10 的影響與酮咯酸氨丁三醇相似，可促進(jìn)IL-10 的釋放，降低應(yīng)激反應(yīng)，從而促進(jìn)切口愈合[11-12]。

通過該實(shí)驗(yàn)可以看出，在第 3、7、10 天，T+S 組IL-1 的濃度 （104.56±16.63）pg/mL、（114.15±8.70）pg/mL、（114.90±6.07)pg/mL 低于 C 組 （132.67±9.56）pg/mL、 （150.51 ±9.11）pg/mL、 （156.75 ±4.71)pg/mL (P ＜0.05)，這表明酮咯酸氨丁三醇聯(lián)合舒芬太尼可以抑制IL-1 的表達(dá)。在第 7 天和第 10 天，T+S 組 IL-10 的濃度（142.35±10.94）pg/mL、（176.70±7.08）pg/mL 高于 C組（112.07±10.15）pg/mL、（154.90±5.39)pg/mL 和 T 組（114.27±10.25）pg/mL、（126.73±13.79）pg/mL(P＜0.05)，這表明聯(lián)合應(yīng)用兩種藥物可以促進(jìn)IL-10 的表達(dá)。在第 3 天，T 組 、S 組 及 T+S 組 、GM-CSF 值 （19.09±0.50）、（18.79±0.49）、（18.19±0.61)均高于 C 組(16.98±0.56)(P＜0.05)，這表明單獨(dú)使用或聯(lián)合使用酮咯酸氨丁三醇和舒芬太尼在第3 天左右GM-CSF 值到達(dá)高峰，C 組GM-CSF 值下降較為緩慢，這可能與C 組創(chuàng)面愈合時(shí)間有關(guān)。從愈合時(shí)間和瘢痕面積來看，T+S 組（13.05±0.58）d、（13.25±2.36)mm2優(yōu)于 C 組 （17.05±0.58）d、（25.25±3.78）d、T 組 (15.25±0.96）d、（17.00±1.41)）mm2和 S 組 (14.75±0.96）d、（17.50±1.29)mm2（P＜0.05)，這表明舒芬太尼聯(lián)合酮咯酸氨丁三醇的效果要優(yōu)于單獨(dú)使用，舒芬太尼聯(lián)合酮咯酸氨丁三醇可以減少創(chuàng)面愈合后瘢痕面積，縮短創(chuàng)面愈合時(shí)間，并且從HE 染色來看，舒芬太尼聯(lián)合酮咯酸氨丁三醇的組織學(xué)表現(xiàn)較好。這與張倩等學(xué)者[2]在研究中得出小鼠腹腔注射舒芬太尼和酮咯酸氨丁三醇，在第3、7 和10 天，與對(duì)照組[(0.191 4±0.002 3）、（0.173 7±0.001 2）、（0.082 9±0.002 6)相比 T+S 組[(0.384 4±0.018 2）、（0.343 3±0.002 1）、（0.104 0±0.009 8)]可提高 GMCSF 濃度(P＜0.05)，加快創(chuàng)面愈合這一結(jié)論相近，這充分體現(xiàn)了舒芬太尼聯(lián)合酮咯酸氨丁三醇用于術(shù)后鎮(zhèn)痛有利于術(shù)后創(chuàng)面的愈合。

綜上所述，舒芬太尼聯(lián)合酮咯酸氨丁三醇可以通過抑制IL-1 的表達(dá)、增強(qiáng)IL-10 和GM-CSF 的表達(dá)，使大鼠創(chuàng)面更快更好的愈合，減少了創(chuàng)面愈合后瘢痕面積。但是舒芬太尼和酮咯酸氨丁三醇聯(lián)合使用是否會(huì)相互影響、聯(lián)合應(yīng)用促進(jìn)傷口愈合的具體機(jī)制等問題目前仍不完全清楚，還需要不斷深入的進(jìn)行研究。